趙向陽，余秀萍，吳瑋，崔燦，孫婷婷，郭明飛

作者單位：1安徽省宿州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，安徽 宿州 234000；2宿州市市場(chǎng)監(jiān)督管理局，安徽 宿州 234000

甜葉菊［Stevia rebaudiana（Bertoni）Hemsl］又名甜菊葉、甜茶、甜菊草是菊科、甜葉菊屬多年生草本植物［1］。原產(chǎn)地是南美洲巴拉圭東北部與巴西接壤的阿曼拜山脈，我國于20 世紀(jì)70 年代從日本引入栽培［2］。目前我國北京、河北、陜西、江蘇、福建、湖南、云南等27 個(gè)地區(qū)均有引種［3］。甜葉菊葉中含有多種活性成分，包括糖苷類［4-5］、綠原酸類［6］、多酚類［7］、黃酮類等。其中甜菊糖苷具有低熱量、高甜度的特性［8］，作為天然甜味劑被廣泛地應(yīng)用于食品、飲料和醫(yī)藥等行業(yè)［9］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，甜葉菊具有抗氧化［10］、抗菌、治療糖尿病、控制血糖、降低血壓、抗腫瘤［11］、抗癌、抗腹瀉、提高免疫力［12］，促進(jìn)新陳代謝、保護(hù)心臟［13］等藥理作用。有研究［13］表明，甜葉菊提取物能夠通過改變高脂飲食誘導(dǎo)腸道菌群，從而達(dá)到抑制血脂血糖升高的作用。相關(guān)研究［14］顯示，甜葉菊水提物可對(duì)白化大鼠糖尿病的抗糖尿病作用。同時(shí)，甜葉菊糖苷對(duì)控制肥胖癥、調(diào)節(jié)胃酸、恢復(fù)神經(jīng)疲勞有很好的功效，對(duì)心臟病有顯著療效［15］，最重要的是它可消除蔗糖的副作用。

目前，由于中草藥的質(zhì)量受限于地理環(huán)境以及溫度氣候等問題，導(dǎo)致目前的中草藥質(zhì)量難以控制。而《中國藥典》尚未收載甜葉菊，各地方中藥材標(biāo)準(zhǔn)和炮制規(guī)范［16-19］中也僅對(duì)甜葉菊的性狀、顯微和薄層鑒別作了定性要求，并未對(duì)指標(biāo)成分做定量測(cè)定，缺少對(duì)甜葉菊的質(zhì)量控制依據(jù)。2020 年10 月至2021年12月，本研究以2020年版《中國藥典》的方法和要求為指導(dǎo)，對(duì)收集到的10 批甜葉菊藥材的性狀、鑒別、檢查、浸出物、含量測(cè)定進(jìn)行系統(tǒng)研究，為全面控制該藥材的質(zhì)量提供了有效依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Leica DM1000 顯微鏡；瑞士卡瑪CAMAG Visualizer 2 薄層成像系統(tǒng)；德國賓德FP240 型精密干燥箱；合肥科晶KSL-1200X-M 高溫箱式爐；1260VWD高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；梅特勒AB-135S 電子天平（0.01 mg）；賽多利斯BSA 124S 電子天平（0.1 mg）；湖北鼎泰高DTA-27 超聲波清洗器。

1.2 試藥甜菊苷對(duì)照品（批號(hào)111515-201803，鑒別用）及甜葉菊對(duì)照藥材（批號(hào)121238-200603，鑒別用）均來源于中國食品藥品檢定研究院，甜菊苷對(duì)照品（批號(hào)MUST-20070310，純度99.06%）及萊苞迪苷A 對(duì)照品（批號(hào)RFS-T00602008024，純度99.67%）均購買于成都曼思特生物科技有限公司。甜葉菊樣品10批，其中安徽省中藥材標(biāo)準(zhǔn)起草領(lǐng)導(dǎo)小組提供6 批，宿州市埇橋區(qū)群富甜葉菊合作社采集2 批，亳州康美藥材市場(chǎng)購買2 批。實(shí)驗(yàn)中所用試劑乙腈為色譜純（美國天地有限公司），水為娃哈哈純凈水，其余分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀及鑒別［20］

