謝 軍，張 碩，王安平，吳 植，吳 雙，朱善元

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 江蘇現(xiàn)代畜牧與新獸藥工程技術(shù)中心，泰州 225300）

近年來，我國華北、華中、華南等多地區(qū)鵝廠暴發(fā)了一種以關(guān)節(jié)型和內(nèi)臟型尿酸鹽沉積為主要特征的致死性傳染病因尿酸鹽沉積現(xiàn)象，民間將其稱為痛風(fēng)病[1-2]。該病主要侵害5～20日齡的雛鵝，死亡率可高達(dá)50%，對我國養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了嚴(yán)重的威脅[3]。造成鵝痛風(fēng)的原因有很多，飼料蛋白水平不均衡，飼養(yǎng)環(huán)境不佳、腸道菌群失衡或星狀病毒感染等多種原因均可出現(xiàn)雛鵝痛風(fēng)現(xiàn)象[4-5]。但是在一些飼喂合理、環(huán)境溫暖、干燥、保溫性能好，空氣流通通暢，養(yǎng)殖密度合適的鵝廠依然會(huì)出現(xiàn)痛風(fēng)現(xiàn)象，因此懷疑此種痛風(fēng)是由一種病原感染引起的[6-7]。

鵝痛風(fēng)給鵝養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2017年，刁有祥教授[7]首次揭示了引起鵝痛風(fēng)的病原體為鵝星狀病毒（Goose Astrovirus,GAstV）。GAstV屬于無囊膜的正鏈單股RNA病毒，基因組全長為6.9～7.9 kb[8-9]。在電子顯微鏡下可以觀察到鵝星狀病毒表面有5～6個(gè)突起，結(jié)構(gòu)呈星形，故稱之為星狀病毒。目前，GAstV全基因組序列分析表明，GAstV具有兩種不同的基因型，即GAstV-1和GAstV-2。GAstV-2已從鵝痛風(fēng)組織中被成功分離出來，而雛鵝回歸實(shí)驗(yàn)亦證明其能引起鵝痛風(fēng)[10]。

2016年，我國大部分商品鵝群中暴發(fā)了以內(nèi)臟和關(guān)節(jié)尿酸鹽沉積為主要特征的致死性傳染病，姜曉寧等[11-12]研究發(fā)現(xiàn)，鵝痛風(fēng)的病原為GAstVs[11-12]。2017年，首次報(bào)道第一株GAstV FLX全基因組序，基因組全長7299 nt[6,13]。之后另有幾株GAstVs相繼被測序或分離，如HN1G[12]、SDPY[11]、CXZ/18[14]、SD01[11]、GD[15]。然而，基因組同源性分析顯示，后續(xù)測序的GAstVs毒株與FLX株同源性均不到60%，遺傳進(jìn)化分析也表明這些毒株遺傳進(jìn)化關(guān)系與FLX株相距較遠(yuǎn)，說明我國鵝群中存在不同基因型GAstV，李盈等[16]建議將FLX類毒株命名為1型鵝星狀病毒（GAstV-1），SD01類毒株命名為2型鵝星狀病毒（GAstV-2），又被稱為新型鵝星狀病毒。

迄今為止尚無疫苗可以有效治療鵝痛風(fēng)病。部分養(yǎng)殖場嘗試采用自免血清進(jìn)行病鵝緊急治療，然而效果也不理想。從當(dāng)前情況可知，針對鵝痛風(fēng)病，養(yǎng)殖商品鵝過程中除了通過疫苗、抗體加強(qiáng)進(jìn)行免疫保護(hù)外，更需要通過建立一種快速、靈敏、有效的鵝星狀病毒檢測方法，以在鵝痛風(fēng)病早期進(jìn)行疫病的預(yù)防性檢測和臨床監(jiān)測。王安平等[6]將宏基因組學(xué)應(yīng)用于鵝痛風(fēng)病的診斷中，但該方法成本較高、操作步驟復(fù)雜等原因不適用于規(guī)?；瘷z測[6]。李陽等[17-18]發(fā)現(xiàn)，可利用RT-PCR/一步法RT-PCR進(jìn)行鵝痛風(fēng)病病原檢測，然而RT-PCR檢測方法靈敏度低，無法對檢測樣品進(jìn)行定量分析。熒光定量PCR技術(shù)因其靈敏度高、耗時(shí)短、操作簡便，同時(shí)彌補(bǔ)了常規(guī)PCR技術(shù)無法定量分析的缺點(diǎn)，現(xiàn)被廣泛使用于臨床樣品的檢測[19-20]。

