郭紅鑫，王建茹，王新陸，李興淵，朱翠玲，王永霞，朱明軍*

中藥治療射血分?jǐn)?shù)保留心衰的核心用藥及其作用機(jī)制研究

郭紅鑫1,2，王建茹2，王新陸2，李興淵2，朱翠玲2，王永霞2，朱明軍2*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450000 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心臟中心，河南 鄭州 450000

通過數(shù)據(jù)挖掘總結(jié)中藥治療射血分?jǐn)?shù)保留心衰（heart failure with preserved ejection fraction，HFPEF）的核心用藥，并使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的方法對核心中藥的作用機(jī)制進(jìn)行探索。檢索中國知網(wǎng)（CNKI）、萬方數(shù)據(jù)（Wanfang）、維普網(wǎng)（VIP）、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫（CBM）、PubMed、Cochrane Libarary和Embase數(shù)據(jù)庫，收集治療HFPEF療效明確的方劑，使用R語言對方劑進(jìn)行頻次、關(guān)聯(lián)規(guī)則和聚類分析，得到核心中藥。通過TCMSP、GeneCards、GEO等數(shù)據(jù)庫篩選核心中藥有效成分和HFPEF相關(guān)靶點(diǎn)并取交集靶點(diǎn)，對交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，利用Cytoscape軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并篩選關(guān)鍵成分和靶點(diǎn)。使用vina軟件對關(guān)鍵成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。納入方劑103首，涉及中藥131味，功效以補(bǔ)虛藥和活血化瘀藥為主，藥性多為溫、寒，藥味以甘、苦和辛味為主，歸經(jīng)多歸心、肺和脾經(jīng)，結(jié)合關(guān)聯(lián)規(guī)則和聚類分析得出黃芪和丹參為核心中藥。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)獲得黃芪和丹參85個(gè)有效成分，HFPEF相關(guān)靶點(diǎn)1696個(gè)，交集靶點(diǎn)共117個(gè)；GO分析顯示主要與氧化應(yīng)激和對脂多糖的反應(yīng)有關(guān)；KEGG分析顯示主要與脂質(zhì)、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥等通路有關(guān)；篩選出槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹參酮ⅡA等10關(guān)鍵成分和14個(gè)核心靶點(diǎn)，且關(guān)鍵成分和核心靶點(diǎn)可穩(wěn)定結(jié)合。黃芪和丹參為治療HFPEF的核心中藥，其通過多成分、多靶點(diǎn)調(diào)控氧化應(yīng)激、糖脂代謝和動(dòng)脈粥樣硬化等發(fā)揮作用。

中藥；射血分?jǐn)?shù)保留心衰；黃芪；丹參；槲皮素；木犀草素；山柰酚；丹參酮ⅡA

射血分?jǐn)?shù)保留心衰（heart failure with preserved ejection fraction，HFPEF）指臨床具有心力衰竭的癥狀或體征，且左心室射血分?jǐn)?shù)正常的一種臨床綜合征[1]。該病具有高發(fā)病率和高死亡率的特點(diǎn)，流性病學(xué)調(diào)查顯示近半數(shù)心力衰竭患者為HFPEF，其再住院率及病死率與射血分?jǐn)?shù)降低心衰相當(dāng)[2]。其發(fā)病涉及多種臟器和機(jī)制，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)暫無較好的藥物降低其發(fā)病率和死亡率，而中藥通過多成分、多靶點(diǎn)產(chǎn)生治療作用，因此探索效優(yōu)價(jià)廉的中醫(yī)藥治療方案具有重要的臨床意義[3]。

中醫(yī)藥治療心力衰竭歷史悠久，在緩解癥狀、延緩病情進(jìn)展等方面具有獨(dú)到優(yōu)勢，臨床證據(jù)表明，中醫(yī)藥治療HFPEF療效明確[4]。但由于該病為近年來提出的新病名，目前對其辨證論治尚處于探索階段，不同研究結(jié)果間存在差異，臨床缺乏統(tǒng)一規(guī)范的辨證用藥指導(dǎo)[5]。中醫(yī)藥學(xué)是一門經(jīng)驗(yàn)性學(xué)科，其產(chǎn)生的診療信息（證候、方藥等）具有多因素、非線性等復(fù)雜數(shù)據(jù)特點(diǎn)，因此僅用常規(guī)的統(tǒng)計(jì)方法并不能很好地將中醫(yī)藥學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)傳承下去。數(shù)據(jù)挖掘是指基于大數(shù)據(jù)，從繁雜、隨機(jī)的信息中挖掘出潛在規(guī)律的過程，被廣泛應(yīng)用于決策支持、經(jīng)驗(yàn)傳承和趨勢預(yù)測等，是探索中藥用藥規(guī)律的有效方法，既往已有多項(xiàng)研究成功運(yùn)用該方法探索中藥治療疾病的用藥規(guī)律[6-7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過高通量從中藥處方中篩選多種協(xié)同的化合物，從整體層面說明藥物作用機(jī)制的研究方法，是幫助認(rèn)識中藥治療疾病分子機(jī)制的重要手段[8-9]。本研究全面收集治療HFPEF療效明確的方劑，通過數(shù)據(jù)挖掘分析組方用藥規(guī)律，得到其核心中藥，使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測核心中藥治療該病的潛在機(jī)制，再通過分子對接對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，以期為HFPEF的臨床用藥和基礎(chǔ)研究提供參考。

