張 璐，劉辰鵬，王瑞琪，焦偉華，張小坡*

海綿共生木霉屬真菌綠木霉中1個新的倍半萜類化合物

張 璐1, 2，劉辰鵬1，王瑞琪1，焦偉華2，張小坡1*

1. 海南醫(yī)學院藥學院，海南 ?？?571199 2. 上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院 藥學部海洋藥物研究中心（癌基因及相關基因國家重點實驗室），上海 200127

研究海綿共生真菌綠木霉（CMB-TN16）的次級代謝產(chǎn)物及其腫瘤細胞毒活性。利用硅膠柱色譜、半制備液相色譜等現(xiàn)代色譜技術方法進行分離純化，結合核磁共振和質(zhì)譜等現(xiàn)代譜學手段鑒定化合物結構，同時通過體外MTT法測定化合物的腫瘤細胞毒活性。從海綿共生真菌綠木霉醋酸乙酯提取物中分離得到7個倍半萜類化合物，分別鑒定為二綠木霉烯醇H（1）、二綠木霉烯醇D（2）、二綠木霉烯醇G（3）、黏埽霉酸（4）、(＋)-氫化萜烯七脂酸（5）、(＋)-3--乙酰萜烯七脂酸A（6）和木聚酸D（7）?；衔?體外對人大細胞肺癌NCI-H460細胞、人骨髓瘤NCI-H929細胞及人結腸癌SW620細胞的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值分別為11.8、7.7和13.5 μmol/L?；衔?為新化合物，對以上3株腫瘤細胞具有一定的細胞毒活性。

海綿；綠木霉；倍半萜；抗腫瘤；細胞毒活性；二綠木霉烯醇H；(＋)-3--乙酰萜烯七脂酸

由于海洋微生物生存環(huán)境的特殊性，其生態(tài)系統(tǒng)的高壓、高鹽、低氧、低溫、無光照等特點，形成了有別于陸地微生物的獨特的新陳代謝途徑、生存繁殖方式、適應機制，造就了海洋微生物更為豐富多樣、結構新穎特殊且活性顯著的天然代謝產(chǎn)物[1-3]。近年來，海洋微生物來源的天然產(chǎn)物得到研究人員的廣泛關注，為先導化合物的發(fā)現(xiàn)和結構優(yōu)化、海洋創(chuàng)新藥物及海洋中藥的研究及開發(fā)等創(chuàng)造有利條件，海洋微生物來源天然產(chǎn)物已成為新藥研發(fā)先導化合物的重要寶庫和主要來源[4-6]。

海綿資源是研究共附生微生物的重要資源之一，越來越多的證據(jù)揭示海綿共附生微生物是其宿主中很多次級代謝產(chǎn)物的真正生產(chǎn)者，也成為當前國內(nèi)外海洋新藥開發(fā)的研究熱點[7-9]。課題組從中國南海的海綿sp.中獲得其1株木霉屬共生微生物綠木霉-CMB-TN16。文獻研究表明，海洋中的木霉屬真菌含有豐富的萜類、聚酮、肽類等，其中萜類是其特征性成分且具有細胞毒、抗病原菌、抗菌、殺蟲等多種生物活性而受到廣泛關注[10-11]。課題組前期腫瘤細胞毒活性篩選發(fā)現(xiàn)1株中國南海海綿共生菌綠木霉CMB-TN16醋酸提取物體外具有一定的腫瘤細胞毒活性，為了更深入地研究綠木霉CMB-TN16的特征性次級代謝產(chǎn)物，對其醋酸乙酯中潛在的抗腫瘤活性化學成分進行研究，并分離得到7個倍半萜類化合物（圖1），分別鑒定為二綠木霉烯醇H（divirensol H，1)、二綠木霉烯醇D（divirensol D，2）、二綠木霉烯醇G（divirensol G，3）、黏埽霉酸（gliocladic acid，4）、(＋)-氫化萜烯七脂酸（hydroheptelidic acid，5）、(＋)-3--乙酰萜烯七脂酸（3--acetylheptelidic acid A，6）和木聚酸D（xylaric acid D，7）。同時，對所得化合物進行了體外抗腫瘤細胞活性篩選，以期發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的化合物，為其后期的進一步研究提供基礎。

