龔成燕，陳 杰，潘虹軍，羅國良，劉夢佳，胡 博，趙建軍

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部經(jīng)濟(jì)動物疫病重點實驗室，長春 130112；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，大慶 163319；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌 712100；4.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，長春 130112；5.濟(jì)南海關(guān)，濟(jì)南 250200）

狂犬病是由彈狀病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒屬（Lyssavirus）的狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）引起的急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的人獸共患傳染病[1]。RABV可以感染幾乎所有溫血哺乳動物，對公眾健康具有重大威脅，狂犬病造成死亡人類中99%以上是由感染家養(yǎng)犬咬傷造成的，目前國內(nèi)犬類狂犬病發(fā)病率仍在不斷上升[2]。犬瘟熱是由副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbillivirus）的犬瘟熱病毒（Canine distemper virus,CDV）感染引起的一種熱性、高度接觸性傳染病[3]。其自然宿主近些年來不斷擴(kuò)增，包括犬科、鼬科、浣熊科等，甚至可能具有感染人的潛在風(fēng)險[4-5]。CDV通過口鼻入侵宿主，并迅速在淋巴組織中復(fù)制，引起感染動物嚴(yán)重的免疫抑制[6]。犬細(xì)小病毒病是由細(xì)小病毒科（Parvoviridae）細(xì)小病毒屬（Parvovirus）的犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus,CPV）感染引起的一種急性、致死性傳染病[7]。犬細(xì)小病毒于1978年首次在澳大利亞和美國被發(fā)現(xiàn)，并在幾個月內(nèi)傳播到世界各地[8]，CPV主要感染幼齡犬，短時間潛伏期后可引起嚴(yán)重的出血性胃腸炎癥狀，白細(xì)胞顯著減少為其臨床特征，并具有高傳染性和高致死率[9-10]，對養(yǎng)犬業(yè)造成了較大的損失。

狂犬病、犬瘟熱和犬細(xì)小病毒病嚴(yán)重影響著犬科動物的健康，目前解決這些問題最有效、直接的方法是疫苗接種?？袢』畈《疽呙缤ǔ１葴缁钜呙缒芨玫乇Ｗo(hù)犬[11]，但弱毒活疫苗可能因毒力返強而致病，并對免疫系統(tǒng)不健全或抑制狀態(tài)的犬造成潛在風(fēng)險[12]，基因工程疫苗研制周期較長且不能完全控制流行毒株[13]。1911年，Liu等[14]首次通過活體腦內(nèi)增殖RABV，并用石炭酸做滅活劑來制備滅活RABV疫苗，后期發(fā)現(xiàn)在體外BHK-21細(xì)胞上繁殖RABV具有同等效力；1923年，F(xiàn)ranke等[15]用感染犬的腦組織滅活后首次研制出犬瘟熱滅活苗，但免疫犬不能有效抵抗CDV強毒株攻擊，后期發(fā)現(xiàn)在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)的減毒CDV免疫原性要高于組織滅活疫苗[16]。1981年，Smith等[17]首次用CPV滅活疫苗免疫犬，免疫犬雖獲得攻毒保護(hù)，但不能完全阻止免疫犬排毒。隨著CDV受體信號淋巴細(xì)胞激活分子（signaling lymphocytic activation molecule,SLAM）的鑒定，穩(wěn)定表達(dá)犬SLAM受體的細(xì)胞系，如Vero/DogSLAM（VDS）細(xì)胞，可用增殖CDV弱毒株和野毒株，增殖后病毒效價大大提高[18-20]，從而解決了CDV在體外細(xì)胞中增殖效價不高，制備滅活疫苗免疫原性低的問題。

