買(mǎi)占海，周 軻，沙婭·奴爾蘭，魏彥明，況 玲

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；3.伊犁州動(dòng)物疾病預(yù)防與控制中心，伊寧 835800）

馬腺疫是由馬鏈球菌引起的急性傳染病，是造成全球馬業(yè)福利和經(jīng)濟(jì)損失的主要原因，該疾病最早由Jordanus Ruffus報(bào)道的[1]，其發(fā)病特點(diǎn)為易造成0.5～2歲馬駒發(fā)病，出現(xiàn)發(fā)熱，流鼻涕和頭頸部淋巴結(jié)膿腫。在嚴(yán)重的情況下，下頜或咽下淋巴結(jié)的腫脹可能會(huì)壓迫呼吸道限制呼吸，其臨床特征賦予了該病稱(chēng)“馬腺疫”一詞[2]，且康復(fù)后存在復(fù)發(fā)的可能性。目前，該病幾乎在全世界呈現(xiàn)蔓延趨勢(shì)[3]，直接影響馬的生長(zhǎng)、發(fā)育及繁殖，甚至嚴(yán)重阻礙了馬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

馬鏈球菌獸疫亞種（Streptococcus.equisubsp.zooepidemicus,SEZ）和馬亞種（Streptococcusequi subsp.equi,SEE）的病原菌是馬屬動(dòng)物臨床上分離率最高的兩種型，而SEE是由SEZ變異而來(lái)的，其分類(lèi)上與SEZ非常相近[4-5]。目前發(fā)現(xiàn)SEE和SEZ在基因?qū)W上具有92% DNA同源性[6]。纖維連接蛋白（Fibronectin,FN）是一種大分子糖蛋白，存在于脊椎動(dòng)物細(xì)胞外基質(zhì)和體液中，與機(jī)體內(nèi)的纖粘蛋白相結(jié)合[7]。鏈球菌產(chǎn)生幾種附著在細(xì)菌細(xì)胞壁上的纖連蛋白結(jié)合蛋白，其fneB毒力基因被發(fā)現(xiàn)包含一個(gè)堿基缺失，這導(dǎo)致C端細(xì)胞壁錨定域的丟失，并產(chǎn)生分泌截短纖維連接蛋白結(jié)合蛋白FNE，增強(qiáng)了鏈球菌的入侵潛力。馬鏈球菌還具有許多在動(dòng)物鏈球菌中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的噬菌體相關(guān)的細(xì)菌超抗原，這些超抗原被認(rèn)為與MHC II類(lèi)抗原和T細(xì)胞受體分子同時(shí)結(jié)合，刺激T細(xì)胞和免疫反應(yīng)，隨后釋放IL1、IL2、TNF-β和IL6等促炎細(xì)胞因子導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，患畜出現(xiàn)發(fā)熱、中性粒細(xì)胞增多和血漿纖維蛋白原增加[2]。fneB常作為菌體表面起黏附作用的毒力蛋白，現(xiàn)有研究表明，PCR技術(shù)可以檢測(cè)fneB基因[8]。但到目前為止，國(guó)內(nèi)關(guān)于SEE的fneB基因分子方面的研究鮮有報(bào)道。本研究對(duì)新疆伊犁地區(qū)SEE與SEZ進(jìn)行分離株的分離和鑒定，并通過(guò)對(duì)患病馬血常規(guī)指標(biāo)的檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)分析，以期為新疆地區(qū)馬鏈球菌疾病的科學(xué)防控、診斷提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 革蘭氏快速染色液、pMD-19T、感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；2×TaqPCR Green Mix、ddH2O、DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；陽(yáng)性SEE菌株N20和N25由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

1.2 病料采集 新疆昭蘇縣某三個(gè)馬場(chǎng)疑似發(fā)生馬腺疫，采集臨床特征具有精神沉郁，高燒，頭頸部淋巴結(jié)腫大，食欲下降，大量流漿液性甚至黏液性鼻涕患病馬駒的鼻拭子。首先將2根醫(yī)用無(wú)菌棉簽用裝有2 mL高壓滅菌的PBS液浸濕，深入患病馬駒鼻腔內(nèi)沾取鼻內(nèi)分泌物，或者無(wú)菌采集破潰淋巴結(jié)膿汁，將采集好的鼻拭子樣品從手接觸部位折斷后放入1.5 mL含PBS液的無(wú)菌EP管內(nèi)，并做好標(biāo)記。三個(gè)馬場(chǎng)（A馬場(chǎng)、B馬場(chǎng)、C馬場(chǎng)）采集鼻拭子和血樣分別為14份（A1～A14）、10份（B1～B10）、14份（C1～C14），以及C馬場(chǎng)2份頜下淋巴結(jié)破潰的膿汁，共40份；除患病馬匹樣品外，另在三個(gè)馬場(chǎng)各采集5匹健康馬的血樣15份（D1-D15），健康馬血清樣品共53份。