1 數(shù)據(jù)挖掘

1.1 資料與方法

1.1.1 處方來源及信息提取 2名研究者采用主題詞結(jié)合自由詞檢索中國知網(wǎng)（CNKI）、萬方數(shù)據(jù)（Wanfang）、維普網(wǎng)（VIP）、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫（CBM）、PubMed、Cochrane Libarary和Embase數(shù)據(jù)庫從建庫起至2022年12月14日有關(guān)中藥治療HFPEF的文獻(xiàn)。中文檢索詞為“射血分?jǐn)?shù)保留心衰”“射血分?jǐn)?shù)正常心衰”“舒張性心衰”“中醫(yī)”“中藥”“中西醫(yī)”“中成藥”“醫(yī)案”“經(jīng)驗(yàn)”“湯”“丸”“散”；英文檢索詞為“heart failure with preserved ejection fraction”“heart failure with normal ejection fraction”“diastolic heart failure”“Chinese medicine”“traditional Chinese and western medicine”“Chinese patent medicine”“medical case”“decoction”“pill”“powder”。完成文獻(xiàn)篩選后，提取納入方劑的方藥組成、功效、四氣、五味及歸經(jīng)等信息。根據(jù)《中國藥典》2020版[10]對中藥名進(jìn)行統(tǒng)一。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①研究類型：隨機(jī)對照試驗(yàn)、臨床觀察性文獻(xiàn)、名醫(yī)經(jīng)驗(yàn)和典型醫(yī)案。②符合《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》中HFPEF診斷標(biāo)準(zhǔn)[11]，患者性別、年齡、地區(qū)不限。③干預(yù)措施：包括口服中藥湯藥、中成藥、中藥顆粒劑和中藥散劑在內(nèi)的中藥內(nèi)治法，用藥劑量及療程不限。④所載方藥有明確的藥物組成，且必須療效明確（中藥組和非中藥組療效差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。⑤重復(fù)方藥選取發(fā)表時(shí)間最近者錄入。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①數(shù)據(jù)缺失；②合并其他嚴(yán)重疾病及精神??；③出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)的中藥；④合并使用多種中藥制劑。

1.1.4 數(shù)據(jù)分析 使用R語言4.1.2進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，以得出所用中藥的藥性、藥味、功效、配伍和組方等信息，并確定核心中藥。首先篩選出使用頻次≥10次的高頻中藥，對高頻中藥性味歸經(jīng)及功效進(jìn)行分析。然后通過“arules”包進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析挖掘核心配伍，本研究設(shè)定最小支持度為0.15，最小置信度為0.75，以網(wǎng)狀圖進(jìn)行可視化。最后通過“cluster”包對高頻中藥進(jìn)行層次聚類分析以挖掘核心處方，度量區(qū)間采用平方Euclidean距離，以Ward.D法構(gòu)建聚類樹狀圖。

1.2 結(jié)果

1.2.1 處方篩選結(jié)果 從CNKI中檢索獲得相關(guān)文獻(xiàn)296篇、Wanfang 1152篇、VIP 68篇、CBM 292篇、PubMed 6篇、Cochrane Libarary 37篇、Embase 4篇，總文獻(xiàn)數(shù)1855篇。通過排除重復(fù)文獻(xiàn)531篇及明顯不相關(guān)文獻(xiàn)887篇后，對437篇文獻(xiàn)進(jìn)行全文閱讀篩選，最終納入處方103首，共涉及單味中藥131味，累計(jì)共使用977次。使用頻次＞5的中藥在103首處方中占比見圖1。

圖1 使用頻次＞5次的中藥

1.2.2 高頻中藥功效及性味歸經(jīng)頻數(shù)分析 使用頻次≥10的高頻中藥共23味，累計(jì)使用674次，占總使用頻次的69%；共涉及7種功效，以補(bǔ)虛藥（42.7%）、活血化瘀藥（26.4%）、溫里藥（9.5%）和利水滲濕藥（9.2%）為主，其中補(bǔ)虛藥中75.7%為補(bǔ)氣藥，補(bǔ)陰藥和補(bǔ)血藥占比較少；涉及4種藥性，即寒（30.4%）、熱（3.6%）、溫（45.8%）和平（20.2%）；涉及10條歸經(jīng)，主要為心經(jīng)（22.1%）、肺經(jīng)（20.0%）和脾經(jīng)（19.4%）；五味以甘（44.0%）、苦（27.7%）和辛（19.7%）為主。見圖2。