在滅活疫苗中加入佐劑，可以延長疫苗的免疫保護(hù)期，促進(jìn)機(jī)體特異免疫應(yīng)答反應(yīng)。目前，已研究的佐劑種類非常多，根據(jù)其來源可分為化合物和天然物兩大類[21]。市場上犬用疫苗佐劑多為合成的水佐劑和油佐劑，有研究結(jié)果顯示油佐劑疫苗相對于水佐劑疫苗，相同時間內(nèi)，油佐劑疫苗免疫犬產(chǎn)生的抗體水平較低[22]。李敏等[13]制備的佐劑MONTANIDE GEL 01犬細(xì)小病毒滅活疫苗連續(xù)兩次免疫幼犬后，有效抗體可維持5個月；舒秀偉等[23]發(fā)現(xiàn)鋁膠（Al(OH)3）佐劑滅活疫苗（Flury株）免疫動物后能提高狂犬病病毒抗體效價，增強疫苗的免疫效果；張菲等[24]在制備貓用RABV滅活疫苗時采用特制的水包油佐劑，發(fā)現(xiàn)其可顯著提高疫苗的免疫效力。

目前，我國商品化聯(lián)苗中尚未有獲批的狂犬病-犬瘟熱-犬細(xì)小病毒病三聯(lián)疫苗上市。尤其是狂犬疫苗，目前多為單獨免疫[25-26]，導(dǎo)致在免疫預(yù)防過程中需要重復(fù)對動物進(jìn)行免疫接種，不但增加了工作強度，也容易造成動物的應(yīng)激反應(yīng)。犬瘟熱疫苗多為弱毒疫苗，免疫原性雖高于滅活疫苗，但滅活疫苗相對活毒疫苗具有更好的安全性[27]。因此，本研究旨在通過比較不同佐劑對狂犬病-犬瘟熱-細(xì)小病毒病三聯(lián)滅活疫苗的免疫效果，從而開發(fā)出一種安全、有效的犬用三聯(lián)滅活疫苗，可同時針對狂犬病、犬瘟熱與細(xì)小病毒病三種犬病提供免疫保護(hù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒和實驗動物 穩(wěn)定表達(dá)犬SLAM受體的非洲獼猴腎細(xì)胞Vero/DogSLAM （VDS）、貓腎細(xì)胞（F81）和乳倉鼠腎細(xì)胞（BHK-21）由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所和黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)保存。疫苗生產(chǎn)用CDV野毒株LN(10)1[28]、CPV強毒株JL(18)1-Beagle[29]、RABV弱毒株HEP-Flury[30]和病毒攻毒用CDV強毒SD(14)7株由國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所和黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)保存鑒定[4]。實驗用6周齡比格犬57只，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所比格犬養(yǎng)殖基地提供。

1.2 主要試劑 胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購自南京WISENT生物技術(shù)公司；ADJ-801（W）佐劑由河南通商進(jìn)出口有限公司惠贈，MONTANIDE GEL 02佐劑購自上海SEPPIC生物技術(shù)公司，Al(OH)3鋁鹽佐劑購自吉林正業(yè)生物制品有限公司；滅活劑β-丙內(nèi)酯購自Ferak Berlin GmbH公司；狂犬病病毒抗體ELISA試劑盒為北京金諾百泰生物技術(shù)有限公司（獸藥生字010678829）產(chǎn)品；4%多聚甲醛購自BBI生命科學(xué)生物公司；FITC標(biāo)記的抗RABV N蛋白的單克隆抗體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所保存。

1.3 病毒培養(yǎng) 待VDS在T-75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中長成單層細(xì)胞，接種CDV LN（10）1株1 mL（106.0TCID50/mL），并于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每日觀察細(xì)胞狀態(tài)，待細(xì)胞病變達(dá)到80%左右，反復(fù)凍融細(xì)胞3次后收取病毒液；將F81細(xì)胞均勻鋪于T-75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，同時接種CPV JL(18)1-Beagle株1 mL（106.0TCID50/mL），培養(yǎng)、收毒與檢驗病毒方法與增殖CDV的方法一致；待T-75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶BHK-21細(xì)胞長成單層細(xì)胞時，接種RABV弱毒HEP-Flury株1 mL（105.67TCID50/mL），并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行病毒擴(kuò)增培養(yǎng)，96 h后通過反復(fù)凍融3次后收獲病毒液。

