顏 紅，高司琪，駱慧婷，歐陽威，王旭易，李 爽

·藥劑與工藝·

透明質酸修飾的梔子苷傳遞體凝膠的制備及其對佐劑型關節(jié)炎藥效學評價

顏 紅1*，高司琪2*，駱慧婷3，歐陽威1，王旭易1，李 爽1

1. 湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208 2. 湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410006 3. 長沙市第四醫(yī)院，湖南 長沙 410006

制備透明質酸修飾的梔子苷傳遞體（hyaluronic acid modified geniposide transfersomes，HA-GTFs）凝膠，對其進行質量評價，并考察其治療大鼠佐劑型關節(jié)炎的療效。方法 采用逆向旋轉蒸法制備HA-GTFs，通過單因素與Box-Behnken設計-響應面法篩選處方及制備工藝，并比較了其與透明質酸修飾的梔子苷脂質體（hyaluronic acid modified geniposide lipsomes，HA-GLIPs）的變形性。在此基礎上，制備了HA-GTFs凝膠，考察了其黏度、穩(wěn)定性、體外釋放及體外透皮性能，并進行佐劑型關節(jié)炎的初步藥效學評價。透射電子顯微鏡下，HA-GTFs呈規(guī)則的球形，結構完整，分散均勻。HA-GTFs包封率為57.38%，平均粒徑為（117.53±0.83）nm，ζ電位為（?8.53±0.76）mV，且其變形性優(yōu)于HA-GLIPs。體外釋放試驗結果表明，普通梔子苷凝膠在12 h時釋放完全，HA-GLIPs凝膠與HA-GTFs凝膠表現(xiàn)出緩釋的效果，48 h累積釋放率分別為92%、89%。體外透皮試驗結果顯示，HA-GTFs凝膠在24 h內的累積透皮率高于HA-GLIPs凝膠與普通梔子苷凝膠，表明傳遞體凝膠具有良好的透皮性能。初步藥效學實驗顯示，與模型組相比，HA-GTFs凝膠組能減輕大鼠炎癥反應，病理切片未見大量炎癥細胞浸潤，且能降低血清炎癥因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）與白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平。其中HA-GTFs凝膠高劑量組的治療效果顯著優(yōu)于其他組。HA-GTFs凝膠的處方工藝簡單、穩(wěn)定，具有良好的緩釋與透皮性能，對佐劑型關節(jié)炎具有一定的治療效果。

梔子苷；透明質酸；傳遞體凝膠；Box-Behnken設計-響應面法；佐劑型關節(jié)炎；藥效學；逆向旋轉蒸法；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-6

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜炎癥為主要病理表現(xiàn)的慢性自身免疫性疾病，可導致關節(jié)腫脹疼痛、關節(jié)軟骨損傷甚至關節(jié)畸形[1-2]。西醫(yī)臨床治療[3]常以非甾體抗炎藥、抗風濕藥物等藥物多種聯(lián)用為主，短期內能顯著減輕關節(jié)炎癥和疼痛，長期服用容易產生藥物依賴性，可引發(fā)消化道損傷、肝腎功能異常等不良反應[4-5]。中醫(yī)治療RA常以內治口服與外治針刺療法、灸法、外敷法、穴位注射法、中藥熏蒸法等方法并用，具有直達疾病部位、起效快、不良反應小等特點。梔子苷是茜草科梔子屬植物梔子Ellis中提取分離純化得到的一種環(huán)烯醚萜類活性成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗抑郁、保肝利膽等藥理活性[6-7]。梔子苷在治療RA的抗炎免疫藥效物質基礎和分子機制研究中取得一定的成果[8]。但由于梔子苷水溶性強、口服利用度低、無法避免肝臟首過效應等原因，限制了其應用。透明質酸是機體關節(jié)軟骨及滑液的主要組成部分[9]，在人體關節(jié)滑液中質量濃度高達1.400～3.600 mg/mL，具有較好的生物相容性[10]。此外，透明質酸可與關節(jié)軟骨細胞特異性CD44受體結合，介導細胞-基質間的相互作用，并激活細胞內信號轉導通路而發(fā)揮作用，靶向至關節(jié)炎滑膜區(qū)[11-12]。

傳遞體作為一種新型脂質體，不僅具備傳統(tǒng)脂質體生物相容性好、毒性小等優(yōu)勢，同時因表面活性劑的加入具備良好的變形性，能通過比自身小數(shù)倍的孔道，是經(jīng)皮給藥制劑的理想載體之一[13-14]。傳遞體流動性強，難以滯留在皮膚表面，將傳遞體與凝膠相結合制備成傳遞體凝膠劑，利用凝膠生物黏附性強的優(yōu)點，可直接涂抹于患處，能更好地實現(xiàn)經(jīng)皮給藥，同時可提高藥物的滯留時間，發(fā)揮緩釋作用、降低刺激性[15-16]。本研究選擇抗炎療效確切的梔子苷及兼具臨床療效和靶向作用的透明質酸為模型藥物，以傳遞體為載體，制備共載藥傳遞體凝膠，對其進行質量評價，測定其pH值、黏度并考察了其初步穩(wěn)定性、體外滲透與透皮性能，在此基礎上，以佐劑型大鼠RA為模型來評價透明質酸修飾的梔子苷傳遞體（hyaluronic acid modified geniposide transfersomes，HA-GTFs）凝膠的初步藥效學，為開發(fā)一種治療關節(jié)炎的新型中藥經(jīng)皮制劑提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；Scientz-Ⅱ D型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；Zetasizer Nano-ZS90型激光粒度分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；HT-7800型透射電鏡，日立科學儀器（北京）有限公司；NDJ-5S型旋轉黏度計，上海魅宇儀器科技有限公司；Synergy HTX型多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司。

