謝小麗，胡 璇，陳振夏，陳 悅，江 芊，官玲亮，于福來(lái)

高良姜精油提取工藝優(yōu)化、成分分析及其生物活性研究

謝小麗，胡 璇，陳振夏，陳 悅，江 芊，官玲亮，于福來(lái)*

中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中藥材生物學(xué)與栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶藥用植物工程研究中心/國(guó)家熱帶植物種質(zhì)資源庫(kù)，海南 海口 571101

優(yōu)化水蒸氣蒸餾法提取高良姜精油的工藝，分析其化學(xué)成分并對(duì)其抗氧化與抑菌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，為高良姜精油開(kāi)發(fā)利用提供一定的研究基礎(chǔ)。以高良姜根莖為原料，采用水蒸氣蒸餾法提取高良姜精油，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和星點(diǎn)響應(yīng)面法優(yōu)化高良姜精油的最佳提取工藝，利用GC-MS分析其化學(xué)成分，并對(duì)其抗氧化活性和抑菌活性進(jìn)行研究。高良姜精油的最佳提取工藝條件為料液比1∶9.2、浸泡時(shí)間1.1 h、蒸餾時(shí)間4.3 h、蒸餾溫度226 ℃，在此條件下，高良姜精油提取率為1.07%。從高良姜精油中共檢測(cè)出44種化學(xué)成分，占總精油的99.41%，其主要成分有1,8-桉油精（41.92%）、γ-依蘭油烯（13.66%）、(?)-α-萜品醇（7.52%）、α-順-香檸檬烯（4.29%）和反丁香烯（3.96%）。高良姜精油對(duì)DPPH自由基和ABTS自由基均具有較強(qiáng)的清除能力，其半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為（5.84±0.15）mg/mL和（1.31±0.08）mg/mL，其質(zhì)量濃度在0.5～16.0 mg/mL時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)的鐵還原能力。高良姜精油對(duì)6種供試細(xì)菌與3種供試真菌均表現(xiàn)出一定的抑菌活性，其中對(duì)金黃色葡萄球菌與肺炎克雷伯氏菌表現(xiàn)為高敏感型；所有受試菌的生長(zhǎng)均能被高良姜精油抑制，最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值為0.78～25.00 mg/mL，最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）值為3.13～25.00 mg/mL，對(duì)銅綠假單胞菌、白色念珠菌與黑曲霉無(wú)殺菌活性。優(yōu)化工藝條件下提取的高良姜精油提取率高，工藝穩(wěn)定可行，高良姜精油的主要成分相對(duì)含量高于文獻(xiàn)報(bào)道，并具有較強(qiáng)的抗氧化與抑菌活性，可將高良姜精油作為天然抗氧化劑與抑菌劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)。

高良姜；精油；1,8-桉油精；γ-依蘭油烯；(?)-α-萜品醇；α-順-香檸檬烯；反丁香烯；抗氧化；抑菌活性

高良姜是姜科山姜屬植物高良姜Hance的干燥根莖，別名良姜、小良姜，始載于《名醫(yī)別錄》，歷版《中國(guó)藥典》均有收載，主產(chǎn)于廣東、廣西、海南、福建、云南、臺(tái)灣等省區(qū)，具有溫胃、祛風(fēng)、散寒、行氣、止痛的功效[1-2]，臨床常用于治療脘腹寒痛、胃寒嘔吐、消化不良、噯氣吞酸等病癥[3-4]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，高良姜具有抗炎鎮(zhèn)痛[5]、抗氧化[6]、抗菌[7]、抗?jié)僛8]、抗腫瘤[9]、降血糖[10]、調(diào)脂減肥[11]、促滲透[12]等藥理作用。此外，高良姜為我國(guó)著名的十大南藥之一，隨著其綜合開(kāi)發(fā)利用的不斷深入，高良姜在醫(yī)藥、食品、香料、化妝品以及蔬果保鮮等領(lǐng)域[13]應(yīng)用廣泛，此外，高良姜精油作為天然調(diào)味香料，因其具有保鮮、防霉、抗菌、抗氧化和驅(qū)殺蚊蟲(chóng)等功能，使它在糧食儲(chǔ)藏和食品保鮮方面也具有很好的應(yīng)用前景[14]。

目前，植物精油提取方法有多種，如超臨界流體萃取法、水蒸氣蒸餾法、有機(jī)溶劑萃取法、酶解法、超聲波提取法等。水蒸氣蒸餾法具有提取時(shí)間長(zhǎng)、效率低、耗能高等缺點(diǎn)，但因其提取純度較高、綠色安全且操作簡(jiǎn)單，仍是國(guó)內(nèi)制藥行業(yè)普遍采用的提取揮發(fā)油的方法[14]，然而，該方法揮發(fā)油提取率低，極大地影響中藥制藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。故如何提高水蒸氣蒸餾法提取精油的工藝條件是受到研究人員關(guān)注的，因此，本實(shí)驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法（central composite design-response surface methodology，CCD-RSM）優(yōu)化水蒸氣蒸餾法提取高良姜精油的最佳工藝，對(duì)提高揮發(fā)油的收率及品質(zhì)，節(jié)約生產(chǎn)時(shí)間及成本，具有一定的理論意義和現(xiàn)實(shí)價(jià)值。再通過(guò)GC-MS分析高良姜精油的化學(xué)成分及其抗氧化、抑菌活性，旨在為國(guó)內(nèi)高良姜精油的活性評(píng)價(jià)提供參考，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用高良姜精油提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