1.4 病毒含量測定與純凈性檢驗 將VDS細(xì)胞均勻鋪于96孔板中，待細(xì)胞長成單層時，將待測病毒液LN（10）1以10倍系列稀釋到7個梯度（10-1～10-7），并依次加入96孔板中，每個梯度4個重復(fù)孔，置于5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)4 d～5 d，逐日觀察細(xì)胞病變情況并記錄結(jié)果，按照Reed-Muench法計算病毒含量[22]。將F81細(xì)胞均勻鋪于96孔板中，同時將待測病毒液JL（18）1-Beagle以10倍系列稀釋到7個梯度（10-1～10-7），后續(xù)步驟與測LN（10）1方法一致。

將BHK-21細(xì)胞均勻鋪于96孔板中，待細(xì)胞長成單層時，將待測病毒液HEP-Flury以10倍系列稀釋到7個梯度（10-1～10-7），依次加入96孔板中，每個梯度4個重復(fù)孔，置于37℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)72 h后，PBS溫和洗滌2次，4%多聚甲醛4℃固定細(xì)胞30 min，棄液，干燥10 min，加入FITC標(biāo)記的抗RABV N蛋白的單克隆抗體，37℃孵育1 h，PBS洗滌3次后，加入適量的80%甘油，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果[31]。

分別取收獲的3種病毒混合液，按《中華人民共和國獸藥典》（2015年版三部）（以下簡稱《中國獸藥典》）[32]進(jìn)行無菌檢驗和支原體檢驗。

1.5 病毒滅活與疫苗制備 3種病毒分別應(yīng)用PBS按CDV（106.0TCID50/mL）、CPV（106.0TCID50/mL）、RABV（105.67TCID50/mL）的比例進(jìn)行病毒抗原液配制，按1∶2000比例加入β-丙內(nèi)酯，徹底混勻后4℃滅活24 h后37℃水解1 h，即成滅活病毒液。取滅活CDV、CPV和RABV用DMEM培養(yǎng)基1∶5稀釋后分別接種VDS、F81和BHK-21細(xì)胞，細(xì)胞置37℃培養(yǎng)3 d后再傳1代，觀察3種細(xì)胞有無細(xì)胞病變，未見細(xì)胞病變即判定病毒滅活合格。

將MONTANIDE GEL 02、ADJ-801(W)和Al(OH)33種佐劑分別與滅活病毒液（RABV∶CDV∶CPV=1∶1∶1）按1∶4比例混合均勻，制備成三聯(lián)滅活疫苗，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

選取CDV、CPV和RABV抗原和抗體均為陰性的健康6周齡比格犬15只，每只皮下注射疫苗3 mL，連續(xù)觀察至第14 d，每天記錄是否出現(xiàn)局部或全身不良反應(yīng)（表1）。

表1 比格犬疫苗接種分組及相關(guān)信息Table 1 Vaccination group and related information of Beagles

1.6 比格犬免疫試驗 選取RABV、CDV、CPV抗原和抗體均為陰性的6周齡比格犬30只，連續(xù)免疫制備的三聯(lián)疫苗3次，每次每只接種1 mL，每次間隔4周，并在每次免疫前和最后一次免疫后4周采集比格犬后肢靜脈血液于促凝管中，分離血清于-20℃?zhèn)溆茫ū?）。

表2 比格犬免疫分組信息Table 2 Immunized group of Beagles

1.7 病毒抗體效價測定 三聯(lián)滅活疫苗免疫比格犬后，血清中和法測定CDV中和抗體效價，血凝抑制試驗測定CPV抗體水平變化，ELISA試劑盒測定RABV抗體水平。

