胡 怡，徐 歡，杜志強(qiáng)，朱玲玲，汪 婷，殷世彬，汪 威，汪招雄

（長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，荊州 434025）

鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）是一種能引起蛋鴨產(chǎn)蛋量下降，卵泡膜出血的單股正鏈RNA病毒[1]。自2010年開(kāi)始，國(guó)內(nèi)部分鴨場(chǎng)陸續(xù)暴發(fā)了鴨坦布蘇病毒病，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。DTMUV是黃病毒科黃病毒屬成員，能感染鴨、雞、鵝、鴿子等[2]。Tang等[3]在鴨場(chǎng)員工血清中檢測(cè)到了DTMUV抗體，表明其對(duì)人具有潛在威脅性。該病毒的開(kāi)放性閱讀框（open reading frame,ORF），編碼產(chǎn)生了一個(gè)長(zhǎng)為3425個(gè)氨基酸的多肽，在宿主和病毒蛋白酶的作用下，水解為C、prM、E、NS1、NS2A、NS3、NS4A和NS5蛋白。其中C、prM、E蛋白為該病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，其他為非結(jié)構(gòu)蛋白[4]。

DTMUV的E蛋白是重要的免疫原性蛋白，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[5]，是研究亞單位疫苗的重要蛋白。研究結(jié)果表明，E蛋白在病毒的組織嗜性、神經(jīng)毒性、介導(dǎo)病毒與細(xì)胞膜融合以及致病力等方面有著重要的作用[6-7]。通過(guò)對(duì)E蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，其研究結(jié)果將為亞單位疫苗的研發(fā)，基因功能的研究提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 毒株DTMUV E基因序列由本實(shí)驗(yàn)室分離病毒測(cè)序，由NovoPro軟件將其翻譯成氨基酸序列。

1.2 DTMUV E蛋白的理化性質(zhì)分析 利用Protparam（https://web.expasy.org/protparam）分析DTMUV E蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)等理化性質(zhì)。

1.3 DTMUV E蛋白的親疏水性分析 利用ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）在線軟件對(duì)DTMUV E蛋白進(jìn)行親疏水性分析。

1.4 DTMUV E蛋白的跨膜區(qū)分析 利用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/-TMHMM/）分析DTMUV E蛋白的跨膜區(qū)。

1.5 DTMUV E蛋白的信號(hào)肽分析 利用SignalP 4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）分析DTMUV E蛋白的信號(hào)肽。

1.6 DTMU E蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 利用Virus-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.etu.cn/bioinf/vir-us-multi/）預(yù)測(cè)DTMUV E蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.7 DTMUV E蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用SOPMA（https://prabi.ibcp.fr/htm/site/web/login/SO-PMA）預(yù)測(cè)DTMUV E蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，分析其無(wú)規(guī)律卷曲、α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈的比例。

1.8 DTMUV E蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用Phyre 2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre）在線軟件預(yù)測(cè)DTMUV E蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，運(yùn)用c5wsnC模型來(lái)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.9 DTMUV E蛋白的翻譯后修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析 分別利用NetNGlyc 1.0 Server（http://www.c-bs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）、NetAcet 1.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetAcet/）和NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預(yù)測(cè)分析DTMUV E蛋白的糖基化、乙?；土姿峄揎椢稽c(diǎn)（閾值都為0.5）。

1.10 DTMUV E蛋白的潛在抗原表位分析 利用Predicting Anti-genic Peptides（http://imed.me--d.ucm.es/Tools/antigenic.pl）在線軟件對(duì)DTMUV E蛋白的抗原決定簇進(jìn)行預(yù)測(cè)分析（閾值為0.5）。利用IEDB（http://tools.immuneepitope.org/bcell/）對(duì)DTMUV E蛋白的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析（閾值為0.35）。利用NetMHCⅡpan 3.1Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/Net-MHCⅡpan）對(duì)DTMUV E蛋白的T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。選取HLA_DRB1_0101、HLA_DRB1_0301、HLA_DRB1_0401、HLA_DRB1_0701、HLA_DRB1_0801、HLA_DRB--1_0901、HLA_DRB1_1001、HLA_DRB1_1201、HLA_DRB1_1301、HLA_DRB1_1401、HLA_DRB1_1501、HLA_DRB1_1601亞型為限定條件。

2 結(jié)果

2.1 DTMUV E蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果 DTMUV E蛋白的分子式為C2405H3757N649O723S32，相對(duì)分子質(zhì)量為54357.12。DTMUV E蛋白由501個(gè)氨基酸組成，其中包含了20種氨基酸，氨基酸的組成及比例見(jiàn)圖1。E蛋白的正負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)分別為47和46個(gè)，其理論等電點(diǎn)為7.63。E蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為26.84，低于閾值40，表明該蛋白為穩(wěn)定性蛋白。