1.2 材料

大豆卵磷脂、膽固醇，艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司；二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-透明質酸（DSPE-PEG-HA），批號RS0210810，西安瑞禧科技有限公司；梔子苷原料藥，質量分數(shù)≥96%，批號BLT20210307，西安博聯(lián)特化工有限公司；梔子苷對照品，質量分數(shù)≥98%，批號110749-201919，中國食品藥品檢定研究院；完全弗式佐劑，美國Sigma公司；膽酸鈉、卡波姆940，上海麥克林生化科技有限公司；丙三醇、三乙醇胺、氯仿均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純，美國斯百全公司；羥丙基甲基纖維素（HPMC），天津市光復精細化工研究所；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 動物

雄性SD大鼠，SPF級，180～220 g，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0009，動物實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準，所有動物實驗遵循湖南中醫(yī)藥大學有關實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結果

2.1 HA-GTFs和透明質酸修飾的梔子苷脂質體（hyaluronic acid modified geniposide lipsomes，HA-GLIPs）的制備

2.1.1 HA-GTFs 根據(jù)預實驗制備方法的篩選結果，采用逆向旋轉蒸發(fā)法[17]制備HA-GTFs。精密稱定處方量大豆卵磷脂與膽固醇，以氯仿溶解，作為油相；另精密稱定處方量膽酸鈉、梔子苷與DSPE-PEG-HA，以磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）溶解，作為水相。將油相與水相混合，探頭超聲15 s形成W/O型乳劑，于40 ℃下減壓旋蒸除去氯仿。加入PBS（pH 7.2）于40 ℃下水化，探頭超聲，過0.22 μm微孔濾膜，即得HA-GTFs。

2.1.2 空白傳遞體 除不加梔子苷與DSPE-PEG-HA外，其余操作同HA-GTFs的制備，制得空白傳遞體。

2.1.3 HA-GLIPs 除不加膽酸鈉外，其余制備過程同HA-GTFs。

2.2 梔子苷含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 Hypersil Gold a Q C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相為乙腈-水（15∶85）；檢測波長238 nm；體積流量為1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量20 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取梔子苷對照品10 mg，以甲醇稀釋定容至10 mL，即得1 mg/mL的梔子苷對照品母液，吸取3 mL母液，以甲醇稀釋定容至100 mL，即得含梔子苷30 μg/mL的對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 稱取HA-GTFs 1 g，以甲醇定容到10 mL，放置24 h，超聲1 h，過0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 稱取空白傳遞體1 g，以甲醇定容到10 mL，放置24 h，超聲1 h，過0.45 μm微孔濾膜，即得陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性試驗 分別精密吸取梔子苷對照品溶液、供試品溶液以及陰性對照溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分析測定，結果見圖1。HA-GTFs中其他輔料對梔子苷的含量測定無干擾，方法專屬性好。

圖1 梔子苷對照品(A)、HA-GTFs樣品(B)和空白傳遞體樣品(C)的HPLC圖

2.2.6 線性關系的考察 分別精密移取上述對照品溶液一定體積，以甲醇為稀釋液，配成質量濃度分別為10、20、40、60、80、100、120 μg/mL的對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件分析測定。以梔子苷對照品質量濃度值為橫坐標（），峰面積積分值為縱坐標（），進行線性回歸分析。得到線性回歸方程＝19.179－28.409，＝0.999 7，結果表明梔子苷在10～120 μg/mL線性關系良好。

2.2.7 精密度試驗 精密吸取梔子苷對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。測得梔子苷峰面積的RSD為0.72%，表明該儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，分別于1、2、4、8、12、24 h進樣檢測。結果顯示，梔子苷峰面積的RSD為0.76%，表明24 h內供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復性試驗 精密吸取同一批次HA-GTFs，平行6份，制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行分析，計算梔子苷的平均含量與RSD值。結果梔子苷質量濃度的RSD為1.24%，表明該測定方法的重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 吸取1 mL空白傳遞體9份，分為3組，分別加入適量梔子苷對照品溶液，以甲醇定容，配成高、中、低（120、60、10 μg/mL）質量濃度的溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行檢測。結果顯示梔子苷的平均加樣回收率為100.15%，RSD為1.76%。

2.3 HA-GTFs包封率的測定

精密移取HA-GTFs溶液1 mL于透析袋中，以50 mL水為透析介質，于25 ℃、300 r/min下，平衡透析75 min，取袋外透析液加甲醇定容，過膜，按“2.2.1”項下色譜條件檢測游離梔子苷含量（1）；另精密移取HA-GTFs 1 mL加甲醇破乳定容到25 mL，放置24 h，超聲1 h，過膜，按“2.2.1”項下色譜條件檢測其中梔子苷的總量（2）；按照公式計算HA-GTFs的包封率。

包封率＝(2－1)/2

2.4 單因素考察HA-GTFs的處方工藝

2.4.1 表面活性劑膽酸鈉與磷脂的質量比（表脂比）考察 固定其他因素：藥物與磷脂的質量比（藥脂比）為1∶6，膽固醇與磷脂的質量比（膽脂比）為1∶8，PBS與氯仿體積比為2∶9，水化體積6 mL，以氯仿作為有機溶劑，DSPE-PEG-HA與磷脂的質量比為1∶20，按“2.1”項下方法制備HA-GTFs傳遞體，考察表脂比（1∶3、1∶6、1∶9、1∶12、1∶15）對HA-GTFs處方工藝的影響，測定其平均粒徑、多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）、ζ電位與包封率，結果見表1。不同水平的表脂比對HA-GTFs的平均粒徑、PDI、ζ電位影響不大，表脂比1∶6的樣品包封率略高于其他比例的樣品，因此，選擇表脂比為1∶6。

