杜東穎，霍環(huán)艷，田 輝，王璐璐，王孟月，洪素梅，高曉靜，田克恭

（國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，洛陽(yáng) 471000）

雞肝炎-心包積液綜合征（hepatitishydropericardium syndrome,HHS）是由血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4,FAdV-4）引起的高致病性傳染病[1]，近幾年來(lái)，該病在我國(guó)廣泛流行，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，目前已成為危害養(yǎng)禽業(yè)的主要疫病之一[2-4]。HHS可水平和垂直傳播，不同品種的雞均可感染發(fā)病[5]。

FAdV-4是無(wú)囊膜的雙鏈DNA病毒，病毒粒子呈二十面體對(duì)稱，包含3種主要結(jié)構(gòu)蛋白[6-7]，分別為六鄰體（Hexon）蛋白、五鄰體（Penton）基座、纖突蛋白（Fiber）。FAdV-4 Fiber具有兩個(gè)獨(dú)立的Fiber編碼基因Fiber-1和Fiber-2[8]，F(xiàn)iber-2蛋白具有誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的能力，是具有保護(hù)性的免疫原[9]?，F(xiàn)有研究結(jié)果顯示，使用不同表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組Fiber-2蛋白均具有良好的免疫原性，可作為亞單位疫苗候選蛋白進(jìn)行疫苗研制開發(fā)[9-11]。

目前對(duì)于禽腺病毒的防控主要以全病毒滅活疫苗為主，研究證實(shí)，全病毒滅活疫苗具有較好的免疫效果[12-14]。但全病毒滅活苗需借助雞胚或細(xì)胞增殖病毒，制備工藝繁瑣、生產(chǎn)成本較高，且活毒操作存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，安全、有效、價(jià)格低廉的亞單位疫苗，在臨床疫病防控方面具有良好的開發(fā)和應(yīng)用前景。

本研究利用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)Fiber-2蛋白進(jìn)行表達(dá)、純化，將純化后的Fiber-2蛋白制備不同抗原含量的亞單位疫苗，同時(shí)制備不同抗原含量的全病毒滅活疫苗，采用超低免疫劑量對(duì)全病毒滅活疫苗和亞單位疫苗的免疫效果進(jìn)行比較研究，為亞單位疫苗研制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 SPF雞購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；異丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside,IPTG）誘導(dǎo)劑、預(yù)染蛋白Marker均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗雞IgY二抗購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow購(gòu)自美國(guó)General Electric Company；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)自Gibco；β-丙內(nèi)酯購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；商品化禽腺病毒I群（FADV-I）抗體ELISA試劑盒購(gòu)自荷蘭BioChek。

1.2 質(zhì)粒、毒株和細(xì)胞 pET-30a-Fiber-2重組質(zhì)粒由國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心構(gòu)建、鑒定與保存；Ⅰ群FAdV-4 FAV-HN株C3代毒種由國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心分離、鑒定與保存；LMH細(xì)胞由國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心保存；Ⅰ群FAdV-4陽(yáng)性血清由國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心鑒定、制備與保存。

1.3 Fiber-2蛋白的表達(dá)與純化 將重組質(zhì)粒pET-30a-Fiber-2，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）中，挑取單菌落至LB液體培養(yǎng)基中（硫酸卡那霉素的質(zhì)量濃度為50 μg/mL），37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；將菌液按照1∶100的體積比加至LB液體培養(yǎng)基（硫酸卡那霉素的質(zhì)量濃度為50 μg/mL）中；37℃繼續(xù)培養(yǎng)至菌液OD600值為0.6，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)8 h。對(duì)誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行超聲裂解，取離心后上清液加入終濃度為0.01 mol/L的咪唑，利用Ni SepharoseTM6 Fast Flow鎳柱進(jìn)行層析純化，收集流穿、洗脫液和洗脫樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，PBS透析除去咪唑并過(guò)濾除菌。使用Ⅰ群4型禽腺病毒陽(yáng)性血清進(jìn)行瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)，測(cè)定Fiber-2蛋白液的AGP效價(jià)。

