萬(wàn)春梅，石春蕊，高軍，張劍虹

作者單位：1蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2蘭州大學(xué)第一醫(yī)院皮膚科，甘肅 蘭州 730000

痤瘡是最常見(jiàn)的皮膚病之一，影響全球近90%的青少年［1］。近20 年來(lái)，我國(guó)痤瘡的發(fā)病率及患病率持續(xù)上升［2］。該病雖不會(huì)危及生命，但若治療不當(dāng)，可能會(huì)遺留永久性瘢痕，導(dǎo)致嚴(yán)重的身心疾?。?］。病原微生物學(xué)發(fā)現(xiàn)痤瘡丙酸桿菌（Cutibacterium acnes，C.acnes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，Saureus）和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，S.epidermidis）是痤瘡相關(guān)致病菌［3］，抑制痤瘡相關(guān)致病菌的繁殖是治療痤瘡的重要手段之一。

抗生素是治療痤瘡的常用藥物［4］，但長(zhǎng)期使用抗生素可導(dǎo)致耐藥菌產(chǎn)生，還可能使皮膚微生態(tài)失衡［5］。外用紅霉素治療痤瘡，12周后耐藥性S.epidermidis成為皮膚優(yōu)勢(shì)菌種，鼻腔S aureus相對(duì)豐度從15%升至40%［6］；另一項(xiàng)基于16SrRNA 測(cè)序的研究發(fā)現(xiàn)使用四環(huán)素類抗生素6 周后，病人臉頰C.acnes相對(duì)豐度降低，葡萄球菌、鏈球菌等豐度增加［7］。

近年，植物來(lái)源的天然產(chǎn)物因其更高效低毒受到廣泛關(guān)注，可以替代或輔助抗生素抑制痤瘡致病菌［8-9］。黃酮類化合物是自然界一大類天然產(chǎn)物，具有明顯抗菌活性［10］。槲皮素（quercetin）和山柰酚（kaempferol）是其中代表。槲皮素是一種天然多羥基黃酮類化合物，目前發(fā)現(xiàn)其存在于100 余種中草藥及多種蔬菜水果中。它對(duì)多種細(xì)菌有抑制作用，包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌［10］；槲皮素和阿莫西林聯(lián)用可逆轉(zhuǎn)耐阿莫西林表皮葡萄球菌的耐藥性［11］；Kumar等［12］研究發(fā)現(xiàn)槲皮素具有廣譜抗菌性。山柰酚是另一種分布廣泛的天然黃酮類化合物，對(duì)幽門(mén)螺桿菌及大腸桿菌有抑制作用［13-14］；Cruz 等［15］研究發(fā)現(xiàn)山柰酚與氨基糖苷類抗生素組合能產(chǎn)生協(xié)同作用，增強(qiáng)對(duì)S aureus及大腸桿菌的抗菌作用，降低抗生素最小抑菌濃度（MIC）和治療劑量。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過(guò)構(gòu)建藥物成分-靶點(diǎn)-通路-疾病的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，分析其作用機(jī)制的新興學(xué)科；它以生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合基因組學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)等不同學(xué)科，運(yùn)用多種網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行可視化分析，探索藥物治療疾病的機(jī)制［16-17］。

本研究擬探究槲皮素和山柰酚對(duì)三種痤瘡致病菌的抗菌作用，并聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)其抗痤瘡的作用機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 主要試劑與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株S aureus（SAU Newman）和S.epidermidis（ATCC 12228）由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院菌種保藏中心提供，C.acnes（ATCC 6919）購(gòu)自上海富祥科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器槲皮素（批號(hào)C12374611）、山柰酚（批號(hào)C12945398）、紅霉素（批號(hào)C11119014）、克林霉素（批號(hào)C11860980）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司；強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基（RCM）（批號(hào)1210S031）、大豆蛋白胨（批號(hào)218K052）、瓊脂粉（批號(hào)1214X028）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白胨（批號(hào)2127842）購(gòu)自上海金畔生物科技有限公司；D（+）無(wú)水葡萄糖（批號(hào)20160824）、磷酸氫二鉀（批號(hào)20140507）、氯化鈉（批號(hào)20201016）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。厭氧產(chǎn)氣袋、培養(yǎng)盒及指示劑（日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社）；生化培養(yǎng)箱（蘭州文曦分析儀器有限公司）；生物潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海旻泉儀器有限公司）；寶特ELx800 酶標(biāo)儀（濟(jì)南奧諾生物工程有限公司）。