2.4.2 藥脂比考察 固定其他因素：表脂比為1∶6，膽脂比為1∶8，PBS與氯仿體積比為2∶9，水化體積6 mL，以氯仿作為有機溶劑，DSPE-PEG-HA與磷脂的質量比為1∶20，按“2.1”項下方法制備HA-GTFs，考察藥脂比（1∶6、1∶9、1∶12、1∶15、1∶18）對HA-GTFs處方工藝的影響，測定其平均粒徑、PDI、ζ電位與包封率，結果見表2。不同水平的藥脂比對HA-GTFs平均粒徑、PDI、ζ電位影響不大，同時考慮到藥物投入量太低會導致載藥量過低，因此，選擇藥脂比為1∶12。

2.4.3 膽脂比考察 固定其他因素：表脂比為1∶6，藥脂比為1∶12，PBS與氯仿體積比為2∶9，水化體積6 mL，以氯仿作為有機溶劑，DSPE-PEG-HA與磷脂的質量比為1∶20，按“2.1”項下方法制備HA-GTFs，考察膽脂比（1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10）對HA-GTFs處方工藝的影響，測定其平均粒徑、PDI、ζ電位與包封率，結果見表3。不同水平的膽脂比對HA-GTFs平均粒徑、PDI、ζ電位影響不大，根據(jù)包封率的結果選擇膽脂比為1∶4來制備HA-GTFs。

2.4.4 PBS與氯仿用量比考察 固定其他因素：表脂比為1∶6，藥脂比為1∶12，膽脂比為1∶4，水化體積6 mL，以氯仿作為有機溶劑，DSPE-PEG-HA與磷脂的質量比為1∶20，按“2.1”項下方法制備HA-GTFs，考察PBS與氯仿體積比（1∶4.5、1.5∶6.75、2∶9、2.5∶11.25、3∶13.5）對HA-GTFs處方工藝的影響，測定其平均粒徑、PDI、ζ電位與包封率，結果見表4。因為PBS與氯仿體積比對HA-GTFs平均粒徑、PDI、ζ電位影響不大，根據(jù)包封率的結果選擇PBS與氯仿用量比為2.5∶11.25來制備HA-GTFs。

表1 表脂比考察結果(, n = 3)

表2 藥脂比考察結果(, n = 3)

表3 膽脂比考察結果(, n = 3)

2.4.5 水化體積考察 固定其他因素：藥脂比為1∶12，膽脂比為1∶4，PBS與氯仿體積比為2∶9，以氯仿作為有機溶劑，DSPE-PEG-HA與磷脂的質量比為1∶20，按“2.1”項下方法制備HA-GTFs，考察水化體積（3、4、5、6、7 mL）對HA-GTFs處方工藝的影響，測定其平均粒徑、PDI、ζ電位與包封率，結果見表5。因為不同水化體積對HA-GTFs平均粒徑、PDI、ζ電位影響不大，根據(jù)包封率的結果選擇來水化體積5 mL制備HA-GTFs。

表4 PBS與氯仿體積比考察結果(, n = 3)

表5 水化體積考察結果(, n = 3)

2.4.6 油相溶劑種類考察 固定其他因素：藥脂比為1∶12，膽脂比為1∶4，PBS與氯仿體積比為2∶9，水化體積6 mL，DSPE-PEG-HA與磷脂的質量比為1∶20，按“2.1”項下方法制備HA-GTFs，考察油相有機溶劑種類（氯仿、氯仿-乙醚1∶1、氯仿-乙醚2∶1、氯仿-乙醚4∶1）對HA-GTFs處方工藝的影響，測定其平均粒徑、PDI、ζ電位與包封率，結果見表6。因為油相溶劑種類對HA-GTFs平均粒徑、PDI、ζ電位影響不大，根據(jù)包封率的結果選擇氯仿來制備HA-GTFs。

2.4.7 DSPE-PEG-HA與磷脂的質量比考察 固定其他因素：藥脂比為1∶12，膽脂比為1∶4，PBS與氯仿體積比為2∶9，水化體積6 mL，以氯仿作為有機溶劑，按“2.1”項下方法制備HA-GTFs，考察DSPE-PEG-HA與磷脂的質量比（1∶10、1∶20、1∶30）對HA-GTFs處方工藝的影響，測定其平均粒徑、PDI、ζ電位與包封率，結果見表7。因為DSPE-PEG-HA的加入量對HA-GTFs平均粒徑、PDI、ζ電位影響不大，根據(jù)包封率的結果選擇DSPE-PEG-HA與磷脂的質量比為1∶20來制備HA-GTFs。

表6 油相溶劑種類考察結果(, n = 3)

表7 DSPE-PEG-HA與磷脂的質量比考察結果(, n = 3)

2.5 Box-behnken設計-響應面法（Box-Behnken design-response surface method，BBD-RSM）優(yōu)化HA-GTFs的處方工藝

結合文獻及前期單因素考察結果，選擇對HA-GTFs處方工藝影響較大的膽脂比（1）、藥脂比（2）、表脂比（3）3個因素為考察對象，以包封率（1）與載藥量（2）的綜合評分（）作為評價指標進行實驗，1與2的權重系數(shù)分別設為0.6與0.4，＝0.6×1/1max＋0.4×2/2max。響應面試驗設計與結果見表8。采用Design-Expert 10軟件對試驗結果進行處理，并對響應面的結果進行驗證。