高良姜購(gòu)于亳州中藥材市場(chǎng)，由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所于福來(lái)研究員鑒定，為姜科山姜屬植物高良姜Hance的干燥根莖，標(biāo)本存放于研究所南藥研究室。2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazy，DPPH）、2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽［2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS］、2,4,6-三吡啶基三嗪（tripyridyl triazine，TPTZ）、2,6-二叔丁基對(duì)甲酚（2,6-di-tert- butyl-4-methylphenol，BHT）、抗壞血酸（vitamin C，VC）、乙醚、無(wú)水乙醇、乙酸、乙酸鈉、三氯化鐵、濃鹽酸、過(guò)硫酸鉀、硫酸亞鐵均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

MH瓊脂培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基、YM瓊脂培養(yǎng)基、YM肉湯培養(yǎng)基、大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基、左氧氟沙星、兩性霉素B（分析純）均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。大腸桿菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌ATCC 27853、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、枯草芽孢桿菌ATCC 9372由青島大學(xué)藥學(xué)院李剛老師贈(zèng)送，肺炎克雷伯氏菌ATCC 10031、單增李斯特菌ATCC 19111、熱帶假絲酵母菌ATCC 20962、白色念珠菌ATCC 90028、黑曲霉ATCC 16404購(gòu)于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 儀器與設(shè)備

ZNHW型數(shù)顯電熱套、ZNHW型干燥箱，上海予申有限公司；2L/29#揮發(fā)油提取器，上海門(mén)融星生物科技有限公司；7820A-Agilent 5977E型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS），美國(guó)安捷倫科技有限公司；JJ324BC型萬(wàn)分之一天平，雙杰測(cè)試儀器廠；SpectraMax Plus 384型酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices公司；HWS24型電子恒溫水浴鍋、KQ-500 DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；XFS-280A型手提式壓力蒸汽滅菌鍋，浙江新風(fēng)醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái)，蘇州廣源凈化科技有限公司；Sartarius CPA225D型電子分析天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；BM2100型光學(xué)顯微鏡，浙江新風(fēng)醫(yī)療器械有限公司；DNP-9052BS-Ⅲ型電熱恒溫培養(yǎng)箱、HZQ-X160型恒溫?fù)u床，上海申苗醫(yī)療器械制造有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 高良姜精油的提取及提取率計(jì)算

按照《中國(guó)藥典》2020年版精油測(cè)定法“甲法”，取高良姜根莖原樣粉碎過(guò)篩，稱取高良姜粉末50 g放入2000 mL圓底燒瓶中，連接蒸餾裝置，加熱沸騰后蒸餾提取，試驗(yàn)均重復(fù)3次。收集精油，加入適量無(wú)水硫酸鈉干燥，按公式計(jì)算精油提取率。

精油提取率＝精油體積/植物粉末質(zhì)量

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)考察高良姜的提取工藝

2.2.1 粉碎度考察 取高良姜根莖原樣，分別粉碎過(guò)10、20、30、40、50、60目篩子，獲得不同顆粒大小的樣品。分別稱取高良姜粉末50 g，加入10倍量蒸餾水，浸泡3 h，220 ℃下水蒸氣蒸餾5 h，每個(gè)顆粒大小重復(fù)3次試驗(yàn)，收集并測(cè)量精油體積，計(jì)算提取率。結(jié)果粉碎度為10、20、30、40、50、60目時(shí)高良姜精油的提取率分別為（0.69±0.03）%、（0.87±0.03）%、（0.78±0.02）%、（0.95±0.05）%、（0.62±0.02）%、（0.48±0.08）%（＝3），當(dāng)樣品顆粒從10～40目時(shí)，高良姜精油的提取率快速上升；當(dāng)樣品顆粒從40～60目時(shí)，高良姜精油的提取率劇烈下降，對(duì)于根莖類藥材，粉碎度的變化相對(duì)于果實(shí)類藥材變化更為明顯，這可能是因?yàn)橐婚_(kāi)始隨著目數(shù)的減小，根莖類藥材從較大體積的根莖急劇變?yōu)轭w粒狀，精油成分很快浸出，但隨著顆粒越來(lái)越小，揮發(fā)損失的精油量也逐漸增大，因此，綜合考慮選擇高良姜粉碎度為40目。

2.2.2 料液比考察 分別稱取過(guò)40目篩的高良姜粉末50 g，分別按料液比1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12加入蒸餾水，浸泡3 h，220 ℃下水蒸氣蒸餾5 h，每個(gè)料液比重復(fù)3次試驗(yàn)，收集并測(cè)量精油體積，計(jì)算提取率。結(jié)果料液比為1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12時(shí)高良姜精油的提取率分別為（0.65±0.05）%、（0.67±0.03）%、（0.81±0.03）%、（0.87±0.03）%、（0.82±0.02）%、（0.79±0.01）%（＝3），隨著料液比的逐漸增大，高良姜精油的提取率先上升后下降。當(dāng)料液比在1∶7～1∶8時(shí)，高良姜精油提取率幾乎沒(méi)有變化；當(dāng)料液比在1∶8～1∶10時(shí)，高良姜精油提取率快速上升；當(dāng)料液比在1∶10～1∶12時(shí)，高良姜精油提取率緩慢減小，所以綜合考慮，選擇料液比為1∶10。