2 方法

2.1 供試藥液、培養(yǎng)基和菌懸液的制備用二甲基亞砜（DMSO）溶解槲皮素、山柰酚并稀釋成所需濃度；無(wú)菌蒸餾水溶解克林霉素、95%乙醇溶解紅霉素，蒸餾水稀釋成所需濃度，現(xiàn)配現(xiàn)用。配制胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA），強(qiáng)化梭菌培養(yǎng)基（RCM）、強(qiáng)化梭菌瓊脂培養(yǎng)基（RCA）。121 ℃滅菌20 min，冷卻后置于4 ℃冰箱。無(wú)菌條件下取C.acnes甘油凍存液至RCM，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，稀釋轉(zhuǎn)接后再培養(yǎng)28 h獲對(duì)數(shù)期菌液；分別取S aureus及S.epidermidis甘油凍存液至TSB，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)16 h，稀釋轉(zhuǎn)接后再培養(yǎng)3 h獲對(duì)數(shù)期菌液，使用前稀釋菌液濃度約為1.5×105CFU/mL。

2.2 藥物抑菌活性考察無(wú)菌條件下，在培養(yǎng)基平板表面均勻涂布0.1 mL 相應(yīng)對(duì)數(shù)期菌液，每板打5個(gè)直徑7 mm的孔，去除孔內(nèi)瓊脂，分別加入槲皮素、山柰酚（濃度均為500 mg/L）、兩種藥物等體積混合液、陽(yáng)性對(duì)照克林霉素（5 mg/L），陰性對(duì)照DMSO 各70 μL。S aureus及S.epidermidis于37 ℃培養(yǎng)16 h，C.acnes于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，十字交叉法測(cè)抑菌環(huán)直徑，實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次取平均值。

2.3 藥物MIC 和最小殺菌濃度（MBC）根據(jù)微量二倍稀釋法略作變化測(cè)藥物MIC和MBC［18］。在96孔板第1 列孔中分別加入180 μL 菌液，20 μL 藥物，使槲皮素、山柰酚終濃度為2.5 g/L，克林霉素、紅霉素終濃度為0.5 mg/L，第2～9 列孔分別加入100 μL 菌液。吹打混勻后吸取第1 列每孔100 μL 液體至第2列，以此類推，連續(xù)倍比稀釋9個(gè)濃度。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照（僅含菌液），陰性對(duì)照（空白培養(yǎng)基），溶劑對(duì)照（DMSO），每種菌1板。S aureus、S.epidermidis于37 ℃培養(yǎng)16 h，C.acnes于37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，630 nm波長(zhǎng)檢測(cè)光密度（OD）值，以抑制80%細(xì)菌生長(zhǎng)的最小藥物濃度為相應(yīng)藥物的MIC，公式1：抑制率（%）=1-（OD實(shí)驗(yàn)組- OD陰性對(duì)照組- OD溶劑對(duì)照組）/（OD陽(yáng)性對(duì)照組-OD溶劑對(duì)照組）×100%［18］。每組質(zhì)量濃度設(shè)2個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3 次。取MIC、2MIC、4MIC 孔內(nèi)液體10μL 涂布于相應(yīng)平板，“2.2”的條件培養(yǎng)，當(dāng)菌落數(shù)≤5個(gè)，判定該濃度為MBC，實(shí)驗(yàn)平行3次。

2.4 藥物時(shí)間抑菌曲線測(cè)定將7 個(gè)無(wú)菌小錐形瓶分別編號(hào)1、2、3、4、5、6、7 號(hào)，每瓶加9 mL 的C.acnes菌液（濃度為105CFU/mL），1～3 號(hào)再加1 mL 不同濃度槲皮素，4～6 號(hào)加1 mL 不同濃度山柰酚，使其終濃度分別為2MIC、MIC、1/2MIC，7 號(hào)只含菌液，37 ℃厭氧培養(yǎng)；將14 個(gè)無(wú)菌試管分為兩組，分別編為1～7 號(hào)，每組試管加4.5 mL 的S aureus或S.epidermidis菌液（濃度為105CFU/mL），1～3 號(hào)再加500 μL不同濃度槲皮素，4～6號(hào)加500 μL不同濃度山柰酚，使藥物終濃度分別為2MIC、MIC、1/2MIC，7 號(hào)只含菌液，37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)。C.acnes每4 小時(shí)各取100 μL 于96 孔板，以相應(yīng)培養(yǎng)基調(diào)0，630 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)OD 值，連續(xù)測(cè)至第52小時(shí)；S aureus及S.epidermidis每2小時(shí)測(cè)OD值，連續(xù)測(cè)至第24小時(shí)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 分析，計(jì)量資料以±s表示，多組計(jì)量資料間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究槲皮素和山柰酚治療痤瘡的作用機(jī)制