采用Design-Expert V10.0軟件以綜合評分對1、2、3進行二次項式回歸方程擬合。得到二次多項式回歸方程為＝94.25－1.611－3.182－2.203－1.0912－0.5813－0.4823－3.7212－14.5322－7.0232。方差分析見表9，結果表明，回歸模型＜0.000 1，失擬項水平不顯著（＞0.05），說明模型擬合良好。1、2、3對均具有顯著影響（＜0.05），各因素之間交互作用不顯著（12、13、23的均＞0.05）。

表8 HA-GTFs處方工藝Box-behnken試驗設計與結果

Table8 Box-behnken trial design and results of HA-GTFs formulation process

試驗號X1X2X3Y1/%Y2/%Y/%試驗號X1X2X3Y1/%Y2/%Y/% 16∶1 (+1)16∶1 (+1)6∶1 (0)40.510.785 070.36104∶112∶18∶133.391.090 974.27 24∶1 (0)16∶18∶1 (+1)34.590.823 365.69116∶112∶16∶140.860.973 977.65 32∶1 (?1)16∶16∶145.930.801 376.53124∶112∶14∶146.860.836 478.77 46∶114∶1 (0)8∶143.850.955 680.05134∶114∶16∶157.680.998 695.82 52∶114∶14∶1 (?1)51.100.910 185.82144∶114∶16∶156.380.967 593.35 64∶116∶14∶143.210.756 872.11154∶114∶16∶157.160.974 194.39 76∶114∶14∶153.570.805 784.54164∶114∶16∶156.220.943 292.30 82∶114∶18∶152.920.799 683.64174∶114∶16∶158.450.965 395.39 92∶112∶1 (?1)6∶147.840.828 179.47

以為評價指標對交互因素的響應面3D效果圖見圖2。在保證與擬合度均最高的前提下，經(jīng)軟件篩選最終確定了HA-GTFs最優(yōu)處方參數(shù)：膽脂比1∶3.6，藥脂比1∶13.8，表脂比1∶5.7。

按上述優(yōu)化處方，采用逆向旋轉蒸發(fā)法制備HA-GTFs，將大豆卵磷脂與膽固醇（膽脂比1∶3.6），以氯仿溶解，作為油相；另精密稱定處方量的膽酸鈉、梔子苷與DSPE-PEG-HA（藥脂比1∶13.8，表脂比1∶5.7，導脂比1∶20），以PBS溶解，作為水相。將油相與水相混合，探頭超聲15 s形成均勻不分層的乳白色W/O型乳劑，于40 ℃下減壓旋蒸除去氯仿。加入PBS，于40 ℃，550 r/min下水化30 min，超聲3 min，待冷卻至室溫，過0.22 μm微孔濾膜，4 ℃密封保存。驗證實驗結果見表10，結果測得值為94.26（＝3）與預測值（＝95.25）較為接近，相對偏差低于3%，說明Box-Behnken響應面預測結果可靠。

表9 方差分析結果

Table 9 Results of variance analysis

方差來源平方和自由度均方F值P值顯著性方差來源平方和自由度均方F值P值顯著性 模型1 393.769154.8672.23＜0.000 1極顯著X1258.35158.3527.210.001 2顯著 X120.67120.679.640.017 2顯著X22888.321888.32414.31＜0.000 1極顯著 X281.09181.0937.820.000 5極顯著X32207.201207.2096.64＜0.000 1極顯著 X338.68138.6818.040.003 8顯著殘差15.0172.14 X1X24.7314.732.210.181 0 失項6.6132.201.050.462 2不顯著 X1X31.3311.330.620.456 1 凈誤差8.4042.10 X2X30.9210.920.430.533 0 總離差1 408.7716

圖2 各因素間交互作用的響應面圖

2.6 HA-GTFs的理化性質研究

2.6.1 形態(tài)觀察 制備的HA-GTFs產品外觀澄清透明，帶有淡藍色乳光。取適量HA-GTFs溶液滴于銅網(wǎng)上，在37 ℃烘箱中放置24 h揮干溶液，在透射電子顯微鏡下觀察其形狀，可見HA-GTFs呈圓球形或類圓形，外觀完整，無明顯變形與成團凝聚現(xiàn)象，分散均勻，結果見圖3。

2.6.2 粒徑、PDI及ζ電位的測定 采用馬爾文激光粒徑測定儀對HA-GTFs進行粒徑、PDI、ζ電位測定，結果見圖4。測得HA-GTFs平均粒徑為（117.53±0.83）nm，PDI為0.314±0.021，ζ電位為（?8.53±0.76）mV。

表10 驗證結果

Table 10 Verification results

試驗號包封率/%載藥量/%Y/%RSD/% 實際值預測值 157.090.962 593.8995.251.04 256.270.953 792.73 358.790.985 796.15

圖3 HA-GTFs的外觀(A)與TEM圖(B)

圖4 HA-GTFs粒徑分布(A)及ζ電位(B)

2.6.3 變形性測定[18]使用橫截面積為1 cm2的注射器，并在上方以水的重力制造0.3 MPa壓強，在規(guī)定時間1 min內收集液體，測定HA-GTFs與HA-GLIPs通過膜（220 nm）的體積，每個樣品平行測定3次，按公式計算變形性指數(shù)（）及其RSD值。測得HA-GTFs的值為1.86±0.03，HA-GLIPs的值為1.45±0.02，由此可知HA-GTFs的變形性優(yōu)于HA-GLIPs。