1.4 Ⅰ群禽腺病毒（4型）FAV-HN株病毒液制備及滅活

1.4.1 病毒液制備及病毒含量測(cè)定 ?、袢呵菹俨《荆?型）FAV-HN株C3代毒種，按照0.1%的體積比接種至長(zhǎng)成單層的LMH細(xì)胞，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每6～8 h觀察1次細(xì)胞病變，待80%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)收獲。凍融2次，取樣測(cè)定病毒含量，其余置-20℃以下凍結(jié)保存。

1.4.2 病毒液滅活及檢驗(yàn) 取出凍結(jié)保存的Ⅰ群禽腺病毒（4型）FAV-HN株病毒液，融化后，加入2%的β-丙內(nèi)酯溶液，使β-丙內(nèi)酯的終濃度為0.1%，搖勻后，置2℃～8℃條件下滅活16 h，待病毒液溫度降至恒溫時(shí)開始計(jì)時(shí)，16 h后取出置37℃水解2 h。水解后取樣進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)和滅活檢驗(yàn)。

1.5 不同抗原含量的Fiber-2蛋白亞單位疫苗和全病毒滅活疫苗免疫效果比較

1.5.1 疫苗制備 為評(píng)價(jià)不同抗原含量的Fiber-2蛋白亞單位疫苗和全病毒滅活疫苗對(duì)SPF雞的免疫效力，本研究將純化的Fiber-2蛋白液分別稀釋至AGP效價(jià)為1∶16、1∶8、1∶4，將滅活檢驗(yàn)合格的病毒液按照滅活前病毒含量稀釋至病毒含量分別為107.0TCID50/0.1mL、106.5TCID50/0.1mL和106.0TCID50/0.1mL，分別按照水相∶油相（1∶2）乳化制備6種不同抗原含量的亞單位疫苗和全病毒滅活疫苗進(jìn)行免疫效果比較。

1.5.2 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 選取60只健康的21日齡SPF雞，隨機(jī)分為6個(gè)組，每組10只，分別經(jīng)腿部肌肉接種上述6種疫苗，20 μL/只，另設(shè)5只SPF雞接種滅菌生理鹽水作為攻毒對(duì)照、5只不免疫作為空白對(duì)照，分組情況詳見表1。免疫21 d后，將所有疫苗免疫組和攻毒對(duì)照組的雞只，經(jīng)腿部肌肉注射Ⅰ群FAdV-4 FAV-HN株病毒液，每只0.5 mL（含106.0TCID50），觀察7 d，記錄免疫組和攻毒對(duì)照組雞的發(fā)病和死亡情況，死亡雞立即剖檢，觀察大體剖檢病變并取肝臟進(jìn)行組織病理學(xué)觀察和免疫組化，至攻毒后7 d，所有存活雞剖檢，觀察大體剖檢病變并取肝臟進(jìn)行組織病理學(xué)觀察和免疫組化。

表1 試驗(yàn)分組Table 1 Test groups

1.5.3 泄殖腔拭子排毒 攻毒保護(hù)試驗(yàn)SPF雞于攻毒后3、5、7 d采集每只雞的泄殖腔拭子進(jìn)行PCR檢測(cè)排毒，提取泄殖腔拭子核酸，參考文獻(xiàn)[15]報(bào)道引物PCR檢測(cè)擴(kuò)增HexonL1基因片段。所使用的上、下游引物分別為HexonL1-F和HexonL1-R，目的片段約為900 bp，引物序列HexonL1-F為：5'-CAARTTCAGRCAGACGGT-3'，引物HexonL1-R為：5'-TAGTGATGMCGSGACATCAT-3'。

2 結(jié)果

2.1 Fiber-2蛋白的表達(dá)與純化 誘導(dǎo)重組大腸桿菌表達(dá)Ⅰ群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白，并利用Ni Sepharose 6 Fast Flow填料進(jìn)行親和層析，未純化的蛋白和不同時(shí)間點(diǎn)純化收集的蛋白、純化后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，結(jié)果可知，純化后的蛋白在55～70 kDa處可見到明顯的目的條帶，純度可達(dá)80%以上（圖1）。測(cè)定純化后Fiber-2蛋白液的AGP效價(jià)為1∶64。