2.6.1預(yù)測(cè)槲皮素和山柰酚靶點(diǎn) 檢索藥物作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)DrugBank（https：//go.drugbank.com）、中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）、中醫(yī)藥實(shí)驗(yàn)和參考指導(dǎo)數(shù)據(jù)庫(kù)HERB（http：//drug.ac.cn/）獲取槲皮素和山柰酚作用靶點(diǎn)，并通過(guò)文獻(xiàn)補(bǔ)充，用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）將靶點(diǎn)名轉(zhuǎn)化為人類基因名稱。

2.6.2獲取痤瘡潛在靶點(diǎn) 檢索人類基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)GeneCards（https：//www.genecards.org/）、在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)OMIM（https：//www.omim.org/）、Disgenet（https：//www.disgenet.org/home/）數(shù)據(jù)庫(kù)、DrugBank（https：//go.drugbank.com）數(shù)據(jù)庫(kù)篩選痤瘡靶點(diǎn)，選擇物種為“Homo sapiens”，以“Acne”為關(guān)鍵詞，將藥物及痤瘡靶點(diǎn)上傳到Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）獲得交集靶點(diǎn)。

2.6.3蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和拓?fù)浞治?將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），選取“Homo sapiens”為蛋白屬種，設(shè)置“Highest confidence=0.900”，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，并下載“tsv”格式文件，利用Cytoscape 3.9.1 軟件的插件CytoHubba進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，分析參?shù)包括度值（Degree）、邊緣滲透組件（EPC）和最大團(tuán)中心性（MCC）。

2.6.4基因本體（GO）生物功能與京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析 將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫(kù)（更新于2022-4-22），物種選擇為H.sapiens，P Value Cutoff 設(shè)置為0.01，其余保留默認(rèn)設(shè)置。GO包含生物學(xué)過(guò)程（BP）、細(xì)胞組成（CC）、分子功能（MF）。用微生信網(wǎng)站（http：//www.bioinformatics.com.cn/）繪制GO 分析柱狀圖和KEGG 通路分析氣泡圖，用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“藥物成分-交集靶點(diǎn)-信號(hào)通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)。

2.6.5分子對(duì)接分析驗(yàn)證 從PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載化合物2D 結(jié)構(gòu)，用ChemBio3D 軟件獲得3D 結(jié)構(gòu)，從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）中獲得受體蛋白結(jié)構(gòu)，用Py-MOLWin 軟件去水和小分子配體，AutoDock Tools 1.5.6 軟件向受體添加極性氫，網(wǎng)格盒設(shè)置為包含整個(gè)受體區(qū)域，在所有對(duì)接研究中，每對(duì)配體和受體生成20個(gè)對(duì)接構(gòu)象，當(dāng)配體和受體結(jié)合構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)，能量分?jǐn)?shù)越低，發(fā)生結(jié)合的可能性越大［19］。結(jié)合能小于0 表明配體可自發(fā)與受體結(jié)合，當(dāng)對(duì)接能量值<-20.92 kJ/mol表示二者有較好結(jié)合活性；<-29.29 kJ/mol表示有強(qiáng)烈的結(jié)合活性。AutoDock Vina 1.5.6軟件進(jìn)行分子對(duì)接模擬及分析，PyMOLWin軟件繪圖。

3 結(jié)果

3.1 藥物抑菌活性考察陰性對(duì)照組不存在抑菌現(xiàn)象，所有實(shí)驗(yàn)組抑菌環(huán)直徑大于15 mm，說(shuō)明槲皮素和山柰酚單用及聯(lián)用對(duì)三種菌均有較強(qiáng)抑制作用，見(jiàn)表1，圖1。

