侯雨彤，陳玉秋，張莉莉，馬得瑩

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150001）

新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）強(qiáng)毒株感染引發(fā)的急性、高度接觸性傳染病[1]。NDV又稱禽Ⅰ型副黏病毒（Avian paramyxovirus type 1,APMV-1），屬于副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬成員。病毒基因組為單股、負(fù)鏈、不分節(jié)段的RNA[2-3]。NDV具有廣泛的宿主譜，目前為止，已經(jīng)報(bào)道至少有鸚鵡、鴿、鴕鳥、番鴨、鸕鶿、鵝、鴨等250種鳥類能夠自然或?qū)嶒?yàn)感染NDV[4]。各種家禽均可感染，其中雞和鵝發(fā)病率較高。同時(shí)病禽為此病傳染源，在其分泌物、排泄物中攜帶大量病菌，并且被病禽污染的飼料、飲水或墊料均攜帶病毒。若家禽接觸后會(huì)通過消化道、呼吸道和眼結(jié)膜傳播，進(jìn)而誘發(fā)新城疫[5]。發(fā)生該病后，病禽主要表現(xiàn)為痢疾和神經(jīng)癥狀，死禽主要特征為局部病灶出血，腸粘膜壞死，卵泡出血、淤血[6-7]。其中鴨感染該病毒的主要臨床癥狀表現(xiàn)為食欲不振、下肢麻痹、腹瀉等，與雞感染NDV后發(fā)病癥狀相似[8]。如果有細(xì)菌等混合感染（主要是大腸桿菌病和傳染性漿膜炎），會(huì)使死亡率升高[9]。但是，我們近期的研究發(fā)現(xiàn)，紹鴨感染鴨源NDV毒株后，鴨沒有臨床發(fā)病癥狀和死亡情況發(fā)生，說明NDV對(duì)不同品種鴨致病性存在差異[10]。

NDV是RNA病毒，其基因組易發(fā)生變異，導(dǎo)致其宿主的易感性經(jīng)常發(fā)生改變，并且常規(guī)的疫苗接種對(duì)一些變異毒株不能提供理想的保護(hù)效果。因此，深入探究家禽抗感染的天然免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，將對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要意義。禽防御素（Avian β-Defensin,AvBD）屬于β-防御素的一種，是一類廣泛存在于禽體內(nèi)的內(nèi)源性陽(yáng)離子抗菌肽[11]。無論是人工合成的β-防御素還是天然β-防御素，都具有廣譜抗菌、抗病毒以及免疫調(diào)節(jié)作用[12-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，鴨源NDV毒株可誘導(dǎo)紹鴨部分AvBD的表達(dá)量上調(diào)，這些反應(yīng)可能與病毒的致病性及AvBD在機(jī)體內(nèi)的抗病毒作用有關(guān)，揭示了鴨源NDV毒株感染可誘導(dǎo)紹鴨體內(nèi)產(chǎn)生天然免疫反應(yīng)[10]。NDV還可誘導(dǎo)鴿β-防御素1、2、7和10基因的表達(dá)量上調(diào)，從而增加先天性免疫系統(tǒng)對(duì)新城疫病毒的抵御[11-13]。此外，防御素也能夠激活樹突狀細(xì)胞和調(diào)節(jié)在抗原遞呈細(xì)胞中干擾素-γ（interferon,IFN-γ）的產(chǎn)生，表明它們可能在獲得適應(yīng)性免疫的過程中也起了一定的作用[11,14]。