2.2.3 浸泡時(shí)間考察 分別稱取過(guò)40目篩的高良姜粉末50 g，加入10倍蒸餾水分別浸泡0、1、2、3、4、5 h，220 ℃下水蒸氣蒸餾5 h，每個(gè)浸泡時(shí)間重復(fù)3次試驗(yàn)，收集并測(cè)量精油體積，計(jì)算提取率。結(jié)果浸泡時(shí)間為0、1、2、3、4、5 h時(shí)高良姜精油的提取率分別為（0.55±0.05）%、（0.93± 0.07）%、（0.81±0.03）%、（0.82±0.06）%、（0.82± 0.02）%、（0.81±0.03）%（＝3），浸泡前1 h高良姜根莖精油的出油率急劇升高；浸泡時(shí)間在1～2 h時(shí)，高良姜根莖精油的出油率快速下降，可能是因?yàn)楦o類藥材在一開(kāi)始粉末浸泡后精油成分迅速浸出，但隨著浸泡時(shí)間的增加，精油揮發(fā)損失量大于浸出量導(dǎo)致提取率的下降，當(dāng)浸泡了2 h后高良姜精油的提取率趨于平緩，因此，綜合考慮選擇浸泡時(shí)間為1 h。

2.2.4 蒸餾時(shí)間考察 分別稱取過(guò)40目篩的高良姜粉末50 g，將其浸泡于10倍量的蒸餾水中1 h，220 ℃下分別水蒸氣蒸餾2、3、4、5、6、7 h，每個(gè)蒸餾時(shí)間重復(fù)3次試驗(yàn)，收集并測(cè)量精油體積，計(jì)算提取率。結(jié)果蒸餾時(shí)間為2、3、4、5、6、7 h時(shí)高良姜精油的提取率分別為（0.47±0.03）%、（0.63±0.03）%、（0.87±0.03）%、（0.83±0.05）%、（0.85±0.05）%、（0.82±0.02）%（＝3），隨著蒸餾時(shí)間的增加，高良姜精油的出油速度急劇變大，直至蒸餾4 h出油量最高，之后高良姜精油的提取率慢慢下降直至趨于平緩，可能是由于蒸餾時(shí)間過(guò)長(zhǎng)收集器中的少部分精油揮發(fā)，因此，選擇蒸餾時(shí)間為4 h。

2.2.5 蒸餾溫度的考察 分別稱取過(guò)40目篩子的高良姜粉末50 g，將其浸泡于10倍量的蒸餾水中1 h，分別于140、180、220、260、300、340 ℃下水蒸氣蒸餾4 h，每個(gè)蒸餾溫度重復(fù)3次試驗(yàn)，收集并測(cè)量精油體積，計(jì)算提取率。結(jié)果蒸餾溫度為140、180、220、260、300、340 ℃時(shí)高良姜精油的提取率分別為（0.58±0.02）%、（0.67±0.03）%、（0.91±0.01）%、（0.73±0.05）%、（0.66±0.02）%、（0.63±0.03）%（＝3），當(dāng)蒸餾溫度為140～220 ℃時(shí)，高良姜精油提取率快速上升，當(dāng)蒸餾溫度為220 ℃時(shí)，精油提取率達(dá)到最大值，當(dāng)蒸餾溫度在220～340 ℃時(shí)，高良姜根莖精油的出油率劇烈減少，與高良姜精油提取率變化不同，可能是高良姜根莖精油在此溫度下易揮發(fā)，因此，選擇蒸餾溫度為220 ℃。

2.3 CCD-RSM設(shè)計(jì)試驗(yàn)考察高良姜的提取工藝

試驗(yàn)采用CCD-RSM原理，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇料液比（1）、浸泡時(shí)間（2）、蒸餾時(shí)間（3）和蒸餾溫度（4）為考察因素，高良姜精油提取率（）為響應(yīng)值，對(duì)高良姜精油提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，每組試驗(yàn)均重復(fù)3次。CCD-RSM試驗(yàn)因素水平及試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表1。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，得到關(guān)于編碼值的回歸方程：提取率＝1.050＋0.0261＋0.0192＋0.0463＋0.0474－3.625×10?312－1.125×10?313－6.250×10?314－0.01623－3.750×10?324－0.04134－0.06412－0.05622－0.06932－0.11042。對(duì)擬合的回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，模型的＜0.000 1，表明該回歸模型極顯著；模型的2＝0.915 5，表明91.55%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可用該模型進(jìn)行解釋；失擬項(xiàng)的＝0.342 5（＞0.05），差異不顯著，說(shuō)明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾小，殘差均由隨機(jī)誤差引起。因素3、4及二次項(xiàng)12、22、32、42對(duì)高良姜精油提取率有極顯著影響（＜0.01），交互項(xiàng)34對(duì)高良姜精油提取率有顯著影響（＜0.05），其余項(xiàng)不顯著，表明各因素對(duì)精油提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。由各因素的平方的方差分析結(jié)果，可以得出4個(gè)因素對(duì)結(jié)果影響的大小順序?yàn)?（蒸餾溫度）＞3（蒸餾時(shí)間）＞1（料液比）＞2（浸泡時(shí)間）。

表1 高良姜精油提取的CCD-RSM試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(n = 3)

Table 1 Experiment design and results of CCD-RSM of essential oilextraction ofAOR (n = 3)

試驗(yàn)號(hào)X1X2/hX3/hX4/℃Y/%試驗(yàn)號(hào)X1X2/hX3/hX4/℃Y/%試驗(yàn)號(hào)X1X2/hX3/hX4/℃Y/% 11∶8 (?1)0.5 (?1)3 (?1)180 (?1)0.62111∶81.532600.80211∶91.02 (?2)2200.60 21∶10 (+1)0.531800.72121∶101.532600.84221∶91.06 (+2)2200.86 31∶81.5 (+1)31800.64131∶80.552600.76231∶91.04140 (?2)0.40 41∶101.531800.68141∶100.552600.80241∶91.04300 (+2)0.72 51∶80.55 (+1)1800.74151∶81.552600.80251∶91.042201.10 61∶100.551800.80161∶101.552600.84261∶91.042201.00 71∶81.551800.84171∶7 (?2)1.0 (0)4 (0)220 (0)0.70271∶91.042200.98 81∶101.551800.90181∶11 (+2)1.042200.80281∶91.042201.06 91∶80.53260 (+1)0.78191∶9 (0)0.0 (?2)42200.74291∶91.042201.04 101∶100.532600.82201∶92.0 (+2)42200.82301∶91.042201.12