為此，本研究使用MegAlign軟件比對TZ03（GenBank登錄號(hào)：MW353015）和NCBI下載序列，選取GAstV-1 ORF1b高度保守區(qū)內(nèi)RdRp基因序列設(shè)計(jì)了一對特異性引物和探針。通過構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-ORF1b，建立了用于檢測GAstV-1的TaqMan熒光定量PCR檢測方法，以期促進(jìn)鵝星狀病毒病的臨床快速診斷，進(jìn)一步推動(dòng)星狀病毒的感染防制工作。

1 材料與方法

1.1 病毒及其他病原菌 鵝Ⅰ型星狀病毒TZ03毒株為江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室于2019年從江蘇地區(qū)鵝場呈現(xiàn)出明顯痛風(fēng)癥狀的病鵝肝臟、脾臟、腎臟等組織分離獲得，暫命名為GAstV/CHN/TZ03/2019；新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）La Sota 疫苗株由揚(yáng)州大學(xué)劉秀梵院士惠贈(zèng)，鵝細(xì)小病毒（Goose parvovirus,GPV）SYG41-50疫苗株和番鴨細(xì)小病毒（Muscovy duck parvovlrus,MDPV）P1 疫苗株分別購自揚(yáng)州威克生物工程有限公司和青島易邦生物工程有限公司，鴨坦布蘇病毒（Duck Tembusu virus,DTMUV）（Duck/JiangSu/24/2018）和禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）H9N2亞型（Duck/XuZhou/515/2018）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所丁鏟研究員惠贈(zèng)；鵝圓環(huán)病毒（Goose circovirus,GoCV）（Goose/Jiangsu/02/2019）、鵝源大腸桿菌APECYE2-1-1（Goose/Taizhou/2019）、鴨疫里默氏桿菌（Duck/Jiangsu/08/2019）等由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行分離、保存。

1.2 試劑與儀器 Magbead Viral DNA/RNA Kit磁珠核酸提取試劑盒購自江蘇康為世紀(jì)（中國）有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量制備試劑盒均購自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；PremixTaqDNA預(yù)混酶、Prime Script RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒和無菌超純水購自寶生物工程（大連）有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）購自天根生化科技（北京）有限公司；QuantStudio 3實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（Applied Biosystems）；Qubit 4.0核酸定量儀熒光、Thermo Scientific KingFisher Flex全自動(dòng)磁珠提取純化系統(tǒng)計(jì)購自賽默飛世爾科技公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 于GenBank數(shù)據(jù)庫中下載Goose astrovirus基因序列，使用MegAlign軟件比對序列后，選取GAstV-1 ORF1b高度保守區(qū)內(nèi)RdRp基因（GenBank登錄號(hào)：MW353015），使用Applied Biosystems Q3熒光定量儀配套軟件Primer Express Software Version 3.0設(shè)計(jì)引物和探針，以及用作質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的一對引物（表1）。引物和探針均由英濰捷基（上海）有限公司合成。

表1 qPCR引物及探針序列Table 1 Primers and probes designed for qPCR

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建 選取GAstV-TZ03 cDNA作為擴(kuò)增模板，PCR擴(kuò)增體系（50 μL）為：PremixTaq（TaKaRaTaqVersion 2.0 plus dye）25 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min；12℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳分離后，參照凝膠回收試劑盒說明書收集核酸，將其與克隆載體pET-30a連接，轉(zhuǎn)化后將PCR條帶大小正確的陽性克隆菌送至英濰捷基（上海）有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與NCBI上已發(fā)布的序列進(jìn)行比對，將正確重組質(zhì)粒pET30a-ORF1b作為該檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)品。使用Qubit 4.0核酸定量儀熒光計(jì)對重組質(zhì)粒測定濃度。使用以下公式計(jì)算重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)＝（6.02×1023）×（質(zhì)粒濃度×10-9）/（質(zhì)粒長度×660）

1.5 核酸提取 取GAstV-1 (TZ03)、NDV (La Sota)、AIV-H9、DTMUV尿囊液，GoCV組織碾磨液，GPV、MDPV疫苗稀釋液，使用Thermo Scientific KingFisher Flex全自動(dòng)磁珠提取純化系統(tǒng)進(jìn)行核酸提取，提取的DNA置于-20℃低溫保存，因GAstV-1、NDV和AIV-H9病毒為RNA病毒，參照試劑盒對提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄cDNA置于-20℃保存；細(xì)菌參照細(xì)菌DNA提取試劑盒，獲得的DNA置于-20℃保存。