圖2 高頻中藥功效(A)、四氣(B)、五味(C) 和歸經(jīng)(D) 分析

1.2.3 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 共獲得24種藥物關(guān)聯(lián)，包含11組藥對和13個(gè)角藥，其中黃芪配伍丹參支持度最高（49.5%）。各關(guān)聯(lián)規(guī)則按支持度大小進(jìn)行排列，見表1。關(guān)聯(lián)規(guī)則可視化網(wǎng)狀圖見圖3，圖中圓點(diǎn)的大小和顏色分別反映支持度和置信度，箭頭指向次數(shù)最多的前2位中藥為黃芪和丹參，為核心中藥。

表1 103首處方中高頻藥物的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

Table 1 Association rule analysis of high frequency TCMs in 103 prescriptions

序號關(guān)聯(lián)規(guī)則支持度/%置信度/%提升度序號關(guān)聯(lián)規(guī)則支持度/%置信度/%提升度 1丹參→黃芪49.5176.121.0613丹參，當(dāng)歸→黃芪18.4595.001.32 2桂枝→黃芪30.1077.501.0814紅花→黃芪17.4875.001.04 3當(dāng)歸→黃芪27.1884.851.1815白術(shù)，桂枝→茯苓17.4890.002.06 4川芎→黃芪27.1875.681.0516茯苓，桂枝→白術(shù)17.4875.002.49 5葶藶子→黃芪24.2783.331.1617茯苓，桂枝→黃芪17.4875.001.04 6白術(shù)→茯苓24.2780.651.8518丹參，桂枝→黃芪17.4878.261.09 7丹參，人參→黃芪21.3684.621.1819桂枝，葶藶子→黃芪16.5089.471.25 8黃芪，人參→丹參21.3678.571.2120川芎，丹參→黃芪16.5077.271.08 9麥冬→丹參20.3984.001.2921益母草→丹參15.5388.891.37 10赤芍→黃芪19.4276.921.0722茯苓，葶藶子→黃芪15.5384.211.17 11丹參，茯苓→黃芪19.4276.921.0723丹參，葶藶子→黃芪15.5376.191.06 12黨參→黃芪18.4579.171.1024川芎，當(dāng)歸→黃芪15.5384.211.17

圖3 高頻中藥關(guān)聯(lián)規(guī)則分析網(wǎng)狀圖

1.2.4 聚類分析 聚類分析共得到4個(gè)新方，見圖4，圖中方框內(nèi)藥物代表新方組成。

2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

2.1 資料與方法

2.1.1 核心藥物活性成分篩選及靶點(diǎn)基因預(yù)測 對數(shù)據(jù)挖掘得到的核心中藥，以中藥名為關(guān)鍵詞檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18為條件進(jìn)行篩選獲得有效成分及對應(yīng)的靶點(diǎn)，然后利用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）對靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范。

圖4 高頻藥物聚類分析樹狀圖

2.1.2 HFPEF疾病靶點(diǎn)篩選 設(shè)置檢索詞為“heart failure with preserved ejection fraction”，物種為“Homo sapiens”，檢索GEO（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/geo/）、Genecards（https://www.genecards. org/）和OMIM（https://omim.org/）數(shù)據(jù)庫，將3個(gè)數(shù)據(jù)庫所得的相關(guān)靶點(diǎn)合并、去重得到HFPEF疾病靶點(diǎn)。對GEO數(shù)據(jù)庫中獲得的數(shù)據(jù)集，使用R 4.1.2中“l(fā)imma”包獲取差異基因，設(shè)置＜0.05和log2fold change（FC）絕對值＞0.5作為篩選差異基因的閾值，由火山圖和熱圖展示。

2.1.3 交集靶點(diǎn)篩選 使用R 4.1.2中“venn”包將藥物有效成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集得到中藥治療HFPEF的靶點(diǎn)。

2.1.4 基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析 使用R 4.1.2中“org.Hs.eg.db”“enrichplot”“GOplot”“clusterProfiler”“stringi”“digest”“colorspace”“ggplot2”軟件包對交集基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，均以＜0.01為篩選條件，以獲取交集基因富集的主要功能和代謝通路，結(jié)果以圈圖可視化。