＝×(r/r)2

為變形性指數(shù)，為單位時間內傳遞體的擠出體積（mL），r為HA-GTFs或HA-GLIPs過膜擠出后的粒徑（nm），r為微孔濾膜的孔徑（nm）

2.7 HA-GTFs凝膠、透明質酸修飾的梔子苷脂質體（hyaluronic acid modified geniposide liposomes，HA-GLIPs）凝膠和普通梔子苷凝膠的制備

2.7.1 HA-GTFs凝膠的制備

（1）HA-GTFs的制備：按“2.5”項下優(yōu)選的處方及工藝制備HA-GTFs。

（2）HA-GTFs凝膠的制備：稱取5 g甘油加入適量蒸餾水中，攪拌均勻，另稱取2 g卡波姆940加入甘油水溶液中，放置24 h過夜溶脹，再加蒸餾水至100 g，以三乙醇胺調節(jié)pH值為6.5～7.5，得空白凝膠基質。將空白凝膠基質與HA-GTFs溶液等質量比渦旋混合均勻，即得HA-GTFs凝膠。

2.7.2 HA-GLIPs凝膠的制備

（1）HA-GLIPs的制備：除不加表面活性劑膽酸鈉外，其余制備過程同HA-GTFs的制備。

（2）HA-GLIPs凝膠的制備：將空白凝膠基質與HA-GLIPs溶液等質量比渦旋混合均勻，即得HA-GLIPs凝膠。

2.7.3 普通梔子苷凝膠的制備

（1）梔子苷溶液的配制：精密稱定處方量梔子苷于5 mL棕色量瓶中，加pH 7.2的PBS溶解至刻度，超聲5 min，得梔子苷溶液。

（2）普通梔子苷凝膠的制備：將空白凝膠基質與梔子苷溶液等質量比渦旋混合均勻，即得普通梔子苷凝膠。

2.7.4 凝膠基質種類的篩選 以卡波姆940、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）和羥丙基甲基纖維素（HPMC）作為基質，考察基質種類對傳遞體凝膠的影響。分別配制卡波姆940、CMC-Na與HPMC水溶液，加入5%甘油，攪拌均勻，放置過夜使其充分溶脹。其中，卡波姆940水溶液以三乙醇胺調pH至6.5～7.5。將凝膠基質與傳遞體溶液以質量比1∶1混合，攪拌均勻，以外觀性狀、黏性、涂展性等為指標，篩選基質種類。結果顯示CMC-Na基質制備的凝膠成型性差、流動性較大、涂抹不勻；HPMC制備的凝膠流動性大、質地較??；卡波姆940制備的凝膠涂展性好，呈現(xiàn)凝膠狀。故選用卡波姆940為凝膠基質進行后續(xù)實驗。

2.7.5 凝膠基質濃度的篩選 以卡波姆940作為凝膠基質，分別配制不同濃度的卡波姆940水溶液，加入5%甘油，攪拌均勻，放置過夜使其充分溶脹，將凝膠基質與傳遞體溶液以質量比1∶1混合，攪拌均勻，以外觀性狀、黏性、涂展性、離心穩(wěn)定性為指標，篩選基質濃度。結果顯示，1%卡波姆940成型性不好，流動性大，涂抹不勻。當基質的濃度越高，所制得的凝膠越稠，2%卡波姆940制備的凝膠各項參數(shù)良好，符合凝膠制劑要求，故進行下一步篩選。

2.7.6 傳遞體與基質混合比例的篩選 以2%卡波姆940作為基質，考察傳遞體與凝膠基質不同混合比例來制備傳遞體凝膠，凝膠基質與傳遞體溶液分別按質量混合比1∶1、1∶1.5、1∶2混合，攪拌均勻，以外觀性狀、黏性、涂展性、離心穩(wěn)定性為指標，篩選最佳混合比例。結果顯示，基質與傳遞體溶液的質量混合比例為1∶1時，外觀形狀良好，具有一定的流動性，符合凝膠制劑要求。

2.7.7 最佳工藝確定及實驗驗證 按上述優(yōu)化處方，制備了HA-GTFs凝膠，將凝膠基質與傳遞體溶液以質量比1∶1混合，攪拌均勻，即得。所制得的凝膠外觀形狀良好，具有一定的流動性，符合凝膠制劑要求。

2.8 HA-GTFs凝膠的質量評價

2.8.1 外觀性狀 本品為外觀澄清，均勻細膩，帶有淡藍色乳光的半固體凝膠。稱取HA-GTFs凝膠1 g，加10 mL蒸餾水，超聲，使其溶解并分散均勻，采用pH計測定pH值為6.98±0.12，符合經(jīng)皮外用制劑的要求。

2.8.2 黏度測試 采用NDJ-5S旋轉黏度計進行測定，測得HA-GTFs凝膠黏度在23～25 Pa·s。

2.8.3 初步穩(wěn)定性考察 取3批HA-GTFs凝膠樣品適量，置于西林瓶中密封避光保存，分別于4 ℃、室溫、40 ℃條件下放置，在第0、15、30、45、60、90天分別取樣，以外觀性狀、黏度及梔子苷相對含量（相對含量＝測得的梔子苷含量/加入的梔子苷含量）為指標，觀察同條件下各參數(shù)的變化，評價溫度對產品穩(wěn)定性的影響，結果見表11。HA-GTFs凝膠在低溫4 ℃下儲存外觀、黏度及梔子苷含量的變化較小，表明其在該溫度下狀態(tài)穩(wěn)定，因此，應在低溫4 ℃儲存HA-GTFs凝膠。