根據(jù)回歸方程，采用Design Expert 10.0軟件繪制料液比（1）、浸泡時(shí)間（2）、蒸餾時(shí)間（3）和蒸餾溫度（4）的響應(yīng)面圖和等高線圖（圖1）。通過(guò)響應(yīng)面圖和等高線圖的形狀可以判斷單因素對(duì)精油提取率的影響，響應(yīng)曲面越陡峭說(shuō)明其對(duì)精油提取率的影響越顯著，等高線圖則是越接近橢圓說(shuō)明2因素交互作用對(duì)精油的影響越顯著。從圖1中的響應(yīng)面圖可知，圖1-F對(duì)應(yīng)的曲線有較大的弧度，其次為圖1-A，即表明交互項(xiàng)34對(duì)高良姜根莖精油的提取率有顯著的影響，這個(gè)結(jié)果與表2的結(jié)果一致。從圖1-f中的等高線圖也可以明顯看出3和4的圖形為橢圓形，這說(shuō)明3和4共同影響高良姜根莖精油的提取率且影響顯著。相對(duì)而言，圖1-a～e等高線為圓形或接近于圓形，說(shuō)明除交互項(xiàng)34外，其他因素之間的交互作用對(duì)高良姜根莖精油的提取率影響不顯著，這與表2的結(jié)果也一致。

通過(guò)回歸方程及響應(yīng)曲面的分析，確定水蒸氣蒸餾提取高良姜精油的最佳提取工藝條件為料液比1∶9.188、浸泡時(shí)間1.102 h、蒸餾時(shí)間4.312 h、蒸餾溫度225.930 ℃，在此條件下，高良姜精油提取率為1.07%。考慮到實(shí)際操作的方便性，將最佳工藝條件修正為料液比1∶9.2、浸泡時(shí)間1.1 h、蒸餾時(shí)間4.3 h、蒸餾溫度226 ℃。在此條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的實(shí)際提取率為1.01%，與理論預(yù)測(cè)值相比只相差0.06%，說(shuō)明該回歸方程能較準(zhǔn)確地反映各因素對(duì)高良姜精油提取率的影響，可用于高良姜精油提取工藝的優(yōu)化。

表2 方差分析

Table 2 Variance analysis

方差來(lái)源平方和自由度均方F值P值顯著性方差來(lái)源平方和自由度均方F值P值顯著性 模型0.650140.04611.610＜0.000 1極顯著X3X40.02710.0276.8100.019 7顯著 X10.01610.0164.0300.063 1 X120.11010.11027.700＜0.000 1極顯著 X28.740×10?318.740×10?32.1900.160 0 X220.08610.08621.5500.000 3極顯著 X30.05010.05012.5600.002 9極顯著X320.13010.13032.230＜0.000 1極顯著 X40.05410.05413.5400.002 2極顯著X420.34010.34084.580＜0.000 1極顯著 X1X22.103×10?412.103×10?40.0530.821 8 殘差0.060154.000×10?3 X1X32.025×10?512.025×10?55.063×10?30.944 2 失擬項(xiàng)0.045104.500×10?31.5000.342 5 X1X46.250×10?416.250×10?40.1600.698 2 純誤差0.01553.000×10?3 X2X34.160×10?314.160×10?31.0400.324 0 總和0.71029 X2X42.250×10?412.250×10?40.0560.815 7

圖1 各因素交互作用對(duì)高良姜精油的影響等高線圖和響應(yīng)面圖

2.4 高良姜精油成分分析

采用GC-MS方法[15]對(duì)高良姜精油化學(xué)成分進(jìn)行分析。色譜條件：色譜柱為HP5-MS彈性毛細(xì)管柱（0.25 mm×0.25 μm×30 m）；升溫程序：起始溫度60 ℃，之后以4 ℃/min升溫至116 ℃保持20 min，再以5 ℃/min升溫至160 ℃，最后以20℃/min升溫至280 ℃保持2 min；高純氦載氣；柱內(nèi)載氣流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；不分流。質(zhì)譜條件：EI離子源；離子源溫度230 ℃；四級(jí)桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；接口溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍50～500 amu。

采用GC-MS對(duì)高良姜精油成分進(jìn)行分析，通過(guò)和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)比對(duì)定性，采用峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量，精油的總離子流色譜圖見(jiàn)圖2。高良姜精油的化學(xué)成分大多集中在保留時(shí)間5～40 min。定性結(jié)果及相對(duì)含量見(jiàn)表3，由圖2與表3可知，從高良姜精油中初步鑒定出44種化學(xué)成分，占色譜總流出物相對(duì)含量的99.41%，從化合物類型來(lái)看，高良姜精油的主要成分為醇、烴、酯、酮、醚類等化合物，其中13種醇類化合物，占57.44%，21種烴類化合物，占32.18%，2種酯類化合物，占0.62%，1種酮類化合物，占0.48%，1種醚類化合物，占0.26%。