2.1.5 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵成分篩選 將得到的藥物-成分、成分-靶點(diǎn)、交集靶點(diǎn)等數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使用Network Analyzer模塊進(jìn)行拓?fù)浞治?，并根?jù)節(jié)點(diǎn)連接度值（degree）大小篩選出top10的有效成分作為關(guān)鍵有效成分。

2.1.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）構(gòu)建及核心靶點(diǎn)查找 將交集靶點(diǎn)提交至String 11.5數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/），生物種類設(shè)為“Homo sapiens”，最小作用閾值為“highest confidence”（＞0.9），得到PPI；然后將TSV格式的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1，使用CytoNCA插件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)核心查找，通過計(jì)算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的介度中心性（betweenness centrality，BC）、緊密度中心性（closeness centrality，CC）、degree、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、局部平均連通度（local average connectivity，lAC）和網(wǎng)絡(luò)中心性（network centrality，NC）進(jìn)行篩選，若某一靶點(diǎn)在上述6項(xiàng)結(jié)果均大于中位數(shù)則保留，否則刪除，篩選2次后得到PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)。

2.1.7 分子對接 從PubChem（https://pubchem. ncbi.nlm.nih.gov/）得到“2.1.5”中關(guān)鍵成分的2D結(jié)構(gòu)（sdf格式），利用ChemBio3D Ultra 14.0.0.117軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化并轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)（mol2格式），再通過AutoDockTools-1.5.7軟件轉(zhuǎn)化為pdbqt格式文件，作為配體；從PDB（http://www.rcsb.org/）得到“2.1.6”項(xiàng)中關(guān)鍵靶點(diǎn)的PDB文件，后使用PyMOL軟件去掉其水分子和配體，再使用AutoDockTools-1.5.7軟件進(jìn)行加氫和轉(zhuǎn)化為pdbqt格式文件等操作，并確定活性口袋，作為受體。最后使用vina軟件對配體和受體進(jìn)行分子對接，計(jì)算結(jié)合能，使用GraphPad Prism 8軟件繪制結(jié)合能熱圖，使用PyMOL軟件對分子對接結(jié)果可視化。

2.2 結(jié)果

2.2.1 藥物有效成分和對應(yīng)靶點(diǎn) 篩選共獲得黃芪有效成分20個(gè)、丹參有效成分65個(gè)，對應(yīng)的相關(guān)靶點(diǎn)共216個(gè)。具體有效成分見表2。

2.2.2 HFPEF疾病靶點(diǎn) GEO數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)集（GSE192886）經(jīng)差異基因表達(dá)分析得出243個(gè)疾病靶點(diǎn)，見圖5；在GeneCards數(shù)據(jù)庫按照相關(guān)度大于2進(jìn)行篩選獲得1343個(gè)疾病靶點(diǎn)；OMIM數(shù)據(jù)庫獲得278個(gè)疾病靶點(diǎn)。將以上所得靶點(diǎn)取合集并去重后，共獲得疾病靶點(diǎn)1696個(gè)。

2.2.3 藥物-疾病交集靶點(diǎn) 將疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)進(jìn)行匹配映射，共獲得117個(gè)交集靶點(diǎn)。

2.2.4 GO、KEGG富集分析 117個(gè)交集靶點(diǎn)共得到GO條目2034條，其中生物學(xué)進(jìn)程（biological process，BP）1831條、細(xì)胞組分（cellular component，CC）69條、分子功能（molecular function，MF）134條，靶點(diǎn)主要參與對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、對活性氧的反應(yīng)等生物過程；共得到KEGG條目140條，主要富集在糖尿病并發(fā)癥、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化等通路。見圖6。

2.2.5 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 藥物-成分-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)見圖7，圖中中藥有效成分和相關(guān)靶點(diǎn)為節(jié)點(diǎn)，其相互關(guān)系為邊。根據(jù)degree篩選出的關(guān)鍵成分為槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山柰酚（kaempferol）、丹參酮ⅡA（tanshinone ⅡA）、7--甲基-異微凸劍葉莎醇（7--methylisomucronulatol）、二氫丹參內(nèi)酯（dihydro-tanshinlactone）、刺芒柄花素（formononetin）、隱丹參酮（cryptotanshinone）、2-異丙基-8-甲基菲-3,4-二酮（2-isopropyl-8-methylphenanthrene-3,4-dione）和4-亞甲丹參新酮（4-methylenemiltirone）。

表2 黃芪和丹參中的化學(xué)成分

Table 2 Active components in Astragali Radix and Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma

中藥MOL ID化學(xué)成分OB/%DL 丹參MOL0016011,2,5,6-tetrahydrotanshinone38.750.36 丹參MOL001659Poriferasterol43.830.76 丹參MOL001771poriferast-5-en-3beta-ol36.910.75 丹參MOL001942isoimperatorin45.460.23 丹參MOL002222sugiol36.110.28 丹參MOL002651dehydrotanshinone IIA43.760.40 丹參MOL002776baicalin40.120.75 丹參MOL000569digallate61.850.26 丹參MOL000006luteolin36.160.25 丹參MOL006824α-amyrin39.510.76 丹參MOL0070365,6-dihydroxy-7-isopropyl-1,1-dimethyl-2,3-dihydrophenanthren-4-one33.770.29 丹參MOL0070412-isopropyl-8-methylphenanthrene-3,4-dione40.860.23 丹參MOL0070453α-hydroxytanshinone Ⅱa44.930.44 丹參MOL007048(E)-3-[2-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-hydroxy-benzofuran-4-yl]acrylic acid48.240.31 丹參MOL0070494-methylenemiltirone34.350.23 丹參MOL0070502-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-(3-hydroxypropyl)-7-methoxy-3-benzofurancarboxaldehyde62.780.40 丹參MOL0070516-O-syringyl-8-O-acetyl shanzhiside methyl ester46.690.71 丹參MOL007058formyltanshinone73.440.42 丹參MOL0070593-beta-hydroxymethyllenetanshiquinone32.160.41 丹參MOL007061methylenetanshinquinone37.070.36 丹參MOL007063przewalskin a37.110.65 丹參MOL007064przewalskin b110.320.44 丹參MOL007068przewaquinone B62.240.41 丹參MOL007069przewaquinone c55.740.40 丹參MOL007070(6S,7R)-6,7-dihydroxy-1,6-dimethyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzofuran-10,11-dione41.310.45 丹參MOL007071przewaquinone f40.310.46 丹參MOL007077sclareol43.670.21 丹參MOL007079tanshinaldehyde52.470.45 丹參MOL007081danshenol B57.950.56 丹參MOL007082danshenol A56.970.52 丹參MOL007085salvilenone30.380.38 丹參MOL007088cryptotanshinone52.340.40 丹參MOL007093danshexinkum d38.880.55 丹參MOL007094danshenspiroketallactone50.430.31 丹參MOL007098deoxyneocryptotanshinone49.40.29 丹參MOL007100dihydrotanshinlactone38.680.32 丹參MOL007101dihydrotanshinone Ⅰ45.040.36 丹參MOL007105epidanshenspiroketallactone68.270.31 丹參MOL007107(4bS,8aS)-4b,8,8-trimethyl-2-propan-2-yl-5,6,7,8a,9,10-hexahydrophenanthren-3-ol36.070.25 丹參MOL007108isocryptotanshi-none54.980.39 丹參MOL007111isotanshinone II49.920.40 丹參MOL007115manool45.040.20 丹參MOL007118microstegiol39.610.28

續(xù)表2

中藥MOL ID化學(xué)成分OB/%DL 丹參MOL007119miltionone Ⅰ49.680.32 丹參MOL007120miltionone Ⅱ71.030.44 丹參MOL007121miltipolone36.560.37 丹參MOL007122miltirone38.760.25 丹參MOL007123miltirone Ⅱ44.950.24 丹參MOL007124neocryptotanshinone II39.460.23 丹參MOL007125neocryptotanshinone52.490.32 丹參MOL0071271-methyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[5,6-g]benzofuran-6,10,11-trione34.720.37 丹參MOL007130prolithospermic acid64.370.31 丹參MOL007132(2R)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-[(Z)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acryloyl]oxy-propionic acid109.380.35 丹參MOL007140(Z)-3-[2-[(E)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)vinyl]-3,4-dihydroxy-phenyl]acrylic acid88.540.26 丹參MOL007141salvianolic acid G45.560.61 丹參MOL007142salvianolic acid J43.380.72 丹參MOL007143salvilenone Ⅰ32.430.23 丹參MOL007145salviolone31.720.24 丹參MOL007149podocarpa-8,11,13-trien-7-one, 12-hydroxy-13-isopropyl- (8CI)34.490.28 丹參MOL007150(6S)-6-hydroxy-1-methyl-6-methylol-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzofuran-10,11-quinone75.390.46 丹參MOL007151tanshindiol B42.670.45 丹參MOL007152przewaquinone E42.850.45 丹參MOL007154tanshinone IIA49.890.40 丹參MOL007155(6S)-6-(hydroxymethyl)-1,6-dimethyl-8,9-dihydro-7H-naphtho[8,7-g]benzofuran-10,11-dione65.260.45 丹參MOL007156tanshinone Ⅵ45.640.30 黃芪MOL000211mairin55.380.78 黃芪MOL000239jaranol50.830.29 黃芪MOL000296hederagenin36.910.75 黃芪MOL000033(3S,8S,9S,10R,13R,14S,17R)-10,13-dimethyl-17-[(2R,5S)-5-propan-2-yloctan-2-yl]-2,3,4,7,8,9, 11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol36.230.78 黃芪MOL000354isorhamnetin49.600.31 黃芪MOL0003713,9-di-O-methylnissolin53.740.48 黃芪MOL0003745'-hydroxyiso-muronulatol-2',5'-di-O-glucoside41.720.69 黃芪MOL0003787-O-methylisomucronulatol74.690.30 黃芪MOL0003799,10-dimethoxypterocarpan-3-O-β-D-glucoside36.740.92 黃芪MOL000380(6aR,11aR)-9,10-dimethoxy-6a,11a-dihydro-6H-benzofurano[3,2-c]chromen-3-ol64.260.42 黃芪MOL000387bifendate31.100.67 黃芪MOL000392formononetin69.670.21 黃芪MOL000398isoflavanone109.990.30 黃芪MOL000417calycosin47.750.24 黃芪MOL000422kaempferol41.880.24 黃芪MOL000433folic acid68.960.71 黃芪MOL000438(3R)-3-(2-hydroxy-3,4-dimethoxyphenyl)chroman-7-ol67.670.26 黃芪MOL000439isomucronulatol-7,2'-di-O-glucosiole49.280.62 黃芪MOL0004421,7-dihydroxy-3,9-dimethoxy pterocarpene39.050.48 黃芪MOL000098quercetin46.430.28