圖1 化合物1～7的結構

1 儀器與材料

1.1 儀器

Bruker-AVANCE600 NMR核磁共振儀（瑞士Bruker公司），賽默飛LTQ液質(zhì)離子阱質(zhì)譜儀液質(zhì)聯(lián)用儀（賽默飛公司），Chirascan CD圓二色譜儀（英國應用光物理公司），高效液相色譜用島津液相色譜LC-16系統(tǒng)，配置SPD-16檢測器和YMC柱（ODS，250 mm×2.5 mm，5 μm，日本島津公司），薄層色譜硅膠板GF254（青島海洋化工廠），Sephadex LH-20凝膠柱填料（Healthcare公司），柱色譜硅膠粉200～300目（青島海洋化工廠），所用試劑為分析純（西隴科學股份有限公司）或色譜純（天津康科德科技有限公司），DMEM和RPMI Medium 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶溶液、PBS均購自美國Gibco公司，人大細胞肺癌NCI-H460細胞、人骨髓瘤NCI-H929細胞及人結腸癌SW620細胞購自中國科學院細胞生物學研究所細胞庫。楝酰胺（批號64166）購自Med?ChemExpress 公司。

1.2 真菌來源與發(fā)酵

從中國南海海域的海綿sp.樣品中分離得到的菌株CMB-TN16，經(jīng)ITS測序鑒定為木霉屬真菌綠木霉。將菌株接種于PDA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min的搖床上培養(yǎng)7 d；然后切成1 cm×1 cm的小塊作為種子進行發(fā)酵，接種于10×1 L的大米培養(yǎng)基中，室溫靜置培養(yǎng)30 d。

2 提取與分離

在室溫下，用醋酸乙酯提取所得培養(yǎng)物，直到醋酸乙酯相變?yōu)闊o色或淺色。有機相通過濾紙濾過，蒸發(fā)干燥，得到粗提取物。粗提取物（7.2 g）經(jīng)正相硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇（100∶0～0∶100）為流動相梯度洗脫，得15個流份（Fr. A～O）。根據(jù)UPLC-MS分析所得流分中的化學成分，對可能含有特征性倍半萜成分的流分Fr. D和Fr. I開展進一步深入的分離純化。Fr. D（67.1 mg）經(jīng)半制備高效液相色譜，以57% 乙腈-水（3.0 mL/min）等度洗脫，得到化合物1（2.5 mg，R16.0 min）和3（8.8 mg，R＝23.0 min）。對Fr. I（1.78 g）進行反相固相色譜（GracePure C18-Max，從石油醚-醋酸乙酯-甲醇4∶5∶1開始梯度洗脫（梯度變化：甲醇含量為10%、20%、40%、60%、80%、100%）洗脫，得到10個亞組分Fr. I1～I10。Fr. I7（88.7 mg）經(jīng)半制備高效液相色譜46%乙腈-水等度洗脫（3.0 mL/min）分離純化得到化合物2（9.8 mg，R＝13.0 min）。Fr. I8（88.7 mg）經(jīng)半制備高效液相色譜48%乙腈-水等度洗脫（3.0 mL/min）分離純化，得到化合物4（4.4 mg，R＝24.0 min）、5（8.2 mg，R＝28.0 min）、6（1.6 mg，R＝30.0 min）和7（1.1 mg，R＝33.0 min）。

3 結構鑒定

表1 化合物1的1H-和13C-NMR數(shù)據(jù)(600/150 MHz, CD3OD)

Table 1 1H- and 13C-NMR data of compound 1 (600/150 MHz, CD3OD)

碳位δHδC碳位δHδC 1 167.31' 167.3 2 133.72' 133.7 34.32 (t, J = 8.4 Hz)56.73'4.28 (d, J = 12.0 Hz), 4.15 (d, J = 12.0 Hz)56.7 46.51 (d, J = 10.8 Hz)145.74'6.71 (d, J = 10.8 Hz)145.2 52.70 (d, J = 9.6 Hz)40.75'2.92 (m)40.8 62.58 (d, J = 11.4 Hz)58.66'2.14 (d, J = 11.4 Hz)52.8 7 72.37' 75.4 82.29 (d, J = 12.6 Hz), 1.43 (m)35.08'1.78 (m), 2.02 (d, J = 13.8 Hz)31.9 91.67 (m), 1.27 (m)20.99'1.64 (m), 1.26 (m)21.1 101.36 (m)46.810'1.38 (m)46.8 111.75 (m)28.611'1.75 (m)28.5 120.93 (d, J = 7.2 Hz)20.612'0.77 (d, J = 6.6 Hz)15.0 130.81 (d, J = 6.6 Hz)15.113'0.97 (d, J = 6.6 Hz)20.9 144.61 (d, J = 12.0 Hz), 4.41 (d, J = 12.0 Hz)75.414'4.47 (d, J = 9.6 Hz), 4.07 (d, J = 9.6 Hz)75.4 15 173.915' 173.9