1.3 細(xì)菌的分離與培養(yǎng) 分別吸取從臨床采集的40份疑似患馬腺疫的樣品各200 μL，加至10 mL含有5%胎牛血清的THB液體培養(yǎng)基中，37℃、180 rpm恒溫震蕩培養(yǎng)24 h，在無(wú)菌操作臺(tái)上吸取20 μL增菌液劃線(xiàn)接種于5%綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。觀(guān)察鮮血培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，用接種環(huán)挑出具有β溶血的單個(gè)菌落，在鮮血培養(yǎng)基上劃線(xiàn)進(jìn)行細(xì)菌的純化，直至培養(yǎng)基上無(wú)雜菌。

1.4 形態(tài)學(xué)觀(guān)察及生化鑒定 挑取1株純化后穩(wěn)定的β溶血單菌落，對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色并觀(guān)察其形態(tài)特征；將PCR鑒定為陽(yáng)性的菌株分別加至鏈球菌生化編碼鑒定管中，觀(guān)察各鑒定管的顏色變化，結(jié)合《鏈球菌生化編碼鑒定手冊(cè)（GYZ-12ST）》進(jìn)行結(jié)果判定。

1.5 PCR擴(kuò)增 根據(jù)NCBI收錄SEE的4047個(gè)全基因組中fneB的基因序列，應(yīng)用DNAStar設(shè)計(jì)其引物[9]，SEE菌株的PCR擴(kuò)增序列和反應(yīng)運(yùn)行體系見(jiàn)表1[10]。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：Taq聚合酶預(yù)混染料（2×TaqPCR Green Mix）12.5 μL，上、下游引物各1 μL；細(xì)菌DNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；95℃變性30 s，49℃復(fù)性30 s，72℃延伸 90 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取6 μL反應(yīng)產(chǎn)物在1×TAE緩沖液中、120 V恒壓條件下電泳30 min，然后在EB染液中浸染15 min后，在凝膠成像系統(tǒng)上觀(guān)察結(jié)果。

表1 本研究所用引物[10]Table 1 Primers used in this study[10]

1.6fneB基因的測(cè)序鑒定 根據(jù)膠回收試劑盒的操作說(shuō)明回收PCR產(chǎn)物。PCR膠回收產(chǎn)物5 μL、SolutionⅠ 5 μL、pMD19-T 1 μL、Control Insert 3 μL混勻后16℃過(guò)夜連接，將連接產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 血涂片檢查及血常規(guī)指標(biāo)測(cè)定 采集疑似患病馬匹血液，立即制備血液涂片：取1滴鮮血至載玻片上，將其推成舌狀，在光鏡下清晰可見(jiàn)紅細(xì)胞不黏連，每匹馬涂3張進(jìn)行備用。用EDTA抗凝采血管采集5 mL血液，輕輕搖勻，使抗凝劑與血液充分混合均勻，留作血細(xì)胞分析待用。

1.8 數(shù)據(jù)分析 用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)血常規(guī)數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本檢驗(yàn)分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)表示差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”表示。

2 結(jié)果與討論

馬腺疫是最常見(jiàn)的馬呼吸道疾病之一，病原菌為SEE，是一種革蘭氏陽(yáng)性的β溶血細(xì)菌[11]。該病在世界各地馬屬動(dòng)物身上均有暴發(fā)，嚴(yán)重影響馬匹健康和制約著馬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，給養(yǎng)殖戶(hù)及馬場(chǎng)等企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[12]。帶菌馬匹已被認(rèn)定是維持病原體長(zhǎng)期存在且容易造成感染的關(guān)鍵因素，其發(fā)病率高達(dá)100%，死亡率達(dá)10%[13-14]。病原菌通過(guò)病馬咳嗽、膿汁等持續(xù)向外排毒，隨后與健康馬匹接觸而被感染[15]。鼻咽拭子的微生物學(xué)和PCR篩查能夠有效鑒定是否感染SEE，也可以通過(guò)血清學(xué)方法鑒定[16-17]，此外還可以應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）檢測(cè)全長(zhǎng)SeM蛋白的血清抗體來(lái)進(jìn)行診斷（http://www.idexx.com/equine/laboratory/sequi elisa/），但對(duì)于亞臨床性疾病的診斷并不可靠[2]。