圖5 差異基因表達(dá)火山圖(A) 和熱圖(B)

Fig. 5 Volcano plot (A) and heat map (B) of differential gene expression

圖6 交集靶點(diǎn)的GO (A) 和KEGG (B) 富集分析圈圖

圖7 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2.6 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn) PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)見圖8，經(jīng)2次篩選后，共得到14個(gè)核心靶點(diǎn)。

2.2.7 分子對接 在PubChem中查找所有關(guān)鍵成分結(jié)構(gòu)sdf文件，共找到9個(gè)，與14個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，共得到126個(gè)對接結(jié)果，各對接結(jié)合能均≤?6 kcal/mol（1 kcal＝4.2 kJ），表明結(jié)合活性均較強(qiáng)，見圖9。選取結(jié)合能最強(qiáng)的4個(gè)組合進(jìn)行可視化，見圖10。

圖8 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖9 結(jié)合能的熱圖分析

3 討論

HFPEF屬于中醫(yī)學(xué)“心脹”“心痹”等范疇，是心力衰竭的一種特殊類型，專家共識指出心力衰竭為本虛標(biāo)實(shí)之證，核心病機(jī)為“虛”“瘀”“水”，益氣、活血、利水為基本治法，但對HFPEF這一特殊階段無論述[5]。近年來有多項(xiàng)研究對該病的用藥規(guī)律和作用機(jī)制進(jìn)行探索。陳晶晶[12]對中藥治療HFPEF的療效進(jìn)行了Meta分析，并對其用藥規(guī)律和作用機(jī)制進(jìn)行了探討。但其Meta分析納入顆粒劑、湯劑、中成藥等多種形式中藥，結(jié)果缺乏針對性，易導(dǎo)致臨床選擇困難；且其數(shù)據(jù)挖掘僅納入處方30首，多個(gè)療效明確的處方未納入導(dǎo)致結(jié)論可信度較低。黃鈺婷等[13]對該病的用藥規(guī)律進(jìn)行了分析，納入處方61首，處方數(shù)仍相對較少，且未進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則等深入分析；在作用機(jī)制方面僅進(jìn)行了簡單的文獻(xiàn)分析，且引用文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)對象并非HFPEF，與實(shí)際差距較大。本研究彌補(bǔ)上述研究不足，將數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接有機(jī)結(jié)合，通過對103首處方深入挖掘其用藥規(guī)律和核心中藥，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探究其作用機(jī)制，從多方面對中藥治療HFPEF的用藥規(guī)律進(jìn)行綜合分析，探索中藥治療HFPEF的核心內(nèi)涵。數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)使用頻率最高的為黃芪（71.8%）和丹參（65.0%），黃芪為治氣虛之要藥，而丹參為活血化瘀要藥。中藥功效同樣以補(bǔ)氣藥和活血化瘀藥為主，其次是溫里藥和利水滲濕藥，而溫里藥在本病治療中多起溫陽利水的作用。針對藥性分析結(jié)果看，用藥多為寒熱并用；藥味以甘味最多，而甘味主補(bǔ)；歸經(jīng)則多歸心、肺和脾經(jīng)。關(guān)聯(lián)規(guī)則分析中，黃芪配伍丹參使用頻率遠(yuǎn)高于其他組合，兩藥相配，益氣活血，兼能利水，符合HFPEF的病機(jī)。由圖3可知，黃芪為最核心的用藥，其次是丹參。聚類分析方1亦為黃芪和丹參，其截距接近30，為組方的基礎(chǔ)。綜合以上結(jié)果顯示黃芪和丹參為HFPEF治療的核心用藥。黃芪和丹參是治療心血管病最常用的中藥組合之一，為芪參益氣滴丸的主要藥物組成，多項(xiàng)臨床研究表明芪參益氣滴丸治療HFPEF在改善患者紐約心臟病學(xué)會（New York Heart Association，NYHA）心功能分級療效、心臟舒張功能及運(yùn)動(dòng)耐量等方面療效明確，在一定程度上肯定了本研究結(jié)果[14]。置信度最高的組合為丹參、當(dāng)歸配伍黃芪，寓意補(bǔ)氣生血、活血化瘀。提升度最高的組合為茯苓、桂枝配伍白術(shù)，亦為方3的主要組成，表明這3味藥關(guān)系密切，為苓桂術(shù)甘湯主要組成，主溫陽化飲、健脾利濕，適用于兼中陽不足、痰飲內(nèi)停者。方2為益氣、活血、滋陰、利水等藥物，根據(jù)患者情況辨證選擇。方4為桃紅四物湯加減，以祛瘀為核心，輔以養(yǎng)血、益氣、行氣等，適用于血瘀較重的患者。綜合以上結(jié)果可以看出，HFPEF治則以益氣活血為主，輔以溫陽利水。