1.6 熒光定量PCR方法的建立及優(yōu)化 反應(yīng)體系（20 μL）為：2× Premix ExTaq(Probe qPCR) 10 μL，50× ROX Reference Dye 0.4 μL，DNA/cDNA模板1 μL，上、下游引物和探針（10 μmol/L），其余ddH2O補(bǔ)足20 μL。使用方陣試驗(yàn)，摸索退火溫度、引物和探針濃度等條件以篩選出最佳反應(yīng)體系，即引物和探針終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μmol/L；退火/延伸溫度為57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃不斷優(yōu)化以獲得更好的反應(yīng)結(jié)果。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s；95℃退火10 s，退火/延伸40 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)后收集熒光信號(hào)，用于結(jié)果的判定。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取鵝星狀病毒重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，加入ddH2O進(jìn)行10倍系列梯度稀釋，最終濃度為1×101～1×107copies/μL，按照“1.6”中反應(yīng)體系和條件進(jìn)行操作，繪制TaqMan qPCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)濃度梯度實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù)，并采用ddH2O作為陰性對照。

1.8 特異性實(shí)驗(yàn) 為檢測qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的特異性，使用病毒核酸提取試劑盒分別提取 MDRV、DTMUV、MDPV、AIV（H9N2）、GPV、DuCV病毒RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄為 DNA；使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取大腸桿菌、鴨疫里默氏桿菌基因組DNA，以DNA為模板，驗(yàn)證該方法的特異性。

1.9 敏感性實(shí)驗(yàn) 按1×101～1×105copies/μL對重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋，以優(yōu)化后反應(yīng)體系和條件進(jìn)行稀釋濃度的最低限度檢測，驗(yàn)證該方法的靈敏性。使用RT-PCR進(jìn)行靈敏度比對性檢測。

1.10 重復(fù)性試驗(yàn) 為驗(yàn)證qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性，使用10倍梯度稀釋為104～106copies/μL的混合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒來分析組內(nèi)及組間變異。在相同的條件下在同一個(gè)96孔板上做3個(gè)重復(fù)，測定組內(nèi)變異系數(shù)；分3個(gè)時(shí)間段就同一批樣品進(jìn)行重復(fù)檢測，批次樣品單次檢測時(shí)設(shè)定3個(gè)重復(fù)組，進(jìn)行組間變異系數(shù)測定。

1.11 臨床樣品的檢測 對依托江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（水禽）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系集成創(chuàng)新中心，經(jīng)過NGS測序后的13份已知背景的田間臨床樣品進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增 以 GAstV-1(TZ03) cDNA為模板進(jìn)行常規(guī) PCR 擴(kuò)增，獲得 GAstV-1 的ORF1b基因片段（1542 bp），片段大小與目的片段一致（圖1）。經(jīng)膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、陽性克隆菌擴(kuò)增及質(zhì)粒提取，陽性菌測序結(jié)果與預(yù)期一致，表明成功建立重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品并命名為pET30a-ORF1b。

圖1 pET30a-ORF1b酶切鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid pET30a-ORF1b by restriction enzymes digestion

2.2 TaqMan qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 將重組質(zhì)粒梯度稀釋，制備成1×102～1×107copies/μL的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)優(yōu)化的反應(yīng)體系和條件繪制qPCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，GAstV-1病毒可得到具有良好的相關(guān)系數(shù)及擴(kuò)增效率的標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2=0.998，E=99.6%（圖2）。

圖2 GAstv-1 qPCR 擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Amplification curve and standard curve of single qPCR for GAstv-1 E =99.6%,R2 =0.998 ,Slope = -3.394,Y-Inter = 39.812

2.3 TaqMan qPCR特異性試驗(yàn) 以TZ03的cDNA作為陽性對照，ddH2O作為陰性對照，對NDV、GPV、MDPV、DTMUV、AIV-H9、GoCV、鵝源大腸桿菌、鴨疫里默氏桿菌的DNA/cDNA 進(jìn)行特異性檢測。結(jié)果顯示，除陽性對照組，其余6種病毒、2種細(xì)菌和陰性對照組均未檢測到熒光信號(hào)（圖3）。建立的qPCR方法在不同病原的檢測結(jié)果中具有良好的特異性。

圖3 GAstv-1 qPCR 特異性檢測Fig.3 Specific detection of single qPCR for GAstV-1

2.4 TaqMan qPCR靈敏度試驗(yàn) 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按1×101～1×105copies/μL進(jìn)行倍比稀釋，并以上一步驟優(yōu)化條件進(jìn)行qPCR檢測。結(jié)果顯示：GAstV-1的qPCR的靈敏度約為10 copies/μL，陰性對照無擴(kuò)增。而常規(guī)PCR靈敏度檢測結(jié)果：靈敏度近1000 copies/μL（圖4～5）。由此表明，GAstV-1病毒的qPCR檢測方法具有較高靈敏度，且較常規(guī)PCR高100倍左右。