2.2 DTMUV E蛋白的親疏水性分析結(jié)果 DTMUV E蛋白的平均親水性指數(shù)為-0.092，位于第489和490位氨基酸的疏水性指數(shù)最大，為2.700，位于第398位氨基酸的疏水性指數(shù)最小，為-2.211，且該蛋白的親水性氨基酸區(qū)域多于疏水性氨基酸區(qū)域，預(yù)測(cè)該蛋白為親水性蛋白（圖2）。

圖2 E蛋白的親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.2 Hydrophilic and hydrophobic prediction of E protein

2.3 DTMUV E蛋白的跨膜區(qū)分析結(jié)果 如圖3所示，E蛋白有兩個(gè)跨膜螺旋區(qū)，分別位于452～474位和481～499位。

圖3 E蛋白跨膜螺旋區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.3 Predicted results of E protein transmembrane helical region

2.4 DTMUV E蛋白的信號(hào)肽分析結(jié)果 如圖4所示C值（剪切位點(diǎn)）和Y值（綜合S值和C值）均在第18位氨基酸達(dá)到最大，分別為0.169和0.134，S值（信號(hào)肽）第1～17位氨基酸的平均值為0.119，Y值與S值均小于閾值0.5，預(yù)測(cè)該蛋白沒(méi)有信號(hào)肽結(jié)構(gòu)。

圖4 E蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.4 Prediction results of E protein signal peptide

2.5 DTMUV E蛋白的亞細(xì)胞定位分析結(jié)果 預(yù)測(cè)結(jié)果表明，E蛋白定位于病毒衣殼中，表明E蛋白為囊膜蛋白。

2.6 DTMUV E蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果 如圖5所示，E蛋白中有208個(gè)氨基酸參與無(wú)規(guī)律卷曲的形成，占比最大，為41.52%；有100個(gè)氨基酸參與α-螺旋的形成，占比為19.96%；有162個(gè)氨基酸參與延伸鏈的形成，占比為32.34%；有31個(gè)氨基酸參與β-轉(zhuǎn)角的形成，占比為6.19%。

圖5 E蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.5 Secondary structure prediction results of E protein

2.7 DTMUV E蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果 E蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)模型（c5wsnC）如圖6所示，該預(yù)測(cè)模型的蛋白覆蓋率為100%，可信度為100%。

圖6 E蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型Fig.6 Tertiary structure model of E protein

2.8 DTMUV E蛋白的翻譯后修飾位點(diǎn)分析結(jié)果如圖7所示，E蛋白有18個(gè)潛在的糖基化修飾位點(diǎn)，分別位于第8位、16位、47位、82位、103位、134位、154位、207位、214位、222位、235位、277位、307位、314位、347位、359位、475位和498位氨基酸。利用NetAcet軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明，E蛋白沒(méi)有乙?；揎椢稽c(diǎn)。如圖8所示，E蛋白含有24個(gè)絲氨酸磷酸化修飾位點(diǎn)，5個(gè)絡(luò)氨酸磷酸化修飾位點(diǎn)，23個(gè)蘇氨酸磷酸化修飾位點(diǎn)，包含有PKA、PKC、PKG、unsp、cdk5、p38MAPK、GSK3、SRC、CKⅠ、CKⅡ、EGFR、DNAPK、INSR、cdc2、RSK總共15類蛋白質(zhì)激酶結(jié)合位點(diǎn)。

圖7 E蛋白糖基化預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.7 Predicted results of E protein glycosylation

圖8 E蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.8 Phosphorylation site prediction results of E protein

2.9 DTMUV E蛋白的潛在抗原表位分析結(jié)果 利用Predicting Anti-genic Peptides軟件分析可知，E蛋白含有20個(gè)潛在的抗原決定簇。利用IEDB 軟件分析E蛋白的B細(xì)胞抗原表位，結(jié)果如圖9所示，連續(xù)氨基酸數(shù)量超過(guò)10個(gè)的B細(xì)胞抗原表位為62～86位、147～160位、172～183位、224～235位氨基酸。如表1所示，E蛋白的CD4+抗原表位結(jié)果中，HLA_DRB1_0801亞型的強(qiáng)結(jié)合肽最多，為15個(gè)，HLA_DRB1_0701亞型的弱結(jié)合肽最多，為52個(gè)。

表1 E蛋白CD4+抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果Table 1 Prediction results of E protein CD4+ antigen epitope

圖9 E蛋白潛在B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.9 Prediction results of potential B cell epitopes of E protein

3 討論

自2010年我國(guó)首次發(fā)現(xiàn)鴨坦蘇病毒病以來(lái)，該病對(duì)我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了比較大的經(jīng)濟(jì)損失。鴨群發(fā)病率可高達(dá)100%，雖然病死率低，但主要引起蛋鴨的產(chǎn)蛋量大幅度下降，甚至絕產(chǎn)。病鴨后期會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，導(dǎo)致淘汰率升高，是造成我國(guó)鴨出欄量下降的主要因素之一。DTMUV不僅可以感染禽類，在將病毒接種于小鼠腦內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，還會(huì)使小鼠出現(xiàn)神經(jīng)癥狀甚至死亡[8]。Tang等[31]甚至在鴨場(chǎng)員工血清中檢測(cè)到了DTMUV的中和抗體。鴨坦布蘇病毒病傳入我國(guó)以后，就迅速傳遍全國(guó)，因此開(kāi)展鴨坦布蘇病毒的研究是具有重要現(xiàn)實(shí)意義的。