從表3中高良姜精油各組分的相對(duì)含量可以看出，相對(duì)含量高于1%的成分有14種，占總量的85.73%；含量在3%以上的化合物5種，占主導(dǎo)地位的是1,8-桉油精（41.92%），其次是γ-依蘭油烯（13.66%）、(?)-α-萜品醇（7.52%）、α-順-香檸檬烯（4.29%）和反丁香烯（3.96%）。本研究中高良姜精油的主要成分為1,8-桉油精與γ-依蘭油烯，其中鑒于高良姜精油成分中1,8-桉油精、γ-依蘭油烯的相對(duì)含量較高，筆者認(rèn)為可將高良姜作為天然植物源1,8-桉油精、γ-依蘭油烯的提取原料。

2.5 高良姜精油抗氧化活性

2.5.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 參考Yosr 等[16]和Zhu等[17]的方法，并據(jù)實(shí)驗(yàn)稍作修改。稱取DPPH 39.4 mg加入10 mL無(wú)水乙醇中，超聲2 min使其完全溶解，配制成10 mmol/L的DPPH母液并避光密封保存于4 ℃冰箱中。用無(wú)水乙醇將DPPH母液稀釋成0.1 mmol/L，分別吸取2 mL 0.5、1、2、4、8、16、32 mg/mL質(zhì)量濃度的各樣品溶液加入到2 mL DPPH溶液（0.1 mmol/L）中，充分混勻，室溫避光靜置30 min，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在517 nm處測(cè)定吸光值（s）。以VC和BHT為陽(yáng)性對(duì)照（s），無(wú)水乙醇為空白對(duì)照（c），每個(gè)質(zhì)量濃度的各樣品和對(duì)照均重復(fù)3次，取平均值。DPPH自由基清除率（）按下式計(jì)算。

＝(c－s)/c

結(jié)果見(jiàn)表4與圖3，高良姜精油有一定的清除DPPH自由基的能力，但均低于VC與BHT。由回歸方程可以看出，高良姜精油樣品質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率呈良好的線性關(guān)系，說(shuō)明高良姜精油清除自由基能力與其質(zhì)量濃度呈明顯的量效關(guān)系。但當(dāng)精油質(zhì)量濃度較高時(shí)，其質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率不成線性關(guān)系，所以，清除率不能很好地表示精油清除DPPH自由基的能力，也不能很好地對(duì)精油抗氧化活性進(jìn)行比較。

圖2 高良姜精油的GC-MS總離子流圖

表3 高良姜精油的化學(xué)成分及其相對(duì)含量

Table 3 Chemical components and their relative contents of AOR essential oil

峰號(hào)tR/min化合物分子式相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)含量/% 15.1401,8-桉油精C10H18O15441.92 25.757γ-萜品烯C10H161360.27 36.806左旋芳樟醇C10H18O1540.43 47.947左旋樟腦C10H16O1521.81 58.585(?)-龍腦C10H18O1540.85 68.891萜品烯-4-醇C10H18O1541.80 79.291(?)-α-萜品醇C10H18O1547.52 810.168乙酸小茴香酯C12H20O21960.46 910.848芐基丙酮C10H12O1480.48 1012.1454-烯丙基苯甲醚C10H12O1480.26 1113.421苯甲酸異丁酯C11H14O21780.41 1214.583(+)-環(huán)苜蓿烯C15H242040.22 1314.744α-依蘭烯C15H242040.69 1414.900α-古巴烯C15H242040.22 1515.507β-欖香稀C15H242040.35 1615.673環(huán)丁基-苯C10H121320.36 1716.503反丁香烯C15H242043.96 1816.612(?)-1,7-二甲基-7-(4-甲基-3-戊烯基)-三環(huán)[2.2.1.0(2,6)]庚烷C15H242040.94 1917.204(1S,2E,6E,10R)-3,7,11,11-四甲基雙環(huán)[8.1.0]十一碳-2,6-二烯C15H242040.72 2017.335α-順-香檸檬烯C15H242044.29 2117.831α-古蕓烯C15H242041.30 2218.013α-葎草烯C15H242041.33 2318.485右旋大根香葉烯C15H242040.55 2419.295γ-蓽澄茄烯C15H242040.50 2519.710β-芹油烯C15H242041.53 2620.0522-甲基丁酸-2-苯乙酯C13H18O22060.21 2720.2602-異丙烯基-4a,8-二甲基-1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氫萘C15H242041.80 2821.017δ-guainenC15H242040.51 2921.578γ-依蘭油烯C15H2420413.66 3022.081順-菖蒲烯C15H222020.33 3122.268δ-杜松油烯C15H242041.88 3222.833(4aR,8aS)-4a-甲基-1-亞甲基-7-(丙烷-2-葉立德酮)十氫萘C15H242040.66 3323.269selina-3,7(11)-dieneC15H242041.03 3423.477α-白菖考烯C15H202000.63 3526.512石竹素C15H24O2201.39 3627.119γ-古蕓烯C15H242040.40 3729.018環(huán)氧化蛇麻烯IIC15H24O2200.40 3829.916表蓽澄茄油烯醇C15H26O2220.83 3933.050τ-杜松醇C15H26O2220.28 4034.269異長(zhǎng)葉烯C15H242040.69 4134.658τ-依蘭醇C15H26O2220.24 4237.802刺柏腦C15H26O2220.25 4338.342α-檀香醇C15H24O2200.32 4439.255(R,Z)-2-甲基-6-(4-甲基環(huán)六-1,4-二烯-1-基)庚-2-烯-1-醇C15H24O2200.73 總計(jì) 99.41

表4 高良姜精油對(duì)DPPH自由基的清除能力(, n = 3)

圖3 高良姜精油對(duì)DPPH自由基的清除率

因此，為了比較高良姜精油清除DPPH自由基的能力，選用精油對(duì)DPPH自由基清除作用的半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）為測(cè)定指標(biāo)，精油的IC50值越小說(shuō)明其清除DPPH自由基的能力越強(qiáng)。由表4可知，高良姜精油、VC和BHT的IC50分別為（5.84±0.15）、0.001 3、0.024 mg/mL。