圖1 相同濃度不同藥物分別作用于S aureus（A）、S.epidermidis（B）、C.acnes（C）的藥物抑菌環(huán)直徑平板圖

表1 相同濃度藥物抑菌環(huán)直徑比較/（mm，±s）

表1 相同濃度藥物抑菌環(huán)直徑比較/（mm，±s）

注：S. aureus 為金黃色葡糖球菌，S.epidermidis 為表皮葡萄球菌，C.acnes為痤瘡丙酸桿菌。①與陰性對(duì)照比較，P<0.05。

抑菌環(huán)直徑組別S. aureus SAU Newman 19.17±0.29①21.67±0.58①18.33±0.58①25.33±0.58①7.00±0.00 655.08<0.001槲皮素（500 mg/L）山柰酚（500 mg/L）兩藥聯(lián)用陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照（DMSO）F值P值S.epidermidis-ATCC 12228 16.67±0.58①21.00±1.00①19.00±1.00①27.67±0.58①7.00±0.00 317.63<0.001 C.acnesATCC6919 16.67±0.58①17.33±0.58①17.33±0.58①31.33±0.58①7.00±0.00 847.75<0.001

3.2 MIC和MBC槲皮素及山柰酚對(duì)三種菌有較強(qiáng)抑制作用，但弱于陽(yáng)性對(duì)照組，見(jiàn)表2。

表2 槲皮素和山柰酚等藥物對(duì)痤瘡相關(guān)菌的MIC和MBC/（mg/L）

3.3 藥物時(shí)間抑菌曲線陽(yáng)性對(duì)照組（不加藥）OD值呈“S”形上升趨勢(shì)，加藥能有效抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。各組在2MIC 的OD 值持續(xù)處于初始水平，表明該濃度完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)；各組在MIC 及1/2MIC 的生長(zhǎng)整體滯后，細(xì)菌遲緩期持續(xù)時(shí)間比對(duì)照組長(zhǎng)，且隨藥物濃度增加抑制作用增強(qiáng)，見(jiàn)圖2。

圖2 不同濃度槲皮素或山柰酚對(duì)三種細(xì)菌的抑菌曲線：A為金黃色葡糖球菌與槲皮素；B為金黃色葡糖球菌與山柰酚；C為表皮葡萄球菌與槲皮素；D為表皮葡萄球菌與山柰酚；E為痤瘡丙酸桿菌與槲皮素；F為痤瘡丙酸桿菌與山柰酚

3.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

3.4.1獲取藥物、疾病及二者交集靶點(diǎn) 檢索得到2 種活性成分靶點(diǎn)212 個(gè)；痤瘡靶點(diǎn)1 548 個(gè)，將212個(gè)成分靶點(diǎn)和1 548 個(gè)疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0 得到97個(gè)交集靶點(diǎn)，如圖3。

圖3 藥物潛在作用靶點(diǎn)-痤瘡靶點(diǎn)Venny圖

3.4.2PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選 網(wǎng)絡(luò)共97個(gè)節(jié)點(diǎn)，315 條邊，節(jié)點(diǎn)平均Degree 值為6.49。計(jì)算每個(gè)節(jié)點(diǎn)的Degree、MCC 和EPC 并對(duì)分值進(jìn)行排名，得到8個(gè)參數(shù)排名均靠前的靶點(diǎn)，作為PPI的核心靶點(diǎn)（Hubs），見(jiàn)表3，圖4。

圖4 藥物治療痤瘡的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

表3 槲皮素和山柰酚治療痤瘡關(guān)鍵靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)信息

3.4.3GO 功能和KEGG 通路富集分析 Metascape分析得到GO 功能富集條目共1 464 條，其中BP 有1 296 條，MF 有37 條，CC 有131 條，KEGG 富集分析得到183 條信號(hào)通路。根據(jù)P值由小到大排序分別選取BP、CC、MF 前10 個(gè)條目，KEGG 分析中前40 條通路，見(jiàn)圖5，6。BP 主要涉及細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、對(duì)異種刺激的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)等；CC主要包括囊泡腔、分泌顆粒管腔、胞質(zhì)囊泡腔等；MF 主要有核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、血紅素結(jié)合等。綜合文獻(xiàn)分析，與痤瘡炎癥反應(yīng)相關(guān)的KEGG 富集通路主要包括腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17（IL-17）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、輔助性T 細(xì)胞17（Th17）細(xì)胞分化、磷脂酰肌醇3 激酶-蛋白激酶（PI3K-Akt）信號(hào)通路。