E蛋白是DTMUV的重要抗原蛋白。莊育彬等[9]通過(guò)軟件預(yù)測(cè)DTMUV E蛋白含有17個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)、13個(gè)絲氨酸、4個(gè)酪氨酸和8個(gè)蘇氨酸磷酸化修飾位點(diǎn)。與本研究所預(yù)測(cè)的18個(gè)糖基化修飾位點(diǎn)、24個(gè)絲氨酸、5個(gè)酪氨酸和23個(gè)蘇氨酸磷酸化修飾位點(diǎn)有一定的出入，可能是毒株和軟件不同所導(dǎo)致。與同為黃病毒屬的乙型腦炎病毒的預(yù)測(cè)結(jié)果比較顯示其也無(wú)信號(hào)肽，有兩個(gè)跨膜螺旋區(qū)，但跨膜區(qū)域有所不同，在乙型腦炎病毒E蛋白的結(jié)構(gòu)域上具有與其毒力相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)[10]。E蛋白結(jié)構(gòu)域上也存在與毒力相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)（E367、E304、E156）[11-13]，其中E156的突變是通過(guò)破壞E蛋白位于第154位氨基酸的N聯(lián)糖基化結(jié)構(gòu)，而使DTMUV的毒力在鴨中傳播衰減。而位于E蛋白結(jié)構(gòu)域上的第408位氨基酸的突變會(huì)增強(qiáng)中和抗體反應(yīng)[14]。E蛋白結(jié)構(gòu)域上的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的突變可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的改變。DTMUV E蛋白的結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均被研究人員證實(shí)可以使小鼠產(chǎn)生抗體，并能為小鼠提供良好的免疫保護(hù)力[15-16]。余磊等[17]鑒定出了5個(gè)B細(xì)胞線性表位E25（25LEGGSCVTITAKDKPTIDVK44）、E97（97VDRGWGNG104）、E229（229SAGTW QNK236）、E349（349MTPVGRLI356）和E385（LVGSGKGQIRYQWHRSGSTI404）。張琳等[18]鑒定出了DTMUV E蛋白的一個(gè)B細(xì)胞線性表位385LVGSGKGQI393（EP385），并證明了該表位具有良好的免疫原性。李晨曦等[19]鑒定出了DTMUV E蛋白的線性抗原表位EVEPPFG，并證實(shí)了其為黃病毒共享型抗原表位。Gong等[20]用一個(gè)新的中和單克隆抗體3B8鑒定出了一個(gè)新的線性表位FSCLGMQNR。Chen等[21]鑒定出了一種新的中和性交叉反應(yīng)表位。外源性抗原E蛋白在誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)DTMUV的中和抗體中起著關(guān)鍵作用，Chen等[22]在以鴨為宿主進(jìn)行密碼子優(yōu)化的縮短的E451基因在重組鴨瘟病毒載體中表達(dá)量最高[22]。由于E蛋白具有良好的免疫原性，將E蛋白與脂質(zhì)體混合制成的亞單位疫苗的免疫效果更好[23]，E蛋白還可以與Semliki Forest virus（SFV）復(fù)制子制備成自殺性DNA疫苗，該疫苗可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，可以完全抵抗小鴨的DTMUV攻擊[24]。本研究所預(yù)測(cè)的DTMUV E蛋白中連續(xù)氨基酸數(shù)量超過(guò)10個(gè)的B細(xì)胞線性表位有4個(gè)，為B細(xì)胞抗原表位的鑒定提供了更多的可能性選擇，也為針對(duì)E蛋白進(jìn)行的相關(guān)疫苗研究提供了理論基礎(chǔ)。

本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)DTMUV E蛋白進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示E蛋白由501個(gè)氨基酸組成，為親水性蛋白，穩(wěn)定性較好；有2個(gè)跨膜螺旋區(qū)，無(wú)信號(hào)肽，且定位于病毒衣殼中的囊膜蛋白；有18個(gè)潛在的糖基化修飾位點(diǎn)、24個(gè)絲氨酸、5個(gè)酪氨酸和23個(gè)蘇氨酸磷酸化修飾位點(diǎn)；有20個(gè)潛在的抗原決定簇，有4個(gè)連續(xù)氨基酸數(shù)量超過(guò)10個(gè)的B細(xì)胞線性表位；選擇不同的亞型時(shí)，CD4+抗原表位都有多個(gè)結(jié)合肽。為進(jìn)一步研究DTMUV的亞單位疫苗、E基因的功能提供了更多的理論支持。