鴨源NDV的大多數(shù)研究集中于病毒分離和鑒定，而強(qiáng)毒株感染鴨后誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)的研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)旨在探討鴨源NDV強(qiáng)毒株對(duì)番鴨的致病性，同時(shí)探究病毒感染誘導(dǎo)機(jī)體AvBD基因的表達(dá)，初步揭示新城疫病毒感染番鴨誘導(dǎo)機(jī)體的反應(yīng)，同時(shí)為AvBD在抗新城疫病毒的臨床應(yīng)用中提供初步參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與毒株 80只15日齡SPF番鴨，由哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；1%SPF雞外周血紅細(xì)胞和9日齡SPF雞胚均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；鴨源新城疫病毒Md/CH/LGD/1/2005毒株[15]由本實(shí)驗(yàn)室鑒定和保存。病毒基因組序列GenBank登錄號(hào)為KM885167，其雞胚半數(shù)感染量（50% egg infectious dose,EID50）為log108.38。1日齡雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)（intracerbral pathogenicity index,ICPI）值為1.88，雞胚平均死亡時(shí)間（mean death time,MDT）值為50 h。

1.2 主要試劑 One Step SYBR?Prime ScriptTMRTPCR KitⅡ試劑盒Cat.RR086A、ExTaqDNA聚合酶、DL100 marker、RNAiso Plus購(gòu)自Takara公司；凝膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)OMEGA公司；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇等其他試劑均為分析純。

1.3 主要應(yīng)用軟件 DNA序列分析比對(duì)應(yīng)用DNAMAN軟件；引物設(shè)計(jì)采用Oligo 7軟件。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將80只15日齡健康SPF番鴨隨機(jī)分為兩組，其中試驗(yàn)組和對(duì)照組各40只。試驗(yàn)組以滴鼻點(diǎn)眼的方式每只鴨接種107EID50/0.2 mL NDV Md/CH/LGD/1/2005株。對(duì)照組接種同劑量的滅菌PBS。兩組番鴨在接種后36 h、72 h、7 d和25 d，各取10只頸部放血處死，采集處死鴨的骨髓、脾臟、盲腸扁桃體、哈德氏腺和法氏囊五個(gè)免疫器官樣品，分別標(biāo)記，置于-70℃冰箱保存用于后續(xù)提取組織總RNA。同時(shí)，接種后36 h、72 h、7 d以及16 d、20 d和25 d采集兩組各10只番鴨的血清，用于NDV的血凝抗體檢測(cè)。

1.5 臨床及病理學(xué)變化觀察 人工感染番鴨NDV Md/CH/LGD/1/2005株后，持續(xù)觀察臨床癥狀25 d，對(duì)死亡番鴨進(jìn)行剖檢，觀察病變。并采集番鴨胸腺和脾臟組織固定于4%甲醛溶液內(nèi)，制備病理切片，進(jìn)行病理學(xué)變化觀察。死亡動(dòng)物采取與實(shí)驗(yàn)組相同的組織器官，分組標(biāo)記，置于-70℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 樣品處理及組織總RNA的提取 將采取的番鴨骨髓、脾臟、盲腸扁桃體、哈德氏腺、法氏囊凍存組織樣品各稱取100 μg，勻漿后按TRIzol法提取總RNA。最后用70 μL DEPC處理水溶解，-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 real-time RT-PCR引物設(shè)計(jì) 番鴨18S rRNA、AvBD1、AvBD3、AvBD5、AvBD6、AvBD16、AvBD4、AvBD7和AvBD12基因引物根據(jù)已發(fā)表序列設(shè)計(jì)[16-18]，均由哈爾濱博仕生物公司合成，使用前需用無菌DEPC處理水稀釋備用。

1.8 real-time RT-PCR 以番鴨各組織器官的總RNA為模板，鴨18S rRNA作為內(nèi)參基因，根據(jù)表1中設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行real-time RT-PCR檢測(cè)18S rRNA及AvBD基因表達(dá)量。將每個(gè)基因的相應(yīng)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按10倍梯度稀釋后用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)力學(xué)曲線。其中，試驗(yàn)組和對(duì)照組樣品均做10個(gè)平行，各取其平均值。引物濃度為2.5 μmol/L，熒光定量反應(yīng)體系（25 μL）為：one step buffer 12.5 μL，RNA free ddH2O 7.5 μL，Prime Script one step Enzyme Mix 1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）1 μL，Total RNA 2 μL。反應(yīng)條件為：反轉(zhuǎn)錄42℃ 5 min，95℃預(yù)變性10 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)；40℃延伸30 s。計(jì)算公式如下：基因相對(duì)表達(dá)值（校正值）=log10（目標(biāo)基因的拷貝數(shù)/內(nèi)參基因的拷貝數(shù)）