圖1 Fiber-2蛋白純化過(guò)程SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of purification process of Fiber-2 protein

2.2 Ⅰ群禽腺病毒（4型）FAV-HN株病毒液制備及檢驗(yàn) 制備C4代病毒液，并取樣測(cè)定其病毒含量為107.4TCID50/0.1mL。

2.3 滅活后病毒液的滅活檢驗(yàn)及無(wú)菌檢驗(yàn) 對(duì)滅活后的病毒液進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)和滅活檢驗(yàn)，無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果顯示，接種后7 d，TG小管、GA斜面、TSB小管均無(wú)菌生長(zhǎng)，無(wú)菌檢驗(yàn)合格。滅活后病毒液接種LMH細(xì)胞進(jìn)行滅活檢驗(yàn)，盲傳2代，LMH細(xì)胞均未產(chǎn)生細(xì)胞病變，滅活檢驗(yàn)合格。

2.4 攻毒保護(hù) 攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，G組SPF雞于攻毒后第2～3 d發(fā)病，出現(xiàn)精神沉郁、羽毛蓬亂、不愿走動(dòng)、嗜睡等臨床癥狀，出現(xiàn)臨床癥狀后1～2 d死亡，死亡雞剖檢可見心包積液、肝臟腫大、出血等病理變化，至攻毒后第7 d，4/5死亡、5/5發(fā)病。A、B、D組免疫雞攻毒后全部健活，未出現(xiàn)任何臨床癥狀，攻毒后7 d剖檢，均無(wú)異常。C、E組免疫雞均1/10出現(xiàn)羽毛蓬亂、不愿走動(dòng)等臨床癥狀，攻毒后7 d剖檢，1/10～2/10免疫雞出現(xiàn)少量心包積液或肝臟腫大等病變，而F組免疫雞攻毒后7 d內(nèi)5/10死亡、9/10發(fā)病，攻毒后7 d剖檢，9/10免疫雞出現(xiàn)心包積液或肝臟腫大、出血等病變。結(jié)果詳見表2和圖2。

圖2 不同抗原含量疫苗組的剖檢病變結(jié)果Fig.2 Anatomy results of different vaccine groups

表2 不同抗原含量疫苗組的攻毒保護(hù)結(jié)果Table 2 Challenge protection results of different vaccine groups

2.5 肝臟組織病理學(xué)觀察和免疫組化 攻毒后7 d內(nèi)，立即剖檢死亡雞，取肝組織進(jìn)行HE染色和免疫組化，至攻毒后7 d，所有存活雞剖檢取肝臟組織進(jìn)行HE染色和免疫組化檢測(cè)，結(jié)果可知，A、B、D組免疫雞肝組織HE染色未見明顯病變，免疫組化均為陰性；C、E組免疫雞1/10～2/10可見不同程度的肝細(xì)胞脂肪變性、壞死，核內(nèi)包涵體及局灶性淤血出血，1/10免疫組化陽(yáng)性；F組免疫雞9/10免疫雞可見不同程度的肝細(xì)胞脂肪變性、壞死，大量核內(nèi)包涵體及大面積淤血出血，8/10免疫組化陽(yáng)性。G組免疫雞均可見大量肝細(xì)胞脂肪變性、壞死，大量核內(nèi)包涵體及大面積淤血出血，且免疫組化均為陽(yáng)性（圖3～4，表3）。

圖3 不同抗原含量疫苗組的HE染色結(jié)果Fig.3 HE staining results of different vaccine groups

圖4 不同抗原含量疫苗組的免疫組化染色結(jié)果Fig.4 Immunohistochemical results of different vaccine groups

表3 不同抗原含量疫苗組的免疫組化染色結(jié)果Table 3 Immunohistochemical results of different vaccine groups