2.5.2 ABTS自由基清除能力的測(cè)定 參考Jena 等[18]的方法，并據(jù)實(shí)驗(yàn)稍作修改。將濃度為7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液混合，于室溫避光條件下靜置過(guò)夜，用無(wú)水乙醇稀釋ABTS過(guò)硫酸鉀溶液，使其在734 nm處的值為0.700±0.020，形成ABTS測(cè)定液。分別吸取1 mL 0.5、1、2、4、8、16、32 mg/mL質(zhì)量濃度的各樣品溶液加入4 mL ABTS測(cè)定液中，充分混勻，室溫避光靜置30 min，然后在734 nm處測(cè)定吸光值（s）。以VC和BHT為陽(yáng)性對(duì)照（s），無(wú)水乙醇為空白對(duì)照（c），每個(gè)質(zhì)量濃度的各樣品和對(duì)照均重復(fù)3次，取平均值。ABTS自由基清除率按公式計(jì)算。

＝(c－s)/c

高良姜精油清除ABTS自由基的回歸方程和IC50值見(jiàn)表5。由回歸方程可以看出，高良姜精油樣品質(zhì)量濃度與ABTS自由基清除率呈良好的線性關(guān)系，表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。由表5可知，高良姜精油、VC和BHT的IC50分別為（1.305±0.008）、0.000 55、0.001 1 mg/mL。由圖4可知，高良姜精油清除ABTS自由基的能力，當(dāng)質(zhì)量濃度大于6 mg/mL時(shí)，清除率大于80%，當(dāng)質(zhì)量濃度大于16 mg/mL時(shí)，清除率趨于平穩(wěn)。當(dāng)質(zhì)量濃度為32 mg/mL時(shí)，清除率為92.78%，結(jié)果表明高良姜精油有一定的清除ABTS自由基的能力，但高良姜精油清除ABTS自由基的能力與VC與BHT有一定的差距。

2.5.3 鐵還原能力測(cè)定（FRAP） 參考Memarzadeh等[19]的方法，分別配制300 mmol/L醋酸鹽緩沖液（pH 3.6）、20 mmol/L FeCl3?6H2O溶液和10 mmol/L TPTZ溶液（用40 mmol/L鹽酸配制），將3個(gè)溶液按照10∶1∶1的比例進(jìn)行混合配制成FRAP工作液（FRAP工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用），混勻后放37 ℃水浴鍋中預(yù)熱備用。

表5 高良姜精油對(duì)ABTS自由基的清除能力(, n = 3)

圖4 高良姜精油對(duì)ABTS自由基的清除率

分別依次吸取0.1 mL不同質(zhì)量濃度的各樣品溶液和0.3 mL蒸餾水加入2.6 mL預(yù)熱至37 ℃的FRAP工作液中，充分混勻，室溫避光靜置30 min，然后在593 nm處測(cè)定值。以VC和BHT為陽(yáng)性對(duì)照，蒸餾水為空白對(duì)照，每個(gè)質(zhì)量濃度的各樣品和對(duì)照均重復(fù)3次，取平均值。

以FeSO4?7H2O溶液為標(biāo)品，建立FeSO4溶液的回歸方程為＝0.068＋0.17，2＝0.981，每克樣品替代FeSO4?7H2O的微摩爾數(shù)表示鐵的還原力［FRAP活性用mmol Fe2+/(L?g)來(lái)表示］，結(jié)果見(jiàn)表6，高良姜精油具有一定的還原能力，并且隨質(zhì)量濃度增加，還原能力增強(qiáng)，但增加幅度小，當(dāng)高良姜精油質(zhì)量濃度為16 mg/mL時(shí)，高良姜精油鐵還原能力在（19.730±0.682）mmol Fe2+/(L?g)。由此可見(jiàn)，高良姜精油具有較好的鐵還原力，但在相同質(zhì)量濃度下，高良姜精油的還原能力與BHT和VC相比還有一定的差距。

表6 高良姜精油鐵還原能力(, n = 3)

2.6 高良姜精油抑菌活性

2.6.1 抑菌圈的測(cè)定 采用濾紙片瓊脂平板擴(kuò)散法，在無(wú)菌的操作臺(tái)用移液槍吸取精油20 μL滴于無(wú)菌濾紙片（＝6 mm）上，待紙片充分吸收后貼在已涂布的各菌液（菌液濃度為106～107cfu/mL）培養(yǎng)基平板上，并標(biāo)記好各藥液的名稱，每個(gè)菌進(jìn)行3次重復(fù)，以無(wú)菌水為陰性對(duì)照，左氧氟沙星為細(xì)菌的陽(yáng)性對(duì)照，兩性霉素B為真菌的陽(yáng)性對(duì)照，細(xì)菌培養(yǎng)條件為恒溫培養(yǎng)箱37 ℃中培養(yǎng)24 h，真菌培養(yǎng)條件為恒溫培養(yǎng)箱28 ℃中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察并記錄抑菌圈的有無(wú)以及直徑大小作為判斷敏感度高低的標(biāo)準(zhǔn)，采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑大小，取其平均值作為測(cè)定結(jié)果。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)為抑菌圈直徑大于20 mm時(shí)為極敏，直徑在15～20 mm時(shí)為高敏，在10～15 mm時(shí)為中敏，抑菌圈直徑小于10 mm為低敏[20]。