表1 Real-time RT-PCR 引物序列Table 1 Real-time RT-PCR primer sequences

1.9 數(shù)據(jù)的分析和處理 所有數(shù)據(jù)均以平均值對(duì)數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。所得數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 NDV Md/CH/LGD/1/2005株感染番鴨后臨床癥狀及病理學(xué)組織變化 番鴨感染NDV Md/CH/LGD/1/2005毒株后，均有明顯的臨床癥狀，表現(xiàn)為精神沉郁、站立不穩(wěn)、飲水和采食量下降，排稀便。發(fā)病率為100%，其中3只死亡（死亡率7.5%）。死亡番鴨剖檢變化為肝臟淤血（圖1A）；腺胃腫脹，腺胃壁增厚、乳頭明顯水腫且有出血點(diǎn)（圖1B）；脾臟明顯腫大變黑、質(zhì)地變脆、出血，出現(xiàn)部分壞死灶，呈斑駁狀病變（圖1C）。病理組織學(xué)結(jié)果顯示死亡番鴨脾臟實(shí)質(zhì)內(nèi)的淋巴細(xì)胞顯著減少（圖1D，圖1E為對(duì)照組）；胸腺間質(zhì)出血（圖1F，圖1G為對(duì)照組）。

圖1 番鴨感染NDV后組織剖檢癥狀Fig.1 Organization autopsy symptoms of Muscovy ducks infected with the NDV

2.2 NDV Md/CH/LGD/1/2005株感染番鴨后血清抗體變化 Md/CH/LGD/1/2005毒株感染番鴨后能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體。在接種后72 h時(shí)，部分番鴨產(chǎn)生抗體，在第7 d抗體水平達(dá)到最高峰，之后開始下降并進(jìn)入抗體滴度平臺(tái)期，但仍處于較高水平（圖2）。

圖2 番鴨感染NDV后HI血清抗體效價(jià)Fig.2 The HI titers of Muscovy duck serum antibodies infected with the NDV

2.3 NDV Md/CH/LGD/1/2005株感染后番鴨組織中AvBD基因的表達(dá)水平 在接種NDV Md/CH/LGD/1/2005強(qiáng)毒株后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，番鴨的不同組織器官中AvBD表達(dá)量表現(xiàn)一定的差異。鴨AvBD1、2、5和10在機(jī)體內(nèi)廣泛分布，而在骨髓中未檢測(cè)到AvBD3和AvBD9，在脾臟中未檢測(cè)到AvBD6和AvBD16（圖3）。

圖3 感染NDV后番鴨各組織中AvBD基因表達(dá)水平變化Fig.3 The expression of AvBD mRNA in tissues of Muscovy ducks infected with the NDV

在感染后36 h，AvBD2和AvBD4在法氏囊中表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）；AvBD12和AvBD16分別在法氏囊和骨髓中的表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。在感染后72 h，AvBD2在脾臟、法氏囊中顯著上調(diào)（P＜0.05），卻在盲腸扁桃體中表達(dá)量顯著下降（P＜0.05）。AvBD10在骨髓中表達(dá)量明顯下降，在法氏囊內(nèi)表達(dá)呈整體上升趨勢(shì)。在感染后7 d，AvBD3、AvBD6在法氏囊中表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），AvBD4在脾臟和法氏囊內(nèi)顯著高表達(dá)（P＜0.05），AvBD5在7 d及25 d的法氏囊內(nèi)顯著高表達(dá)（P＜0.05），AvBD16的表達(dá)在骨髓內(nèi)與同組對(duì)照組相比呈降低趨勢(shì)，在法氏囊內(nèi)顯著增加（P＞0.05）。AvBD7在36 h、72 h、7 d和25 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)的法氏囊內(nèi)均呈升高趨勢(shì)，且在感染后36 h和25 d差異性顯著（P＜0.05），卻在72 h骨髓內(nèi)顯著降低表達(dá)（P＜0.05）。