2.8.4 體外釋放實驗 采用透析袋法測定體外釋放度[19]，比較普通梔子苷凝膠、HA-GLIPs凝膠與HA-GTFs凝膠的體外釋放性能。精密稱取1 g凝膠于透析袋中，以50 mL生理鹽水作為釋放介質，于32 ℃、100 r/min條件下透析，分別于0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、24.0、36.0、48.0、72.0 h取透析介質1 mL，同時補充同體積等溫的透析介質，按“2.2.1”項下色譜條件檢測，考察各時間點梔子苷累積釋放情況，結果見圖5。結果顯示，普通梔子苷凝膠在12.0 h時釋放完全，累積釋放率達到98%，之后趨于穩(wěn)定。HA-GLIPs凝膠與HA-GTFs凝膠在前2.0 h釋放較快，由未包封的梔子苷釋放所引起，之后釋放速度開始減慢，表現(xiàn)出緩釋的效果，在48 h后幾乎釋放完全，累積釋放率分別達到92%、89%。分別應用零級方程、一級方程、Higuchi方程進行擬合，結果見表12。3種制劑的體外釋放規(guī)律均符合Higuchi方程，與普通梔子苷凝膠、HA-GLIPs凝膠相比，HA-GTFs凝膠具有更好的緩釋能力，更有利于形成藥物釋放儲庫。

表11 HA-GTFs凝膠穩(wěn)定性參數(shù)的測定

Table 11 Determination of stability parameter of HA-GTFs gels

t/d外觀黏度/(Pa?s)梔子苷相對含量/% 4 ℃室溫40 ℃4 ℃室溫40 ℃4 ℃室溫40 ℃ 0澄清，有淡藍色乳光澄清，有淡藍色乳光澄清，有淡藍色乳光23.7724.4023.85100.00100.00100.00 15澄清，有淡藍色乳光澄清，有淡藍色乳光澄清，有淡藍色乳光22.8322.8920.3699.7897.3092.57 30澄清，有淡藍色乳光澄清，有淡藍色乳光顏色變深22.1419.6518.7498.3694.6584.62 45澄清，有淡藍色乳光澄清，有淡藍色乳光顏色變深21.4518.2315.8896.4791.3877.49 60澄清，有淡藍色乳光澄清，有淡藍色乳光顏色變深20.8617.1113.5994.3288.6368.35 90澄清，有淡藍色乳光澄清，有淡藍色乳光顏色變深20.4215.6510.4792.1886.7251.68

圖5 3種制劑的體外釋放曲線(, n = 3)

表12 3種制劑的體外釋放曲線的擬合方程

Table 12 Fitting equations of invitro release curve equation of three preparations

樣品零級方程一級方程Higuchi方程 普通梔子苷凝膠Q＝0.056 5 t＋0.403 8，R2＝0.920 4ln(1－Q)＝?0.321 8 t－0.107 7，R2＝0.971 2Q＝0.245 8 t1/2＋0.187 6，R2＝0.978 3 HA-GLIPs凝膠Q＝0.034 7 t＋0.309 3，R2＝0.946 3ln(1－Q)＝?0.072 8 t－0.336 4，R2＝0.978 3Q＝0.149 3 t1/2＋0.180 1，R2＝0.981 2 HA-GTFs凝膠Q＝0.034 2 t＋0.305 3，R2＝0.936 4ln(1－Q)＝?0.070 6 t－0.332 3，R2＝0.965 6Q＝0.146 9 t1/2＋0.178 1，R2＝0.971 6

2.8.5 大鼠離體皮膚透皮實驗[20]取雄性SD大鼠，對其腹部脫毛后處死，剪下腹部皮膚，除去皮下脂肪和組織，用生理鹽水洗凈，濾紙擦干表面水分，鋁箔紙包裹，置于?20 ℃冰箱中冷凍保存，備用。使用改良的Franz擴散池（表面積約1.76 cm2，體積約6.5 mL）考察體外透皮性能，將大鼠離體皮膚固定在Franz擴散池中，角質層朝上，以生理鹽水作為透皮接收液，排盡皮膚下氣泡，向供藥池內分別加入0.2 g HA-GTFs凝膠、HA-GLIPs凝膠與普通梔子苷凝膠，保持（32±1）℃恒溫，分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h時吸取所有透皮接收液，同時補加等量等溫且已超聲脫氣處理的生理鹽水。各時間段的接收液分別經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，按“2.2.1”項下色譜條件檢測，根據(jù)下式計算單位面積累積透皮量（Q）、累積滲透率（）。從擴散池上將皮膚取下，剪去有效透皮面積，以生理鹽水洗凈，加5 mL生理鹽水勻漿，加等量甲醇超聲30 min，12 000 r/min離心（離心半徑8.95 cm）15 min后取上清液，過膜，采用HPLC法測定梔子苷含量，計算藥物滯留量。

＝QA/

Q表示時間內單位面積累積透皮量（μg/cm2），表示樣品中梔子苷的含量（μg），C表示第個時間點的樣品質量濃度（μg/mL），表示有效透皮面積（cm2），表示每次采樣的體積（mL）

以單位面積累積透皮量Q為縱坐標，時間為橫坐標進行線性回歸，所得斜率即為透皮速率［s，μg/(cm2·h)］。

由表13和圖6可知HA-GTFs凝膠、HA-GLIPs凝膠與普通梔子苷凝膠24 h單位面積的累積透皮量分別為（39.31±0.53）、（28.07±0.62）、（23.66±0.74）μg/cm2，24 h累積透皮率分別為70.29%、53.41%、44.61%，透皮速率（s）分別為4.987 1、3.562 9、3.118 1 μg/(cm2?h)，皮膚滯留量分別為13.12、9.37、5.26 μg。

結果表明HA-GTFs凝膠的累積透皮量、累積透皮率、透皮速率與皮膚滯留量在3種梔子苷制劑中均為最優(yōu)，其次是HA-GLIPs凝膠，說明傳遞體凝膠透皮能力優(yōu)于脂質體凝膠與普通凝膠，能使藥物在皮膚形成藥物儲庫。