2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)SEE菌株具有β溶血的特點(diǎn)也是初步鑒定馬鏈球菌的手段之一，40份樣品中分離出8株形態(tài)單一穩(wěn)定的樣品有溶血現(xiàn)象，其中7株呈β溶血，1株呈α溶血（圖1）。細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀(guān)察可知，革蘭氏染色鏡檢中6株為β溶血菌株呈藍(lán)色鏈狀排列的球菌（圖2a），而另1株為β溶血菌株呈藍(lán)色桿狀（圖2b）；α溶血的菌呈藍(lán)色鏈狀排列均為陽(yáng)性（圖2c）。將1株α溶血菌和7株β溶血菌送至北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)鏈球菌生化鑒定管A203對(duì)7株呈陽(yáng)性菌進(jìn)行生化檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2和圖3。由于SEE含有溶血素，具有β溶血的特征，通過(guò)SEE不能發(fā)酵蕈糖（海藻糖）、乳糖或山梨醇，而SEZ通常能夠發(fā)酵蕈糖、乳糖或山梨醇，因此很容易區(qū)分SEE和SEZ。但使用該方法分離和鑒定馬鏈球菌非常耗時(shí)，從收到臨床樣本起至少需要48 h，而PCR技術(shù)能夠有效避免細(xì)菌生化試驗(yàn)培養(yǎng)的不足，因此它不再是檢測(cè)馬鏈球菌或診斷馬腺疫的金標(biāo)準(zhǔn)方法[18]。本研究通過(guò)分離出的7株馬源鏈球菌是否發(fā)酵蕈糖、蔗糖或山梨醇，即可初步診斷7株菌的分型，結(jié)果只有分離株A13能夠發(fā)酵蕈糖和蔗糖，其余菌均不能發(fā)酵蕈糖即可初步診斷分離株A13為SEZ，而其余6種菌為SEE，但需PCR進(jìn)一步確定和測(cè)序分析其同源性。

圖1 細(xì)菌在培養(yǎng)基上呈β溶血Fig.1 Bacteria were β-hemolytic on the midium

圖2 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.2 Bacteria were β-hemolytic on the medium

圖3 分離菌的生化鑒定結(jié)果Fig.3 Biochemical characters of bacteria

2.2fneB基因擴(kuò)增和同源性分析 根據(jù)表1中的fneB引物，陽(yáng)性對(duì)照菌為N20，對(duì)7株疑似SEE菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，7株菌均在1428 bp處擴(kuò)增出目的條帶，回收7株菌膠回收產(chǎn)物連接并送測(cè)序（圖4）。

圖4 fneB基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 The PCR amplification of fneB gene