2.1.1甜葉菊形態(tài)表征 本品多破碎或皺縮，草綠色，完整葉片展平后呈倒卵形至寬披針形，長(zhǎng)4.5～9.5 cm，寬1.5～3.5 cm；先端鈍，基部楔形；中上部邊緣有粗鋸齒，下部全緣；三出脈，中央主脈明顯，兩面均有柔毛；具短葉柄，葉片常下延至葉柄基部；葉革質(zhì)，質(zhì)脆易碎。氣微，味極甜。粉末呈暗綠色或黃綠色。表皮細(xì)胞較大，形狀不規(guī)則。單列式的多細(xì)胞線狀非腺毛由5～12 個(gè)細(xì)胞組成，50～150 μm，稍彎曲。導(dǎo)管多為螺紋導(dǎo)管，直徑為15～45 μm，也可見網(wǎng)紋導(dǎo)管。見圖1。

圖1 甜葉菊表征:A為甜葉菊；B、C、D為顯微鏡200倍下甜葉菊表皮細(xì)胞、導(dǎo)管、非腺毛

2.1.2TLC鑒別 取本品粉末0.5 g，精密稱定，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，為供試品溶液。另取甜葉菊對(duì)照藥材0.5 g，同法制得對(duì)照藥材溶液。再取甜菊苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 毫升各含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對(duì)照藥材溶液各5 μL，對(duì)照品溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7.5∶4∶0.5）為展開劑，于濕度低于70%環(huán)境下展開，取出，晾干，噴以50%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖2。

圖2 甜葉菊TLC色譜圖（溫度20 ℃,RH=55%）

2.2 水分、總灰分、浸出物檢查按《中國藥典》

2020年版四部通則對(duì)10批藥材樣品進(jìn)行水分、總灰分、浸出物測(cè)定。結(jié)果10 批藥材樣品的水分在8.5%～10.6%，總灰分在5.5%～9.0%，酸不溶性灰分在0.5%～1.6%，醇溶性溶出物在44.5%～54.9%。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：島津

Shim-pack GIST（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（35∶65）；設(shè)置總流速為：0.5 mL/min。進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：40 ℃；結(jié)果顯示，此色譜條件下，供試品色譜圖中雜質(zhì)峰對(duì)主峰無干擾，甜菊苷和萊苞迪苷A 的分離度大于1.5，峰對(duì)稱因子在0.90～1.10，理論塔板數(shù)以甜菊苷計(jì)>5 000，對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5 次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不過1.5%。色譜圖見圖3，4。

圖3 混合對(duì)照品溶液色譜圖

圖4 甜葉菊供試品溶液色譜圖

2.3.2溶液的制備 混合對(duì)照品溶液制備：精密取萊苞迪苷A對(duì)照品40.23 mg置20 mL量瓶中，加50%乙醇溶解，超聲60 min，制成濃度為2.011 5 g/L 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密稱取甜菊苷對(duì)照品27.92 mg置20mL 量瓶中，制成濃度為1.396 g/L 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取萊苞迪苷A對(duì)照品和甜菊苷對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加50%乙醇制成每1 mL 含萊苞迪苷A 1.0 mg和甜菊苷0.5 mg的混合溶液，即得混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：取本品粉末0.5 g，精密稱定，置平底燒瓶中，加入50%乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流60 min，冷卻至室溫，稱重，用提取溶劑補(bǔ)足缺失重量，搖勻，濾過取濾液，即得供試品溶液。

2.3.3色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：島津Shim-pack GIST（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（35∶65）；設(shè)置總流速為：0.5 mL/min。進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：40 ℃；結(jié)果顯示，此色譜條件下，供試品色譜圖中雜質(zhì)峰對(duì)主峰無干擾，甜菊苷和萊苞迪苷A 的分離度大于1.5，峰對(duì)稱因子在0.90～1.10，理論塔板數(shù)以甜菊苷計(jì)>5 000，對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5 次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不過1.5%。色譜圖見圖3，4。

2.3.4線性關(guān)系考察 取“2.3.2”項(xiàng)下萊苞迪苷A和甜菊苷標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，以50%乙醇為溶劑分別成稀釋成萊苞迪苷A 和甜菊苷標(biāo)準(zhǔn)品系列對(duì)照品溶液。取系列對(duì)照品溶液，分別按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量濃度（X，g/L）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行線性回歸。結(jié)果萊苞迪苷A 和甜菊苷分別在0.10～2.01（r=0.999 7）、0.10～1.171（r=0.999 9）g/L 范圍內(nèi)呈良好線性，線性回歸方程分別為Y=1 129.9X+14.836和Y=1 311.4X-4.544 7。

2.3.5精密度考察 取“2.3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，分別測(cè)得萊苞迪苷A 峰面積為1 146.42、1 145.61、1 145.12、1 153.60、1 147.90、1 147.21，RSD為0.27%（n=6）。甜菊苷峰面積為508.02、507.81、508.20、509.02、507.82、507.88，RSD為0.09%（n=6），RSD小于2%，表明儀器精密度良好。