表13 3種制劑經(jīng)皮滲透參數(shù)的對比(, n = 3)

圖6 3種制劑的體外透皮曲線(, n = 3)

2.9 對RA的初步藥效學評價

2.9.1 大鼠佐劑型關節(jié)炎造模及分組 將42只SD大鼠隨機分為7組，即對照組、模型組、陽性藥物組（雷公藤多苷片混懸液ig組）和HA-GTFs低、中、高劑量組及普通梔子苷凝膠中劑量組。以完全弗式佐劑作為造模劑，除對照組外其余組均于每鼠右后足趾sc 0.1 mL完全弗式佐劑致炎，對照組于每鼠右后足趾sc等量生理鹽水。

2.9.2 給藥 造模成功第10天開始給藥，每日給藥1次，連續(xù)給藥21 d。在給藥前，對大鼠膝關節(jié)及膝以下進行剃毛。陽性藥物組以雷公藤多苷片混懸液ig，給藥劑量為5 mg/(kg?d)；HA-GTFs凝膠低、中、高劑量組均涂抹給藥，給藥劑量分別為11.875、23.750、47.500 mg/(kg?d)；普通梔子苷凝膠中劑量組涂抹給藥，給藥劑量為23.750 mg/(kg?d)；對照組與模型組分別涂抹等量的空白凝膠基質。

2.9.3 關節(jié)炎指數(shù) 每隔3 d采用大鼠關節(jié)炎指數(shù)（AI）評分法記錄各組大鼠關節(jié)炎病變的發(fā)生及嚴重程度，分為0～4級。0級：無紅腫；1級：足小趾關節(jié)紅腫；2級：趾關節(jié)、足趾均紅腫；3級：踝關節(jié)以下均紅腫；4級：包括踝關節(jié)在內的全部足爪紅腫。結果見表14。與對照組相比，模型組關節(jié)炎指數(shù)評分顯著性升高（＜0.05），說明造模成功。與模型組相比，各給藥組關節(jié)炎指數(shù)評分顯著性降低（＜0.05），其中HA-GTFs凝膠高劑量組降低最顯著（＜0.05）。

2.9.4 大鼠踝關節(jié)病理組織切片 給藥21 d后，處死各組大鼠，對踝關節(jié)周圍肌肉進行鈍性分離，使其暴露出完整的踝關節(jié)，取出踝關節(jié)，以4%甲醛溶液常溫固定后，再放入10% EDTA脫鈣液中于37 ℃下脫鈣處理，石蠟包埋，切片，HE染色，于光鏡下進行組織學觀察。

結果表明，對照組的大鼠踝關節(jié)組織切片未見炎癥細胞浸潤，滑膜組織完整、邊滑；模型組有大量炎癥細胞浸潤，關節(jié)滑膜組織不完整，滑膜增厚，可見明顯的病變；陽性藥物組的大鼠踝關節(jié)組織切片可見少數(shù)炎癥細胞浸潤，滑膜完整；HA-GTFs凝膠低劑量組可見炎癥細胞浸潤，滑膜組織稍有不完整與增厚，邊緣毛躁；HA-GTFs凝膠中劑量組仍可見少量炎癥細胞浸潤，滑膜組織略顯毛躁；HA-GTFs凝膠高劑量組未見炎癥細胞浸潤，滑膜組織完整；普通梔子苷凝膠中劑量組可見少量炎癥細胞浸潤，滑膜組織有損傷、不完整，結果見圖7。

表14 關節(jié)炎指數(shù)評分(, n = 6)

與對照組比較：*＜0.05；與模型組比較：#＜0.05；與HA-GTFs凝膠低劑量組比較：&＜0.05；與陽性藥物組比較：Δ＜0.05；與HA-GTFs凝膠中劑量組比較：$＜0.05，表15同

*< 0.05control group;#< 0.05model group;&< 0.05HA-GTFs low dose group;Δ< 0.05positive drug group;$< 0.05HA-GTFs medium dose group, same as table 15

2.9.5 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immuno-sorbent assay，ELISA）法測定血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）與白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平 給藥21 d后，分別將各組大鼠以10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，4 ℃靜置20 min，3000 r/min離心（離心半徑8.95 cm）10 min（4 ℃），吸取上層血清，?80 ℃冷藏待測。按照TNF-α與IL-6 ELISA試劑盒操作說明書，對血清TNF-α與IL-6水平進行檢測，結果見表15。與對照組相比，模型組血清TNF-α與IL-6水平顯著性升高（＜0.05）。與模型組相比，各給藥組TNF-α與IL-6水平顯著性降低（＜0.05），其中陽性藥物中IL-6水平顯著高于HA-GTFs高劑量組（＜0.05），顯著低于HA-GTFs低、中劑量組（＜0.05）。由以上數(shù)據(jù)結果可知HA-GTFs組與陽性藥物組對大鼠佐劑型關節(jié)炎的炎癥因子水平均有顯著性降低，HA-GTFs高劑量組在降低炎癥因子水平的療效更好。

圖7 各組大鼠踝關節(jié)病理組織學切片(HE染色，×100)