化合物1的相對構型由偶合常數(shù)和NOESY譜判斷。在NOESY譜中，H-5與H-11，H-5與H-11存在相關，表明H-5/H-10和H-5′/H-10′構型；H2β-14與H2β-9/H-5存在NOESY相關，H2α-14′與H2β-9′/H-5′存在NOESY相關，結合偶合常數(shù)5,6= 11.4 Hz，5′,6′= 11.4 Hz，表明C-5/C-10、C-5′/C-10′為椅式構型與H-5/H-5′、H-6/H-6′、H-10/H-10′和H2-14/H2-14′軸向方向。考慮其生物合成途徑，化合物1與二綠木霉烯醇C具有一致的絕對構型。為了進一步確定其絕對構型，參考該類化合物的生物合成途徑以及在 B3LYP/6-31 G (d) 基組水平的計算ECD圖譜與化合物1的實驗圖譜一致（圖3），確定其絕對構型為5,6,7,10,5,6, 7,10-1。經(jīng)文獻檢索，確定該化合物為新化合物，命名為二綠木霉烯醇H（divirensol H）。

圖2 化合物1的關鍵1H-1H COSY和HMBC相關

圖3 化合物1的實測和計算ECD譜圖

4 活性測試

采用MTT法[14]，以楝酰胺為陽性對照藥，測定化合物1～7對NCI-H460、NCI-H929及SW620細胞的細胞毒活性。實驗結果（表2）表明，化合物1對以上3株腫瘤細胞均具有一定的細胞毒活性，其半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值分別為11.8、7.7、13.5 μmol/L；化合物2～7對以上3株腫瘤細胞毒活性較弱。

表2 化合物1～7對3株腫瘤細胞毒活性

Table2 Cytotoxic activities of compounds 1—7 against three tumor cell lines

化合物IC50/(μmol·L?1)NCI-H460NCI-H929SW620 111.8±1.7 7.7±0.213.5±0.6 2＞3220.2±0.9＞32 3＞32＞32＞32 420.9±0.118.2±0.6＞32 5＞32＞3220.9±0.3 619.6±0.8＞3222.2±0.3 7＞3221.2±1.118.4±0.8 楝酰胺 3.9±0.6 1.2±0.2 2.8±0.3

5 討論

海綿是已知生物中最復雜的生物共生體，是研究共附生微生物的重要資源之一。海綿來源真菌因其代謝途徑復雜，能夠產(chǎn)生結構新穎、活性強烈的代謝產(chǎn)物，這為藥物先導化合物提供了多種可能，成為當前國內(nèi)外研究的熱點。本研究從我國南海海綿共生菌株綠木霉CMB-TN16的發(fā)酵物中分離得到7個倍半萜類化合物（1～7），其中化合物1為新穎結構的倍半萜，且具有一定的腫瘤細胞毒活性，進一步豐富了海洋真菌木霉次級代謝產(chǎn)物結構的多樣性，并為抗腫瘤先導化合物的研究提供了參考和基礎數(shù)據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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A new sesquiterpenoid from, a marine sponge symbioticsp. fungus

ZHANG Lu1, 2, LIU Chen-peng1, WANG Rui-qi1, JIAO Wei-hua2, ZHANG Xiao-po1

1. School of Pharmaceutical Science, Hainan Medical University, Haikou 571199, China 2. State Key Laboratory of Oncogenes and Related Genes, Department of Pharmacy, Research Center for Marine Drugs, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200127, China

To study the secondary metabolites of a marine sponge symbiotic fungusCMB-TN16 and their antitumor cytotoxic activity.The compounds were isolated and purified from EtOAc extract of CMB-TN16 by modern chromatography techniques, such as silica gel column chromatography, and semi-preparative high performance liquid chromatography, and their chemical structures were identified by NMR and MS spectrometry. Meanwhile, the antitumor cytotoxic activity of these compounds was evaluated by MTT method.Seven sesquiterpenoids were isolated from the EtOAc extract of CMB-TN16, and identified as divirensol H (1), divirensol D (2), divirensol G (3), gliocladic acid (4), hydroheptelidic acid (5), 3--acetylheptelidic acid A (6) and xylaric acid D (7), respectively. The IC50values of compound 1 against NCI-H460, NCI-H929 and SW620 were 11.8, 7.7, and 13.5 μmol/L, respectively.Compound 1 is a new compound, and have exhibited moderate cytotoxic activities against three tumor cell lines.

marine sponge;; sesquiterpenoid; antitumor; cytotoxic activity; divirensol H; 3--acetylheptelidic acid A

R284.1

A

0253 - 2670(2023)18- 5840 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.002

2023-05-14

海南省科技重大專項（ZDKJ2021036）

張 璐，女，碩士研究生，主要從事天然藥物化學研究。Tel: (0898)66893826 E-mail: 714091691@qq.com

張小坡，男，教授，博士生導師，主要研究方向為天然藥物化學。Tel: (0898)66893826 E-mail: z_xp1412@163.com

[責任編輯 王文倩]