結(jié)果見(jiàn)表7與圖5、6，高良姜精油對(duì)6種供試細(xì)菌與3種供試真菌均表現(xiàn)出一定的抑菌活性，其中，在革蘭陽(yáng)性菌上高良姜精油對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)為高敏感（15.29±0.32）mm，對(duì)枯草芽孢桿菌表現(xiàn)為中度敏感（14.65±0.02）mm，對(duì)單增李斯特菌表現(xiàn)為低敏感（8.21±0.14）mm。在革蘭陰性菌上，高良姜精油對(duì)肺炎克雷伯氏菌表現(xiàn)為高敏感（15.60±0.41）mm，對(duì)大腸桿菌（13.22±0.49）mm與銅綠假單胞菌（12.65±0.05）mm表現(xiàn)為中度敏感。在真菌上，高良姜精油對(duì)熱帶假絲酵母菌、白色念珠菌、黑曲霉表現(xiàn)為低敏感。

2.6.2 最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定 在96孔板上采用微量二倍稀釋法進(jìn)行MIC試驗(yàn)，將A1作為起始的第1孔，從左到右依次進(jìn)行，每個(gè)板上1～12孔為藥液，每個(gè)板只能加1種菌，每個(gè)板均做3個(gè)空白、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。首先用移液槍向每排第1孔加入180 μL菌懸液，第2～12個(gè)孔各加入100 μL菌懸液，再分別吸取20 μL各精油于第1孔，充分混勻后依次對(duì)第1～12孔做梯度稀釋，使其精油濃度分別為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.195、0.097 μL/mL，每個(gè)菌重復(fù)3次，待培養(yǎng)結(jié)束后使用酶標(biāo)儀測(cè)定96孔板內(nèi)各溶液的吸光值，抑菌率達(dá)到80%的樣品質(zhì)量濃度就為該樣品對(duì)該菌的MIC。

表7 高良姜精油對(duì)6株細(xì)菌與3株真菌的抑菌圈直徑、MIC值與MBC值

Table 7 Antibacterial circle diameter, MIC value and MBC value of AOR essential oil against six bacterial and three fungi

菌種分類受試菌種抑菌圈平均直徑/mmMIC/(mg?mL?1)MBC/(mg?mL?1) 高良姜精油陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照 革蘭陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌15.29±0.3222.27±0.25?0.7825.00 枯草芽孢桿菌14.65±0.0223.25±0.35?0.7812.50 單增李斯特菌8.21±0.1423.95±0.44?25.0025.00 革蘭陰性菌大腸桿菌13.22±0.4925.04±0.46?0.783.13 銅綠假單胞菌12.65±0.0524.62±0.16?0.78? 肺炎克雷伯氏菌15.60±0.4124.53±0.17?25.0012.50 真菌熱帶假絲酵母菌9.18±0.2615.35±0.24?6.2525.00 白色念珠菌9.73±0.4215.11±0.28?25.00? 黑曲霉9.39±0.4015.01±0.16?12.50?

圖5 高良姜精油對(duì)6株細(xì)菌的抑菌圈直徑圖

圖6 高良姜精油對(duì)3株真菌的抑菌圈直徑圖

結(jié)果見(jiàn)表7的MIC值，高良姜精油對(duì)細(xì)菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌與銅綠假單胞菌的抑制作用最為明顯，在較低的質(zhì)量濃度條件下，對(duì)這4種菌有很好的抑制效果，其MIC為0.781 mg/mL，對(duì)單增李斯特菌與肺炎克雷伯氏菌的抑制效果有所降低，對(duì)這2種細(xì)菌的MIC為25 mg/mL；高良姜精油對(duì)真菌熱帶假絲酵母菌的抑制作用較為明顯，其MIC為6.25 mg/mL，黑曲霉的MIC為12.5 mg/mL，而對(duì)白色念珠菌的MIC為25 mg/mL。

2.6.3 最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）的測(cè)定 采用瓊脂培養(yǎng)基平板法，取各樣品MIC所對(duì)應(yīng)的溶液均勻涂布于相應(yīng)的平板中，待培養(yǎng)結(jié)束后觀察培養(yǎng)基中有無(wú)菌株生長(zhǎng)，菌落數(shù)低于5個(gè)的平板就為該樣品的MBC。結(jié)果見(jiàn)表7的MBC值，高良姜精油對(duì)大腸桿菌的殺菌效果最好，其MBC為3.125 mg/mL，其次對(duì)枯草芽孢桿菌、肺炎克雷伯氏菌的MBC為12.5 mg/mL；對(duì)金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌的MBC為25 mg/mL，而對(duì)銅綠假單胞菌、白色念珠菌與黑曲霉無(wú)殺菌活性。

3 討論

高良姜作為辛溫類藥材，其辛味主要來(lái)源于其富含的揮發(fā)油類成分，其揮發(fā)油是高良姜的主要有效成分之一，其中的1,8-桉油精（素）含量相對(duì)穩(wěn)定，是直接反映高良姜揮發(fā)油質(zhì)量?jī)?yōu)劣的一個(gè)參考指標(biāo)，但高良姜揮發(fā)油成分復(fù)雜，不同提取方法與不同產(chǎn)地所得揮發(fā)油成分及含量均不盡相同[21-22]。林麗靜等[23]對(duì)比了超臨界和水蒸氣提取高良姜精油，得出超臨界CO2提取技術(shù)提取的精油提取率（1.77%）高于水蒸氣技術(shù)提取的提取率（1.20%），2種方法的提取率均高于本研究最佳提取工藝提取的提取率（1.07%），但其2種方法提取的精油中1,8-桉油精（素）質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為15.49%、10.61%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于本實(shí)驗(yàn)提取精油的1,8-桉油精（素）質(zhì)量分?jǐn)?shù)（41.92%），且γ-依蘭油烯（13.66%）在之前文獻(xiàn)報(bào)道的高良姜精油成分中尚未見(jiàn)檢測(cè)出。楊曉紅等[24]探討了酶法、超聲波輔助水蒸氣蒸餾法提取高良姜精油，在不同超聲時(shí)間、水浴溫度、酶作用時(shí)間與酶用量影響下其提取率為0.44%～0.72%，1,8-桉油精質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為22.46%，提取率與1,8-桉油精含量均低于本實(shí)驗(yàn)的高良姜精油。