圖4 GAstV-1 qPCR靈敏度檢測Fig.4 Sensitivity detection of single qPCR for GAstV-1

圖5 GAstV-1 PCR 靈敏度檢測Fig.5 Sensitivity detection of single PCR for GAstV-1

2.5 TaqMan qPCR 重復(fù)性試驗(yàn) 利用構(gòu)建的熒光定量PCR法對不同批次不同濃度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，GAstV-1 TZ03株組內(nèi)變異系數(shù)為0.10%～0.34%，組間變異系數(shù)為0.28%～0.60%（表2）。

表2 qPCR法組內(nèi)、組間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of repeatability test within and between single qPCR groups

2.6 臨床樣品檢測 依托江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（水禽）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系集成創(chuàng)新中心，提供13份已知背景的田間臨床樣品對建立的檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證。利用構(gòu)建的熒光定量PCR法檢測出13份田間臨床樣品的陽性，0份田間臨床樣品為陰性，與13份田間臨床樣品的已知背景情況相符。

3 討論

我國是水禽生產(chǎn)、消費(fèi)大國，肉鵝出欄量常年穩(wěn)定在5億羽以上、種鵝存欄量在2千萬羽以上，產(chǎn)值高達(dá)500億元以上。但自2016年以來，我國商品鵝飼養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)鵝群中出現(xiàn)了以皮下、組織、關(guān)節(jié)等部位尿酸鹽堆積的臨床癥狀疾病，患病雛鵝死亡率高達(dá)50%，單日死亡率最高可達(dá)存欄量的15%，耐過鵝也會(huì)表現(xiàn)出生長遲緩，甚至還會(huì)繼發(fā)感染細(xì)菌疾病，嚴(yán)重威脅到我國肉鵝養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)發(fā)展[21]。大量研究表明，雛鵝飼喂過程中補(bǔ)充過量的高蛋白、高鈣飼料，很容易導(dǎo)致尿酸產(chǎn)生過多或飲水不足、排泄障礙，引發(fā)大量尿酸鹽堆積，從而引起營養(yǎng)代謝性疾病[17]。同時(shí)有研究證明鵝星狀病毒是導(dǎo)致鵝痛風(fēng)的主要原因之一[1,22]。研究發(fā)現(xiàn)，鵝痛風(fēng)病主要是由1型和/或2型星狀病毒感染引起的，臨床癥狀和病理變化較相似，很難通過肉眼進(jìn)行區(qū)分，給臨床檢疫帶來了困難[23-24]。

TaqMan qPCR方法和常規(guī)PCR法比較，前者靈敏更高、結(jié)果重復(fù)性更佳、特異性更強(qiáng)等，被廣泛用于臨床樣品的檢測和篩查。構(gòu)建TaqMan qPCR檢測法的關(guān)鍵在于引物和探針的設(shè)計(jì)，良好的引物和探針是該法構(gòu)建成功的重要保證。先在GenBank上下載獲得病毒目的基因全部序列，使用MegAlign軟件進(jìn)行序列比對，篩選出ORF1b高度保守區(qū)內(nèi)RdRp基因，使用Primer Express Software Version 3.0設(shè)計(jì)引物和探針。引物設(shè)計(jì)時(shí)選擇退火溫度為59℃～60℃，因探針退火溫度宜高于引物8℃～10℃，所以探針的退火溫度設(shè)定為68℃～70℃，以確保探針的優(yōu)先結(jié)合。反應(yīng)體系經(jīng)引物、探針條件摸索，優(yōu)化結(jié)果為：95℃預(yù)變性30 s；95℃退火10 s，退火/延伸40 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)結(jié)果顯示建立的TaqMan qPCR方法具有良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，擴(kuò)增效率（E）為92%～103%，R2在0.996以上，即表明鵝星狀病毒的目的基因得到良好的擴(kuò)增；特異性檢測結(jié)果表明，通過檢測GAstV、NDV、DTMUV、AIV（H9N2）、GPV、GoCV、水禽大腸桿菌和鴨疫里默氏桿菌等病原菌，除鵝Ⅰ型星狀病毒外，其他水禽相關(guān)病毒、細(xì)菌均無擴(kuò)增；通過不同時(shí)間段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，組內(nèi)變異系數(shù)為1.02%～3.11%，組間變異系數(shù)為1.09%～3.67%，引物的重復(fù)性良好；通過實(shí)驗(yàn)室保存的陽性臨床樣品進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果與NGS測序結(jié)果一致。

由此可見，本研究成功構(gòu)建了靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好的GAstV-1 TaqMan qPCR檢測方法。該方法的建立為水禽養(yǎng)殖提供了早期快速診斷技術(shù)，對水禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。