左圖為配體分子與靶點(diǎn)結(jié)合位置；右圖為配體與靶點(diǎn)具體結(jié)合方式，彩色線條為配體周圍的5A以內(nèi)的小分子，黃色虛線為結(jié)合氫鍵

HFPEF發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能與左室舒張功能不全、血管硬化、內(nèi)皮功能不全、容量超負(fù)荷、微循環(huán)障礙、脂肪和糖代謝異常等有關(guān)；若上升到分子細(xì)胞層面，則可能與氧化應(yīng)激、心肌肥大、心肌纖維化、線粒體和代謝缺陷、炎癥反應(yīng)等有關(guān)[15-16]?；瘜W(xué)藥大多數(shù)作用靶點(diǎn)較為局限，這也可能是目前化學(xué)藥治療效果不明顯的原因，而中藥治療疾病通過多成分、多靶點(diǎn)，可能是治療該病的潛在優(yōu)勢所在。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)黃芪和丹參中槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹參酮ⅡA和隱丹參酮等成分通過作用于蛋白激酶B（protein kinase B，AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）等117個(gè)靶點(diǎn)治療HFPEF。實(shí)驗(yàn)研究表明槲皮素可通過調(diào)節(jié)AKT1、MAPK等途徑發(fā)揮心肌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激和改善心衰的病理變化的作用[17-18]。木犀草素通過調(diào)節(jié)STAT3和STAT6影響巨噬細(xì)胞極化以抑制炎癥[19]。丹參酮ⅡA可通過調(diào)控磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）/Akt/ Janus激酶2（Janus kinase，JAK2）/STAT3等途徑產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激、改善內(nèi)皮功能、抗心室重構(gòu)等心肌保護(hù)作用[20]。隱丹參酮可通過Akt-糖原合成酶激酶3β（glycose synthase kinase 3β，GSK-3β）和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）/蛋白偶聯(lián)受體激酶2（G-protein coupled receptor kinase 2，GRK2）途徑改善氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡[21-22]。GO和KEGG富集分析顯示主要與氧化應(yīng)激、糖脂代謝、動(dòng)脈粥樣硬化等相關(guān)。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，黃芪和丹參中的主要活性成分有良好的抗氧化應(yīng)激、抗動(dòng)脈粥樣硬化和調(diào)整糖脂代謝的作用[23-24]。分子細(xì)胞層面研究顯示槲皮素可通過MAPK途徑減輕氧化應(yīng)激對心肌細(xì)胞的損傷[18]。山柰酚和木犀草素可通過調(diào)節(jié)核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid2-related factor 2，Nrf2）抗氧化應(yīng)激，山柰酚還可調(diào)節(jié)Akt/GSK-3β通路調(diào)節(jié)糖脂代謝[25-26]。丹參酮ⅡA可抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路和MAPK信號通路，產(chǎn)生抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用；還可通過調(diào)節(jié)Nrf2通路、Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）活性和還原型輔酶II（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶活性產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激作用[27-28]。表明本研究結(jié)果與實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果較為一致。分子對接顯示，關(guān)鍵成分和核心靶點(diǎn)可穩(wěn)定結(jié)合，肯定了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果。氧化應(yīng)激、炎癥、內(nèi)皮功能不全、心室重構(gòu)、糖脂代謝異常和粥樣硬化等是HFPEF的核心發(fā)病機(jī)制，表明核心中藥可有效針對HFPEF病機(jī)[15-16]。