2.3.6重復(fù)性試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取同一甜葉菊樣品6份，按“2.3.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，所得峰面積代入“2.3.5”線性方程分別求算兩成分含量，結(jié)果顯示，6 份甜葉菊樣本中萊苞迪苷A 的含量分別為8.17%、8.27%、8.24%、8.30%、8.27%、8.31%，RSD 為0.58%（n=6）。甜菊苷的含量分別為5.30%、5.32%、5.33%、5.36%、5.34%、5.38%，RSD 為0.45%（n=6），RSD 小于2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.7穩(wěn)定性考察 取0.5 g 甜葉菊樣本，精密稱定，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備的甜葉菊供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、4、8、12、16、20、24 h測(cè)定，記錄色譜圖峰面積。結(jié)果，萊苞迪苷A峰面積RSD 為0.69%，甜菊苷峰面積RSD 為0.30%，RSD小于2%，表明在該方法下制備的甜葉菊中萊苞迪苷A和甜菊苷具有較好的穩(wěn)定性。

2.3.8回收率試驗(yàn) 精密稱取甜葉菊T1 樣品0.25g，平行6份，按表6分別加入萊苞迪苷A和甜菊苷對(duì)照品適量，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，計(jì)算回收率。見表1。結(jié)果顯示，萊苞迪苷A 的平均回收率為98.5%，RSD為0.30%；甜菊苷的平均回收率為98.1%，RSD 為0.45%，RSD小于2%，表明回收率良好。

表1 甜葉菊回收率試驗(yàn)（n=6）

2.3.9樣品含量測(cè)定 取收集的10 批樣品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，取“2.3.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和上述供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算求得萊苞迪苷A 和甜菊苷含量，含量結(jié)果見表2。

表2 10批甜葉菊樣品的含量

3 討論

3.1 薄層鑒別條件的優(yōu)化參照《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范》2019年版［19］中甜葉菊薄層色譜鑒別方法，以甜菊苷對(duì)照品和甜葉菊對(duì)照藥材為對(duì)照，先后考察了不同廠家和型號(hào)薄層板、樣品提取方法、點(diǎn)樣量、顯色劑、展開劑比例等條件，最終選取德國Merck硅膠G 薄層板，以三氯甲烷-甲醇-水（7.5∶4.0∶0.5）為展開劑，顯色劑為50%硫酸乙醇溶液，與原方法相比，各成分分離度更加好，且斑點(diǎn)清晰，Rf值適中。

3.2 含量測(cè)定條件的優(yōu)化

3.2.1色譜條件優(yōu)化 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［21-23］，目前測(cè)定甜菊苷和萊苞迪苷A 的含量，主要有兩種填料色譜柱：C18柱和氨基柱。相比于C18分離柱，氨基柱分離效果更好，但重現(xiàn)性和峰形不好，故選擇C18柱測(cè)定。實(shí)驗(yàn)通過對(duì)色譜柱溫度、流速、進(jìn)樣體積、流動(dòng)相種類、流動(dòng)相比例的優(yōu)化，達(dá)到了最佳的分離度和峰形，確定了色譜條件。與文獻(xiàn)方法相比，在該條件下，峰形最優(yōu)、分離度均能穩(wěn)定達(dá)到1.6以上。

3.2.2提取方法的優(yōu)化 先后考察不同提取溶劑和提取方式對(duì)甜葉菊中甜菊苷和萊苞迪苷A含量的影響，分別使用水、甲醇、50%甲醇、乙腈∶水（30∶70）、無水乙醇、50%乙醇作為溶劑，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。結(jié)果以水、50%甲醇和50%乙醇作為溶出介質(zhì)時(shí)效果最佳，無水乙醇溶出最低。相比其他溶劑，雜峰少，峰形好，但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用水提取難過濾，易生成絮狀物，故將水排除。相比甲醇和乙腈，乙醇沒有毒性，故選擇了50%乙醇作為提取溶劑。以50%乙醇為提取溶劑，分別考察加熱回流和超聲兩種提取方式，結(jié)果表明回流比超聲提取充分，故本研究最終選定回流為提取方式。

4 結(jié)論

本研究分析了甜葉菊的性狀和顯微鑒別，建立了TLC 鑒別方法及用HPLC 測(cè)定甜菊苷和萊苞迪苷A 含量的方法，初步完成了甜葉菊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究工作。結(jié)果表明，本方法操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性、穩(wěn)定性好，為甜葉菊藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)和監(jiān)督提供了參考依據(jù)。

（本文圖1，2見插圖10-2）