3 討論

本實驗在前期比較了3種傳遞體包封率的測定方法：葡聚糖凝膠柱層析法、離心法與透析法。結果發(fā)現(xiàn)葡聚糖凝膠柱層析法對HA-GTFs與游離梔子苷的分離度差，流出曲線始終只有1個峰。對比了低速（4000、8000 r/min）低溫（4 ℃）離心（離心半徑8.95 cm）與高速（14 000、30 000 r/min）低溫（4 ℃）離心（離心半徑8.95 cm），均不能有效分離HA-GTFs與游離梔子苷，考慮到離心轉速過高可能會使傳遞體結構破壞從而導致藥物泄漏，因此此法亦不適用于HA-GTFs包封率的測定。采用透析法使用截留相對分子質量8000～14 000的透析袋測定HA-GTFs的包封率，能夠達到透析平衡，此平衡點可作為取樣測定點。透析曲線達到平衡點后，再繼續(xù)透析，曲線再次上升，原因是袋內游離藥物不斷通過透析袋孔隙，進入到袋外透析介質中，直至達到平衡，再繼續(xù)透析，包裹在傳遞體中的藥物泄漏，進入透析介質，藥物含量再次上升。

表15 各組大鼠血清中TNF-α與IL-6水平(, n = 6)

本實驗制備的HA-GTFs其包封率未達到《中國藥典》2020年版[21]對于微粒制劑包封率的要求（不低于80%），可能是因為表面活性劑的親水親油平衡值（HLB值）會影響其自身在傳遞體載體系統(tǒng)中的分布，從而導致其與脂質膜相互作用能力的差異。表面活性劑聚山梨酯80、膽酸鈉與脫氧膽酸鈉的HLB值分別為15、18、16，親水性較強，有可能與親水性藥物競爭水相包裹位置，從而導致梔子苷包封率較低。

大鼠佐劑型關節(jié)炎模型是常用的關節(jié)炎類藥效模型[22]，給藥第21天后，大鼠踝關節(jié)組織病理染色結果顯示HA-GTFs凝膠療效更顯著，可減少炎癥細胞浸潤、滑膜組織連續(xù)、完整。通過給藥治療后，HA-GTFs凝膠高劑量組相較于陽性藥物雷公藤多苷片混懸液（ig）能顯著降低血清中TNF-α與IL-6炎癥因子，表明HA-GTFs凝膠對佐劑型關節(jié)炎有顯著的改善作用，可有效抑制TNF-α與IL-6炎癥因子的表達，提高治療效果。

本研究制備了一種兼具高變形性與良好透皮性能的HA-GTFs凝膠，并將其與凝膠劑結合，提高了藥物經(jīng)皮給藥效果，對大鼠佐劑型關節(jié)炎模型具有良好的治療效果。此外，新型微粒給藥系統(tǒng)傳遞體與凝膠劑的結合為經(jīng)皮給藥系統(tǒng)提供了新思路，具有廣闊的應用前景。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation of hyaluronic acid-modified geniposide transfersomes gels and its pharmacodynamic evaluation for adjuvant arthritis

YANHong1, GAO Si-qi2, LUO Hui-ting3, OUYANG Wei1, WANG Xu-yi1, LI Shuang1

1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. Affiliated Hospital of Hunan Academy of Chinese Medicine, Changsha 410006, China 3. The Fourth Hospital of Changsha, Changsha 410006, China

To prepare the hyaluronic acid modified geniposide transfersomes (HA-GTFs) gels, evaluate the quality of the gels, and investigate its therapeutic effects on adjuvant arthritis in rats.The HA-GTFs formulation was prepared by reverse-phase evaporation and screened by single-factor and Box-Behnken design-response surface method to acquire the best prescription. The elasticity comparison of HA-GTFs and hyaluronic acid modified geniposide liposomes (HA-GLIPs) was done. On this basis, HA-GTFs gels were prepared. The viscosity, stability, release properties and percutaneous permeabilityof HA-GTFS gels were measured, and the preliminary pharmacodynamic evaluation of HA-GTFS gels was conducted.Under the transmission electron microscope, the HA-GTFs was in a regular spherical shape with complete structure and uniform dispersion. The HA-GTFs were successfully prepared with an encapsulation efficiency of 57.38%. The average particle size was (117.53 ± 0.83) nm, and the ζ potential was (?8.53 ± 0.76) mV, and the deformability of HA-GTFS was better than that of HA-GLIPs.release test showed that common geniposide gels released completely at 12 h, and HA-GLIPs and HA-GTFs gels showed sustained release effects, with cumulative release rates of 92% and 89% at 48 h, respectively.transdermal test showed that the cumulative transdermal rate of HA-GTFs gels was higher than those of HA-GLIPs gels and common geniposide gels within 24 h, indicating that the transdermal properties of the HA-GTFs gels were good.pharmacodynamic studies showed that compared with the model group, the HA-GTFs gels groups could reduce the inflammatory response of rats, and reduce the serum levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6), without large number of inflammatory cell infiltration in pathological sections. Among them, the therapeutic effects of high-dose HA-GTFs gels group were significantly better than others.The formulation process of HA-GTFs gels is simple and stable. The HA-GTFs gels have good sustained release and transdermal performance, with a certain therapeutic effect on adjuvant arthritis.

geniposide; hyaluronic acid; transfersomal gel; Box-Behnken design-response surface method; adjuvant arthritis; pharmacodynamics; reverse-phase evaporation;tumor necrosis factor-α; interleukin-6

R283.6

A

0253 - 2670(2023)18 - 5867 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.005

2023-04-13

湖南省自然科學基金面上項目（2022JJ30444）；湖南中醫(yī)藥大學重點學科中藥學科（校行發(fā)規(guī)字［2023］2號）；湖南省中醫(yī)藥科研計劃項目（2021223）

顏 紅，女，博士，副教授，碩士生導師，主要從事中藥制劑新劑型與新技術研究。E-mail: yh8632@126.com

高司琪，女，初級中藥師，研究方向為中藥制劑新劑型與新技術研究。E-mail: 1350042471@qq.com

[責任編輯 鄭禮勝]