1.7.1 血清中和試驗 將分離后的血清用DMEM兩倍倍比稀釋10個梯度，56℃滅活30 min，濾過除菌后置-20℃保存?zhèn)溆?。將CDV SD(14)7株病毒液用無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成100 TCID50每100 μL。分別取病毒液和待檢血清各100 μL，37℃孵育1 h。將上述液體加入已長成單層VDS細(xì)胞的96孔板內(nèi)，每個稀釋度4個重復(fù)孔，置于5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)4～5 d，并逐日觀察記錄結(jié)果，同時設(shè)置正常細(xì)胞對照組，采用Reed-Muench法計算結(jié)果[33-34]。

1.7.2 血凝抑制試驗 取25 μL待檢血清，加入血凝板第1孔，以2倍倍比依次稀釋至第10孔，每孔加入25 μL病毒抗原，于微型振蕩器上振蕩約1 min，將第11孔設(shè)置為病毒對照，第12孔設(shè)置為紅細(xì)胞對照，37℃靜置30 min；每孔加入1%的新鮮豬紅細(xì)胞25 μL，震蕩混勻，4℃靜置2 h后觀察結(jié)果。以能夠100%抑制紅細(xì)胞凝集的最高血清稀釋度為該血清的滴度，即血清血凝抑制效價[27,35]。

1.7.3 ELISA檢測抗RABV抗體 按照RABV抗體ELISA試劑盒說明書的操作方法檢測抗RABV抗體水平。

1.8 比格犬攻毒 在免疫接種3個月后，MONTANIDE GEL 02、ADJ-801（W）和Al（OH）3三組比格犬分別應(yīng)用CDV強毒SD（14）7株和CPV強毒JL（18）1-Beagle株攻毒，其中SD（14）7采用肌肉聯(lián)合鼻內(nèi)接種方式進(jìn)行攻毒，每只1 mL，含100個半數(shù)致死量（LD50）；JL（18）1-Beagle采用口服方式攻毒，每只1 mL，含100個LD50（表3），每天觀察比格犬食欲、精神狀態(tài)等臨床指標(biāo)。

表4 病毒含量與質(zhì)量檢驗結(jié)果Table 4 Virus loads and quality test

2 結(jié)果

2.1 病毒含量測定結(jié)果 CDV、CPV和RABV三種病毒含量均超過105.67TCID50/mL，符合制備三聯(lián)滅活疫苗的毒種標(biāo)準(zhǔn)。對無菌、支原體檢測結(jié)果為陰性，均符合《中國獸藥典》（2015年版）規(guī)定[32]。

2.2 三聯(lián)滅活疫苗安全性檢驗結(jié)果 疫苗對比格犬進(jìn)行3倍免疫劑量進(jìn)行安全性檢驗，動物接種疫苗14 d內(nèi)體溫、食欲和精神狀態(tài)均無異常，表明3批不同佐劑的三聯(lián)疫苗對比格犬具有較好的安全性（表5）。

表5 三聯(lián)疫苗滅活與安全性檢驗Table 5 Safety test of triple vaccine

2.3 三聯(lián)滅活疫苗免疫比格犬后抗體效價 比格犬在連續(xù)3次免疫期間，血清CDV中和抗體水平持續(xù)升高。ADJ-801（W）組，二免和三免后CDV平均抗體效價分別為1∶8.6和1∶50，三免后CDV抗體水平極顯著高于二免；而三免后MONTANIDE GEL 02和Al(OH)3組CDV平均抗體效價分別為1∶10.6和1∶6，極顯著低于三免后的ADJ-801（W）組。MONTANIDE GEL 02和Al(OH)3組在3次免疫期間，CDV抗體水平升高但差異不顯著（圖1A）。比格犬3次免疫期間，CPV血凝抑制抗體效價在一免后即開始上升，三免后ADJ-801（W）組CPV平均抗體效價可達(dá)1∶1024（圖1B）。隨著免疫次數(shù)增加，RABV抗體水平不斷升高，第二次免疫后，三組抗體水平均有所升高，MONTANID E GEL 02和ADJ-801（W）組RABV平均抗體效價分別為4.60 EU/mL、6.09 EU/mL，顯著高于首免；第三次免疫后，MONTANIDE GEL 02和ADJ-801（W）組RABV平均抗體效價分別為6.9 EU/mL和7.4 EU/mL（圖1C）。