圖5 Go分析柱狀圖

圖6 KEGG分析氣泡圖

3.4.4復(fù)合靶點(diǎn)通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 利用Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建藥物成分-交集靶點(diǎn)-信號(hào)通路-疾病網(wǎng)絡(luò)，如圖7。網(wǎng)絡(luò)共有107 個(gè)節(jié)點(diǎn)（疾病1 個(gè)、活性化合物2個(gè)、靶點(diǎn)97個(gè)、通路7條）和336條邊。

圖7 藥物成分-交集靶點(diǎn)-信號(hào)通路-疾病網(wǎng)絡(luò)圖(紫色節(jié)點(diǎn)代表痤瘡相關(guān)通路，紅色節(jié)點(diǎn)代表疾病,綠色節(jié)點(diǎn)代表活性成分，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)）

3.4.5分子對(duì)接驗(yàn)證 選取槲皮素和山柰酚與排名前四的核心靶點(diǎn)蛋白（JUN、RELA、TNF、IL-6）對(duì)接，槲皮素、山柰酚與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合自由能都<-20.92 kJ/mol，說(shuō)明活性成分與蛋白形成的構(gòu)象結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，結(jié)合活性較高。其中二者與RELA、TNF結(jié)合更緊密，見(jiàn)表4。將槲皮素、山柰酚與4 個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖8。

圖8 槲皮素和山柰酚與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接圖：A～D分別為槲皮素與JUN、RELA、TNF、IL-6對(duì)接過(guò)程；E～H分別為山柰酚與JUN、RELA、TNF、IL-6對(duì)接過(guò)程

表4 核心靶點(diǎn)蛋白與槲皮素、山柰酚分子對(duì)接得分

4 討論

微生物學(xué)研究認(rèn)為痤瘡與S aureus、S.epidermidis和C.acnes等細(xì)菌繁殖有關(guān)［20］，C.acnes在病程早期可誘發(fā)毛囊口角化，形成微粉刺；還參與疾病進(jìn)展的炎癥反應(yīng)［21］；Jusuf 等［22］培養(yǎng)痤瘡病人皮損及非皮損部位皮膚進(jìn)行細(xì)菌鑒定，發(fā)現(xiàn)S aureus在炎性皮損中樣本含量明顯高于非炎性皮損，S.epidermidis在炎性及非炎性皮損中含量相當(dāng)，因此S aureus與痤瘡炎性皮損具有一定關(guān)聯(lián)。S.epidermidis可誘導(dǎo)相關(guān)炎性因子表達(dá)，促進(jìn)并加重炎癥反應(yīng)［23］。故本研究考察槲皮素及山柰酚對(duì)上述三種痤瘡致病菌的體外抗菌效果，并通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)其治療痤瘡的作用機(jī)制。

研究結(jié)果顯示槲皮素及山柰酚對(duì)三種菌均有較好抗菌活性；二者對(duì)S aureus和S.epidermidis更加敏感，C.acnes次之，這提示其在痤瘡治療中可能有更全面的抗菌效果。槲皮素對(duì)三種菌的MIC≤78.13 mg/L，MBC≤156.25 mg/L；山柰酚對(duì)S aureus和S.epidermidis的MIC≤39.06 mg/L，MBC≤78.13 mg/L，對(duì)C.acnes的MIC≤78.13 mg/L，MBC≤156.25 mg/L。國(guó)外研究［24］得出槲皮素及山柰酚對(duì)克林霉素敏感及耐藥C.acnes的MIC分別為≤32 mg/L、≤64 mg/L。雖然抗菌實(shí)驗(yàn)可能受藥品、提取方式、菌株及培養(yǎng)條件等影響，但總體而言，本研究結(jié)果和既往同類研究具有較好可比性。其它具有抗菌作用的植物制劑，如滇重樓提取物、山竹提取物等［25］，受限于提取工藝，提取物成分復(fù)雜等，對(duì)C.acnes的MIC 多為g/L 級(jí)別，本研究采用植物單體成分，得出MIC為mg/L，抗菌作用強(qiáng)于大多數(shù)植物提取物，對(duì)痤瘡治療具有潛在價(jià)值。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析獲得藥物與痤瘡97 個(gè)交集靶點(diǎn)及蛋白互作關(guān)系，篩選出JUN、RELA、TNF、IL-6、IL-10、IL-1β、CCL2、IL-1A 共8 個(gè)核心靶點(diǎn)。構(gòu)建KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)許多通路在痤瘡炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用，其中代表性通路有TNF 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路等。核心靶點(diǎn)JUN、RELA、TNF、IL-6 等在上述通路富集，控制痤瘡基因的表達(dá)。