綜上所述可以看出，不同提取方法或工藝條件對(duì)高良姜精油成分比例影響存在較大差異，可根據(jù)產(chǎn)品的需求選擇不同的提取方法及工藝條件，而本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化所得的提取工藝條件對(duì)于高良姜精油的應(yīng)用具有一定指導(dǎo)意義，所得的精油1,8-桉油精（素）為主要化學(xué)成分，這與相關(guān)文獻(xiàn)[25]報(bào)道的一致，但1,8-桉油精相對(duì)含量與其他成分及其含量與文獻(xiàn)報(bào)道的差異顯著，本研究中高良姜精油中1,8-桉油精相對(duì)含量（41.92%）高于文獻(xiàn)報(bào)道（16.17%～21.65%）[26-28]。

1,8-桉油精又名桉葉精、1,8-桉葉(油)素、桉樹(shù)腦等，具有類樟腦氣味的無(wú)色液體，主要存在于桉葉油中，亦天然存在于姜科植物高良姜中，桉油精具有廣泛的生物活性，包括抑菌、抗炎、抗氧化以及促滲透等作用，在醫(yī)藥、化妝品和香料工業(yè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[29-30]。高良姜精油中其他主要成分萜品醇又名松油醇，是一種非常重要的單萜類化合物之一，可用作調(diào)配紫丁香型香精的主劑，還可應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、儀表和電訊工業(yè)等領(lǐng)域中[31]。香檸檬烯一種天然單萜烯，具有廣譜抗菌性、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等活性[32]。在最優(yōu)條件下提取的高良姜精油具有一定的抗氧化能力與抑菌活性，這可能與其主要成分1,8-桉油精有關(guān)[33]，但其具體成分的作用機(jī)制尚需深入研究，才能真正揭示高良姜精油的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Extraction technology, component analysis and biological activity ofessential oil

XIE Xiao-li, HU Xuan, CHEN Zhen-xia, CHEN Yue, JIANG Qian, GUAN Ling-liang, YU Fu-lai

Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Biology and Cultivation of Herb Medicine (Haikou), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, P.R. China/Hainan Provincial Engineering Research Center for Tropical medicinal plants/National Tropical Plants Germplasm Resource Center, Haikou 571101, China

To optimize the extraction process of essential oil from Gaoliangjiang (, AOR) by steam distillation, analyze its chemical composition, and evaluate its antioxidant and antibacterial activities, so as to provide certain research basis for the development and utilization of essential oil from AOR.The essential oil was extracted from rhizome ofAOR by steam distillation. Single factor test and central composite design-response surface methodology (CCD-RSM) were used to optimize the extraction process of essential oil. The chemical constituents of essential oil were analyzed by GC-MS, and the antioxidant and antibacterial activities of essential oil were studied.The optimal extraction process conditions for AORessential oil were material to liquid ratio of 1∶9.2, soaking time of 1.1 h, distillation time of 4.3 h, and distillation temperature of 226 ℃. Under these conditions, the extraction rate of AOR essential oil was 1.07%. A total of 44 chemical components were detected from the essential oil of AOR, accounting for 99.41% of the total essential oil, and the main components were 1,8-eucalyptol (41.92%), γ-ylangolene (13.66%), (?)-α-terpenol (7.52%), α--bergamotene (4.29%) and β-caryophyllene (3.96%). AOR essential oil showed strong scavenging ability for DPPH and ABTS free radicals, with half maximal inhibitory concentration (IC50) values of (5.84 ± 0.15) mg/mL and (1.31 ± 0.08) mg/mL, respectively, and showed strong iron reducing ability when the concentration was in the range of 0.5 and 16.0 mg/mL. The essential oil of AORshowed certain antibacterial activity against six kinds of bacteria and three kinds of fungi, among which it was highly sensitive toand. The growth of all the tested bacteria could be inhibited by the essential oil of AOR. The minimum inhibitory concentration (MIC) was 0.78—25.00 mg/mL, and the minimum bactericidal concentration (MBC) was 3.13—25.00 mg/mL. There was no bactericidal activity against,and.Under optimized conditions, the extraction rate of the essential oil was high and the process was stable and feasible. The relative contents of main components of the essential oil were higher than those reported in the literature, and the essential oil had strong antioxidant and antibacterial activities. The essential oil of AOR could be used as natural antioxidant and antibacterial agent for development.

; essential oil; 1,8-eucalyptol; γ-ylangolene; (?)-α-terpenol; α--bergamotene; β-caryophyllene; antioxidant; antimicrobial activity

R283.6

A

0253 - 2670(2023)18 - 5904 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.008

2023-03-28

中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（1630032022008）；海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（820MS102）；中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所非營(yíng)利項(xiàng)目（PZS2023013）

謝小麗（1988—），助理研究員，碩士，研究方向?yàn)槟纤庂Y源研究與開(kāi)發(fā)利用。E-mail: xiexiaoli13@126.com

于福來(lái)（1983—），研究員，博士，研究方向?yàn)槟纤庂Y源定向培育及開(kāi)發(fā)利用。E-mail: fulai.yu@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]