圖1 免疫后比格犬血清抗體的測定Fig.1 Determination of serum antibodies in beagle dogs after immunization

2.4 比格犬攻毒后保護(hù)情況 免疫動物攻毒實驗結(jié)果表明，三聯(lián)滅活疫苗MONTANIDE GEL 02組對CDV和CPV的攻毒保護(hù)率均為60%；三聯(lián)滅活疫苗ADJ-801(W)組比格犬對CDV和CPV的攻毒保護(hù)率均為100%，存活比格犬健康狀態(tài)良好，無臨床癥狀出現(xiàn)；Al(OH)3組比格犬在連續(xù)3次免疫3個月后攻毒，攻毒犬均出現(xiàn)精神沉郁、食欲不振甚至廢絕癥狀，其中CDV攻毒組出現(xiàn)眼鼻分泌物增多等犬瘟熱癥狀；CPV攻毒組出現(xiàn)腹瀉等細(xì)小病毒病癥狀，最終100%死亡，結(jié)果見表6。

表6 疫苗免疫比格犬攻毒CDV和CPV后存活率Table 6 The protective rate of beagles after challenge with CDV and CPV

3 討論

目前，MONTANIDE GEL 02、ADJ-801（W）和Al(OH)3為用于動物疫苗制備的三種商品化水溶性佐劑[34]，本研究將經(jīng)β-丙內(nèi)酯滅活后的RABV、CDV和CPV分別與上述三種佐劑按一定比例混合，聯(lián)合免疫比格犬后進(jìn)行疫苗免疫效果評價。因比格犬的成本比較高，本研究受限于實驗動物數(shù)量，選擇免疫評價中重要的指標(biāo)進(jìn)行評價，即重點比較了三種佐劑的效果，因此只設(shè)置了免疫（抗原分別與三種不同的佐劑搭配）組和未免疫（既不含有抗原也不含佐劑）組。疫苗連續(xù)三次免疫比格犬后，ADJ-801（W）組CDV中和抗體水平顯著高于MONTANIDE GEL02和Al(OH)3組。CPV血凝抑制抗體效價在第三次免疫后達(dá)到最高值，ADJ-801（W）組在第三次免疫后，CPV抗體平均效價可達(dá)1∶1024，據(jù)秦海斌等報道，當(dāng)CPV血凝抑制抗體效價低于1∶80時，幼犬有感染CPV的風(fēng)險，抗體高于1∶160時犬有可能出現(xiàn)隱性帶毒而不表現(xiàn)明顯臨床癥狀，當(dāng)效價高于1∶640時能夠達(dá)到完全保護(hù)[36]。在疫苗第三次免疫后，ADJ-801(W)、MONTANIDE GEL 02和Al(OH)3組RABV抗體效價平均值分別為7.4 EU/mL、6.9 EU/mL及4.0 EU/mL，均顯著高于世界動物衛(wèi)生組織（OIE）制定的標(biāo)準(zhǔn)，即被檢動物血清抗體大于0.6 EU/mL，則判定為具有保護(hù)水平[37]。綜上所述，ADJ-801(W)佐劑疫苗的免疫效果最佳。