本研究亦存在不足，數(shù)據(jù)挖掘未對所納入文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)，因此可能混雜有質(zhì)量較低的文獻(xiàn)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)采用TCMSP和Genecards等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，中藥的活性成分以及HFPEF靶點(diǎn)極多，很多活性成分和靶點(diǎn)未被發(fā)現(xiàn)，公共數(shù)據(jù)庫雖然豐富，但可能僅是一部分，且未進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。因此得出的核心中藥作用機(jī)制有一定局限性和預(yù)測性，仍可能存在潛在的、未經(jīng)明確的治療機(jī)制。

4 結(jié)論

HFPEF為本虛標(biāo)實(shí)之證，核心病機(jī)為“虛”“瘀”“水”，尤以虛和瘀最為關(guān)鍵，益氣活血為基本治法，黃芪配伍丹參為該病治療的核心用藥；黃芪和丹參中的槲皮素、木犀草素、山柰酚、丹參酮ⅡA等有效成分通過作用于AKT1、MAPK、STAT3、磷酸化原癌基因（Jun proto-oncogene，JUN）、雌激素受體1（estrogen receptor 1，ESR1）等靶點(diǎn)，產(chǎn)生調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、糖脂代謝、動(dòng)脈粥樣硬化等作用。該結(jié)論可為HFPEF的臨床用藥及進(jìn)一步的研究提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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[28] Tan X, Li J, Wang X,. Tanshinone IIAprotects against cardiac hypertrophy via inhibiting calcineurin/NFATc3 pathway [J]., 2011, 7(3): 383-389.

Study on core medication of traditional Chinese medicine in treatment of heart failure with preserved ejection fraction and its mechanism

GUO Hong-xin1, 2, WANG Jian-ru2, WANG Xin-lu2, LI Xing-yuan2, ZHU Cui-ling2, WANG Yong-xia2, ZHU Ming-jun2

1. The First Clinical Medical College, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China 2. Department of Heart Center, the First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China

The core medication of traditional Chinese medicine (TCM) in treatment of heart failure with preserved ejection fraction (HFPEF) were summarized through data mining and the mechanism of the core TCMs were explored using the methods of network pharmacology and molecular docking.CNKI, Wanfang, VIP, CBM, PubMed, Cochrane Libarary and Embase databases were searched to collect effective prescriptions for HFPEF. The frequency, association rules and cluster of prescriptions were analyzed using R language, the core Chinese medicine was obtained. The relevant targets of core traditional Chinese medicine and HFPEF were screened through TCMSP, GeneCards, GEO and other databases, and the intersection targets were selected, and the gene ontology (GO) and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analyses were performed for the intersection targets. Cytoscape software was used to construct the drug-components-target network and protein interaction network, and the key components and targets were screened respectively. Molecular docking of key components and core targets was performed using vina software.A total of 103 prescriptions were included in data mining, involving 131 TCMs; The main efficacy categories were tonic and blood-activating and stasis-removing medicines; The properties of medicines were mostly warm and cold; The tastes of medicines were mainly sweet, bitter and pungent; The primary meridian tropisms were heart, lung and spleen; Combined with association rules and cluster analysis, it was concluded that Huangqi () and Danshen(et) were the core Chinese medicines. A total of 85 active ingredients ofandet, 1696 targets of HFPEF, and 117 intersecting targets were obtained by network pharmacology. GO analysis showed that it was mainly related to oxidative stress and reaction to lipopolysaccharide. KEGG analysis showed that it was mainly related to lipid, atherosclerosis, diabetes complications and other pathways. Ten key components including quercetin, luteolin, kaempferol and tanshinone IIAand 14 core targets were screened, and the key components and core targets could be stably combined.andetwere the core TCMs for the treatment of HFPEF, which play a role in regulating oxidative stress, glucose and lipid metabolism and atherosclerosis through multi-components and multi-targets.

traditional Chinese medicine; heart failure with preserved ejection fraction;;et; quercetin; luteolin; kaempferol; tanshinone IIA

R285

A

0253 - 2670(2023)18 - 6017 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.020

2023-03-19

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)課題（2019YFC1710003，2019YFC1710000）；國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（82030120）；河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項(xiàng)課題（2018JDZX009）

郭紅鑫，男，博士研究生，從事中西醫(yī)結(jié)合防治心血管疾病的臨床和基礎(chǔ)研究。E-mail: guohongxin1214@163.com

朱明軍，男，博士，教授，從事中醫(yī)藥防治心血管疾病的臨床和基礎(chǔ)研究。E-mail: zhumingjun317@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]