3 討論

早期報(bào)道顯示，在發(fā)病鴨和無臨床癥狀的健康鴨體內(nèi)，分離到大量毒力不等的NDV毒株，但大部分毒株僅被宿主攜帶而不會(huì)致鴨發(fā)病，即便是強(qiáng)毒力毒株也如此[19]。我們近期的研究也發(fā)現(xiàn)，NDV強(qiáng)毒對(duì)紹鴨無明顯致病性[10]。然而，近年來鴨新城疫出現(xiàn)頻率增加，且毒力也有明顯增強(qiáng)的趨勢(shì)。NDV不同致病性的復(fù)雜性狀是由多個(gè)基因型決定的，最主要是取決于病毒毒力以及宿主先天免疫反應(yīng)的結(jié)果。新城疫病毒可以誘導(dǎo)宿主的天然免疫反應(yīng)[20]，抗體反應(yīng)和細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)對(duì)闡明機(jī)體感染NDV后的一系列免疫應(yīng)答是同樣重要的。

本試驗(yàn)對(duì)番鴨利用滴鼻點(diǎn)眼的方式接種Md/CH/LGD/1/2005強(qiáng)毒株，發(fā)生個(gè)別番鴨死亡情況，有明顯的組織剖檢癥狀，并伴有組織器官不同程度的病理?yè)p傷。這一結(jié)果現(xiàn)象與Shi等[21]以點(diǎn)眼滴鼻的方式接種鴨源NDV后部分白羽番鴨出現(xiàn)的發(fā)病癥狀和死亡情況的研究結(jié)果相同。而石悅等[22]選用鴨源NDV以同樣方式接種紹鴨，未見紹鴨有明顯發(fā)病癥狀和死亡情況。以此推測(cè)這可能是由于不同品種的鴨對(duì)NDV強(qiáng)毒的反應(yīng)和敏感性不同。而Dai[23]也證實(shí)了這一觀點(diǎn)，通過將同一鴨源NDV分別感染北京鴨和綠頭鴨發(fā)現(xiàn)，綠頭鴨在攻毒后3～5 d全部死亡，而北京鴨無明顯癥狀。許麗文等[10]將與本試驗(yàn)同一鴨源NDV毒株感染紹鴨后，鴨沒有臨床發(fā)病癥狀和死亡情況發(fā)生，且感染后鴨排毒期間在攻毒組咽喉及泄殖腔拭子中均檢測(cè)到NDV。進(jìn)一步說明NDV強(qiáng)毒株對(duì)不同鴨源致病性的差異。

番鴨感染NDV強(qiáng)毒后血清抗體檢測(cè)顯示，在感染NDV后72 h開始產(chǎn)生陽(yáng)性抗體，此時(shí)能夠抑制病毒的復(fù)制，且在第7 d抗體水平達(dá)到最高峰，在16 d左右進(jìn)入抗體滴度平臺(tái)期。抗體變化規(guī)律與王秋玲[16]研究結(jié)果相同。本實(shí)驗(yàn)中NDV在感染后72 h即能達(dá)到最高復(fù)制水平，其病毒增殖復(fù)制速度非常之快。而體液免疫應(yīng)答則須在感染后3～5 d才開始產(chǎn)生特異性中和抗體，并在7 d時(shí)達(dá)到最高抗體水平。就實(shí)驗(yàn)過程中番鴨的死亡情況來看，盡管抗體產(chǎn)生時(shí)間相對(duì)較晚，但仍可以發(fā)揮很好的保護(hù)作用。這表明ND疫苗的初次免疫在番鴨的生產(chǎn)和養(yǎng)殖中非常重要。