為了評價研制的滅活三聯(lián)滅活疫苗能否對犬提供免疫攻毒保護(hù)，本研究在三次免疫比格犬3個月后對比格犬接種CDV強毒SD（14）7株和CPV強毒JL(18)1-Beagle株。從結(jié)果可以看出，MONTANIDE GEL 02組和Al(OH)3組三聯(lián)滅活疫苗對比格犬均起不到較好的免疫保護(hù)作用；而ADJ-801（W）組免疫犬獲得很好的保護(hù)?？袢《拘柙谏锇踩墝嶒炇也僮?，因此受實驗條件影響，本次沒有進(jìn)行比格犬RABV攻毒試驗。薛素強等[37]研究發(fā)現(xiàn)狂犬滅活疫苗（dG株）在免疫家犬后12個月抗體效價達(dá)3.55 EU/mL，抗體陽轉(zhuǎn)率為80.0%，明顯高于OIE要求標(biāo)準(zhǔn)；李婷婷等[38]使用狂犬滅活疫苗（r3G株）免疫比格犬，測定3批疫苗的效價，結(jié)果顯示效價分別為5.06、5.38和5.30 EU/mL，均符合疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要求且批次之間的穩(wěn)定性較強。本研究三聯(lián)滅活疫苗在第一次免疫比格犬體后，RABV抗體含量已達(dá)到保護(hù)水平。在三次免疫比格犬后，三組組RABV抗體效價平均值分別為6.9、7.4及4.0 EU/mL，明顯高于OIE標(biāo)準(zhǔn)。說明本研究制備的三聯(lián)滅活疫苗免疫比格犬可提供較強的RABV免疫保護(hù)作用。

顏淑芹等[39]通過研究不同濃度氫氧化鋁對人用狂犬病純化疫苗效力的影響，發(fā)現(xiàn)氫氧化鋁免疫增強作用與很多因素有關(guān)，佐劑本身可刺激吞噬細(xì)胞活性，但過多的鋁佐劑反而會抑制抗原的釋放且對吞噬細(xì)胞有細(xì)胞毒的副作用也會降低免疫力。本研究Al(OH)3佐劑滅活三聯(lián)滅活疫苗免疫效果不佳，可能是在制備三聯(lián)滅活疫苗時Al(OH)3的添加量過高或過低，也有可能是溫度等因素對Al(OH)3佐劑性狀的影響[34]。有研究報道稱Al(OH)3不能有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答[40-41]，并且本研究僅測定了CPV血凝抑制抗體而不是中和抗體，而血凝抑制抗體水平不能完全反映血清對病毒的中和能力。因此，三次免疫后Al(OH)3組雖然產(chǎn)生了較高水平的血凝抑制抗體但也沒能阻止細(xì)小病毒對犬的致死性感染。同時，本研究攻毒時間是最后一次免疫后的3個月，抗體檢測時間為最后一次免疫后4周，時間間隔2個月，攻毒后Al(OH)3組比格犬100%死亡的原因亦可能是Al(OH)3組動物抗體水平下降過快所致。近幾年來，犬細(xì)小病毒疫苗免疫后仍然有CPV發(fā)病的報道，亦可能是由于上述原因引起[42-44]。

本研究ADJ-801（W）佐劑免疫比格犬后較其他兩種佐劑提高了CDV、CPV和RABV抗體水平，比格犬在CDV和CPV攻毒后獲得較好的免疫保護(hù)。ADJ-801（W）的主要成分包括卡波姆（Carbomer）增稠劑和CPC，CPC（因生產(chǎn)企業(yè)保密要求，暫未獲得其主要成分）是佐劑的主要功能成分。在對成品疫苗進(jìn)行安全檢驗與后期三次連續(xù)免疫比格犬期間，并未發(fā)現(xiàn)比格犬有任何不良臨床反應(yīng)。因此，ADJ-801（W）是一款良好的疫苗免疫佐劑，安全性高，為研制犬三聯(lián)滅活疫苗以及預(yù)防和控制狂犬病、犬瘟熱及犬細(xì)小病毒病的流行提供幫助。滅活疫苗具有研制工藝簡單、安全性高等優(yōu)點，并可與其他滅活病毒聯(lián)合免疫動物，通過減少接種針次，避免對動物造成應(yīng)激反應(yīng)。未來在研制三聯(lián)滅活疫苗時，建議重點關(guān)注如何提高免疫效力和降低免疫接種次數(shù)，達(dá)到在較少免疫次數(shù)下，免疫動物能得到較好的免疫保護(hù)。