7株疑似SEE分離菌株源于A(yíng)馬場(chǎng)、C馬場(chǎng)，對(duì)疑似的7株菌拼接后提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)與其相似度較高的序列并進(jìn)行下載，利用MegAlign的Clustal W和GenBank登錄的SEE同源性基因序列與7株分離株測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較，其中6株菌之間的核苷酸和氨基酸同源性均高達(dá)90%～99%（圖5，圖6）；6株分離菌株與美國(guó)源馬亞種（GenBank：CP021972.1）、瑞典源馬亞種（GenBank：AY898649.2）核苷酸同源性最高，達(dá)96%～99%[9]；分離的6株菌株分別來(lái)源于A(yíng)馬場(chǎng)的A8菌株和C馬場(chǎng)的C2、C6、C9、C14和C16共5株菌株，可能為SEE菌株，而另1株A馬場(chǎng)的A13菌株與其余6株分離株的同源性為76%～85%，用BLAST對(duì)其序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明A13菌株與SEZ（H70）菌株的序列相似度為95%，該序列（GenBank登錄號(hào)：FM204884.1），與SEE（ATCC 39506）的序列相似度為94%，該序列登錄號(hào)為（GenBank：CP021972.1）。分離的6株菌株與SEE菌株聚為一支，分離株A13先與SEZ菌株聚為一支，然后伸展與SEE菌株聚為一支，并且遺傳親緣性較近，并根據(jù)生化反應(yīng)中SEZ能發(fā)酵蕈糖和蔗糖等特點(diǎn)，分離株A13可能為SEZ菌株，見(jiàn)圖7。7株分離菌株均以fneB基因?yàn)镻CR靶基因，據(jù)Lannerg?rd等[8]報(bào)道，以fneB基因?yàn)槟康幕蜻M(jìn)行PCR檢測(cè)，10株SEZ菌株中可以檢測(cè)到3株SEE菌株，經(jīng)細(xì)菌生化試驗(yàn)及PCR測(cè)序可知，A馬場(chǎng)分離株A8菌株為SEE菌株，A13菌株為SEZ菌株，表明該馬場(chǎng)的馬腺疫疾病是由SEE和SEZ混合感染引起，而C馬場(chǎng)分離到的5株菌C2、C6、C9、C14和C16生化反應(yīng)結(jié)果及PCR檢測(cè)均符合SEE菌株特點(diǎn)，表明該馬場(chǎng)發(fā)生的馬腺疫是由SEE引起。

圖5 分離株fneB基因核苷酸同源性分析Fig.5 Isolates fneB gene of nucleic acid homology analysis

圖7 分離株fneB基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.7 Isolates fneB gene of phylogenetic tree

2.3 血常規(guī)指標(biāo)測(cè)定 為了排除干擾，選擇已經(jīng)確診為鏈球菌感染患馬的血樣進(jìn)行分析，與健康馬相比，患病馬的白細(xì)胞總數(shù)極顯著升高，白細(xì)胞總數(shù)升高大多數(shù)見(jiàn)于細(xì)菌性疾病和炎癥性疾病，如炭疽、腺疫、巴氏桿菌病、蜂窩織炎等，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合，患病馬匹白細(xì)胞總數(shù)高于健康馬。粒細(xì)胞數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)顯著升高，表明患馬腺疫時(shí)以淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞的增多為主。淋巴細(xì)胞是重要的免疫活性細(xì)胞，增多常見(jiàn)于感染性疾病、急性傳染病的恢復(fù)期及淋巴性白血病[19-20]?；疾●R的淋巴細(xì)胞數(shù)量增多推測(cè)可能與感染馬頜下淋巴組織受損破壞有關(guān)，也不排除病馬多處于恢復(fù)期而導(dǎo)致的淋巴細(xì)胞數(shù)量增多。單核細(xì)胞增多常見(jiàn)于急性感染性疾病，如結(jié)核病、布魯菌病及某些霉菌感染和大多數(shù)伴有肉芽腫性反應(yīng)的疾病，也見(jiàn)于疾病急性感染的恢復(fù)期，推測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中單核細(xì)胞數(shù)目的升高與馬腺疫疾病恢復(fù)期、新生肉芽腫的生成有關(guān)。患病馬與健康馬相比HCT升高，說(shuō)明患病馬可能有脫水的癥狀，導(dǎo)致血液濃縮，常見(jiàn)的血液濃縮的原因包括疾病感染和發(fā)熱，馬腺疫病程中有典型、持續(xù)的體溫升高變化，可能是造成患馬HCT高于健康馬的主要原因之一。

2.4 血涂片檢查 通過(guò)血涂片檢查，可以觀(guān)察到同視野中白細(xì)胞數(shù)目明顯增加，尤其是中性粒細(xì)胞數(shù)目明顯增加（圖8A）；且出現(xiàn)核分葉明顯，中性粒細(xì)胞過(guò)于成熟，呈核右移的現(xiàn)象（圖8B）。

圖8 血涂片檢查Fig.8 Blood routine examination

本研究從新疆伊犁3個(gè)馬場(chǎng)中分離出了7株馬鏈球菌，通過(guò)同源性結(jié)果分析可知，其中6株為SEE菌株，而另1株為SEZ菌株，由此說(shuō)明新疆伊犁地區(qū)存在SEE和SEZ的混合感染，今后需加強(qiáng)伊犁地區(qū)馬腺疫疫病的防控。