大量研究表明禽β-防御素不僅具有廣譜抗細(xì)菌的活性，參與機(jī)體抗菌反應(yīng)[24]。同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)特性，可誘發(fā)炎癥反應(yīng)促進(jìn)機(jī)體適應(yīng)性免疫[25]。為了探究番鴨是否在接種NDV強(qiáng)毒后會(huì)誘導(dǎo)AvBD基因在體內(nèi)組織中的表達(dá)，本試驗(yàn)探討了感染該病毒后AvBDs在不同組織中的表達(dá)量。結(jié)果表明該NDV強(qiáng)毒感染番鴨后能夠誘導(dǎo)AvBD的表達(dá)。Xu等[26]在鵝感染NDV 36 h和72 h后，發(fā)現(xiàn)在鵝的脾臟和肝臟中該病毒載量與對(duì)照組相比差異顯著，且鵝AvBD4、AvBD16等AvBD基因表達(dá)量與病毒載量相關(guān)性差異顯著，證明新城疫病毒可誘導(dǎo)鵝AvBD的產(chǎn)生。此研究與本試驗(yàn)結(jié)果一致，且與傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）[27]和鴨肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV）[28]感染紹鴨和北京鴨引起的組織中AvBD表達(dá)水平變化一致。在SPF北京鴨感染DHV后，可誘導(dǎo)胸腺AvBD4和骨髓AvBD7表達(dá)，并呈時(shí)間依賴性，相反，DHV感染后，盲腸扁桃體、脾臟、法氏囊和胸腺中AvBD12的表達(dá)顯著降低，在某些時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)不到AvBD12的表達(dá)[12]。這與本試驗(yàn)中AvBD12的表達(dá)情況相似，但與骨髓中AvBD7的表達(dá)量恰恰相反。云驁[29]建立雞AvBD2和AvBD6的體外表達(dá)進(jìn)行抗ALV-J試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)雞AvBD2和AvBD6可以協(xié)同抵抗病毒感染，證明防御素可以激活免疫反應(yīng)。Liu等[30]的結(jié)果顯示，NDV能顯著誘導(dǎo)雞胚成纖維細(xì)胞產(chǎn)生AvBD2，且在兩個(gè)重組AvBD2蛋白中，只有在真核細(xì)胞中表達(dá)的蛋白在體外對(duì)新城疫病毒F48E9株具有直接的抗病毒活性。本試驗(yàn)中番鴨在接種NDV 36 h和72 h后AVBD2在多個(gè)組織中表達(dá)量顯著上升，推測(cè)AVBD2可發(fā)揮重要抗病毒作用。雛雞在感染白痢沙門菌后，可在十二指腸中檢測(cè)到AvBD2、4、5、6、7、9的表達(dá)水平明顯上升，其中AvBD6的升高幅度最大[31]。而本實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到AvBD2、3、4、5、6、7、16顯著表達(dá)的組織是在法氏囊中。以上我們可以得出：禽β-防御素在機(jī)體組織中分布具有組織特異性，且不同種禽類的在組織中的表達(dá)有明顯差異，這可能是由于不同的β-防御素在抗菌、抗病毒過程中所起作用不同所造成。另有研究發(fā)現(xiàn)，AvBDs對(duì)FadV-4（禽腺病毒）[32]、MDA（馬立克氏病病毒）[33]、ALV-J（禽腫瘤病病毒）[21]、金黃色葡萄球菌和沙氏菌[34]有抵抗作用。綜上所述，實(shí)驗(yàn)證明AvBDs在禽類先天防御系統(tǒng)的抗病毒過程中發(fā)揮重要作用。

番鴨經(jīng)鴨源基因Ⅶ型ND強(qiáng)毒株（Md/CH/LGD/1/2005）感染后出現(xiàn)臨床發(fā)病癥狀和死亡現(xiàn)象，經(jīng)血清抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NDV能夠引起番鴨機(jī)體內(nèi)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，通過定量檢測(cè)證明組織中AvBDs表達(dá)量的顯著高表達(dá)，積極的參與了番鴨抗NDV的免疫調(diào)控。揭示了該鴨源NDV毒株感染所誘導(dǎo)番鴨體內(nèi)天然免疫反應(yīng)的分子基礎(chǔ)，為后續(xù)禽類ND的防控提供一定參考意義。