2.6 泄殖腔拭子排毒 于攻毒后3、5、7 d分別采集每組雞泄殖腔拭子，采用PCR測(cè)定雞泄殖腔拭子排毒情況，結(jié)果可知，A、B和D組攻毒后不同時(shí)間均未檢測(cè)到排毒，而C、E、F組均檢測(cè)到不同程度的排毒，綜合分析，A、B和D組免疫效果相當(dāng)，C略優(yōu)于E組，F(xiàn)組免疫效果最差（表4）。

表4 不同抗原含量疫苗組的泄殖腔拭子排毒結(jié)果Table4 Cloacal swab detoxification results of different vaccine groups

3 討論

禽腺病毒是一種在全世界范圍內(nèi)廣泛流行的家禽和野禽常見的傳染病病原。其分為3個(gè)亞群，Ⅰ亞群禽腺病毒分為A、B、C、D、E 5個(gè)種，12個(gè)血清型，其中雞肝炎-心包積液綜合征是由血清4型引起。該病首次在巴基斯坦的安卡拉地區(qū)發(fā)生，隨后陸續(xù)在韓國(guó)、印度、美國(guó)等地區(qū)流行[16]。該病于2014年在我國(guó)零星發(fā)生，但2015年起，在我國(guó)多地呈暴發(fā)式傳播，致死率高達(dá)50%，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，疫苗接種是預(yù)防和控制該病傳播的主要手段之一。

在HHS暴發(fā)初期，有研究報(bào)道將感染雞肝臟組織研磨、滅活，制備組織滅活疫苗用于預(yù)防該病傳播具有一定的效果，但組織苗存在制備工藝復(fù)雜、滅活不徹底等問題；為了更好的防控該病的傳播，采用細(xì)胞培養(yǎng)和SPF雞胚制備滅活苗成為更好的選擇，但是仍存在部分毒株在細(xì)胞和雞胚上增殖效果差，生產(chǎn)成本高等諸多問題。有研究報(bào)道，針對(duì)HHS的預(yù)防與治療，與滅活苗相比，通過(guò)重組蛋白制備的亞單位疫苗可以為該病提供更好的防控[17-18]，而且亞單位疫苗生產(chǎn)工藝抗原生產(chǎn)成本低、不存在滅活不徹底、抗原含量不易達(dá)標(biāo)、活毒操作存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)等不足，因此重組蛋白亞單位疫苗有望成為繼滅活苗后更理想的新型疫苗。

王晨等[19-20]利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)Fiber-2蛋白制備FAdV-4亞單位疫苗，該疫苗可為免疫雞提供理想的免疫攻毒保護(hù)。但真核表達(dá)系統(tǒng)工藝復(fù)雜，成本較高。本研究選用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，獲得可溶性的AGP效價(jià)不低于1∶64的Fiber-2蛋白，工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，制備的亞單位疫苗免疫攻毒保護(hù)效果確實(shí)，適合進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，使用荷蘭BioChek商品化的禽腺病毒Ⅰ群（FADV-I）抗體ELISA試劑盒對(duì)Fiber-2蛋白亞單位疫苗和全病毒疫苗免疫血清進(jìn)行抗體檢測(cè)時(shí)，前者血清抗體值顯著低于后者。對(duì)造成這種現(xiàn)象的原因進(jìn)行分析，ELISA試劑盒使用全病毒為包被抗原，F(xiàn)AdV-4病毒粒子中結(jié)構(gòu)蛋白Hexon占比較高，而Fiber-2蛋白極低，因此使用ELISA試劑盒測(cè)得的Fiber-2抗體結(jié)果較低甚至陰性。因此不能使用全病毒為包被抗原的ELISA試劑盒評(píng)價(jià)Fiber-2亞單位疫苗免疫血清的抗體效價(jià)[21]。

本研究制備不同抗原含量的Fiber-2蛋白亞單位疫苗和全病毒滅活疫苗，在超低免疫劑量情況下，對(duì)全病毒滅活疫苗和亞單位疫苗的免疫效果進(jìn)行全面比較研究，免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)iber-2蛋白具有良好的免疫原性，抗原含量AGP效價(jià)不低于1∶4，與全病毒滅活疫苗抗原含量為106.5TCID50/0.1mL免疫效力相當(dāng)，可用于疫苗研制開發(fā)。