TNF和IL-17信號(hào)通路是炎癥經(jīng)典通路，痤瘡作為一種炎癥性皮膚病，與單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的多種炎性因子有關(guān)，IL-1α、IL-6、IL-8 及TNF-α 是啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答的關(guān)鍵，可促進(jìn)毛囊口過(guò)度角化及痤瘡特征性炎性皮損［26］。絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）是廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞中的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，主要作用是將細(xì)胞外刺激信號(hào)轉(zhuǎn)至胞內(nèi)及胞核中，引起細(xì)胞增殖分化、凋亡和應(yīng)激等效應(yīng)［27］。MAPK 信號(hào)通路主要有4 條：細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、jun 氨基末端激酶（JNKs）、p38 和ERK5［28］。p38-MAPK 和JNK-MAPK 通過(guò)磷酸化激活，并促進(jìn)下游底物磷酸化來(lái)快速傳遞信號(hào)，激活的MAPK 能促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1α、IL-6等炎性因子，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［29-30］。Lim等［31］通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)槲皮素可抑制C.acnes刺激的人角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）、人單核細(xì)胞（THP-1）和鼠巨噬細(xì)胞系（RAW）264.7 中IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α的產(chǎn)生和mRNA 的表達(dá)水平；其次，槲皮素降低了C.acnes刺激的HaCaT 和THP-1 細(xì)胞中ERKs、JNKs 和p38 磷酸化；此外，槲皮素顯著減輕C.acnes誘導(dǎo)的痤瘡小鼠的炎癥反應(yīng)［31］。

NF-κB是一種調(diào)節(jié)多種炎癥反應(yīng)表達(dá)的誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子，許多參與早期免疫反應(yīng)及各階段炎癥反應(yīng)的分子都受其調(diào)控［32］。TNF-α、IL-6、IL-8 等20 余種炎性因子可被NF-κB 激活，促使大量中性粒細(xì)胞聚集于炎癥反應(yīng)部位；此外NF-κB 還促進(jìn)TNF-α、IL-1β 等細(xì)胞因子表達(dá)，反之細(xì)胞因子也能刺激NFκB 進(jìn)一步活化，讓炎癥反應(yīng)持續(xù)和放大［29］。Liu等［33］發(fā)現(xiàn)山柰酚能夠通過(guò)抑制活性氧依賴性MAPKs-NF-κB 信號(hào)通路，減少促炎因子IL-18 和IL-1β的釋放，降低氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。

分子對(duì)接結(jié)果示槲皮素和山柰酚與4個(gè)核心靶點(diǎn)蛋白JUN、RELA、TNF、IL-6 對(duì)接的結(jié)合自由能均<-20.92 kJ/mol，表明兩種化合物與核心靶點(diǎn)蛋白形成的構(gòu)象穩(wěn)定，結(jié)合活性較高，驗(yàn)證了槲皮素和山柰酚對(duì)痤瘡的治療作用。

綜上，槲皮素及山柰酚對(duì)三種痤瘡致病菌有較強(qiáng)抗菌作用，且與藥物濃度存在顯著相關(guān)性；綜合文獻(xiàn)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究顯示槲皮素在痤瘡的抗炎癥TNF 信號(hào)通路，山柰酚通過(guò)抑制活性氧依賴性MAPKs-NF-κB 信號(hào)通路發(fā)揮作用，且二者治療痤瘡具有多靶點(diǎn)多通路協(xié)同特點(diǎn)。這兩種中藥成分治療痤瘡的核心靶點(diǎn)及通路值得進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；并開(kāi)展療效相關(guān)臨床試驗(yàn)，以上是我們未來(lái)的研究方向。

（本文圖3～7見(jiàn)插圖10-6）