林瑜婷，翟 頎，翟少倫，呂殿紅，周秀蓉，賈春玲，霍 瑋，溫肖會，魏文康,3

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科技學(xué)院，廣州 510225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所 廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實驗站，廣州 510640；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心，廣州 510640）

犬細(xì)小病毒病是由細(xì)小病毒科（Parvoviridae）細(xì)小病毒屬（Parvovirus）的犬細(xì)小病毒（Canine parvovirus,CPV）感染犬只引起的致命性傳染病[1]，該病常以出血性腸炎、白細(xì)胞含量顯著減少、腥臭血便和嚴(yán)重脫水等為主要臨床特征，部分表現(xiàn)為突然死亡的急性心肌炎型[2]。犬細(xì)小病毒病傳染性強，死亡率較高，全年都可以流行，嚴(yán)重危害犬只健康，給我國寵物飼養(yǎng)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。CPV基因組全長5233 bp，含兩個開放閱讀框，分別編碼兩個結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2）和非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2）[4]，VP1基因全長2181 bp，編碼726個氨基酸，而VP2基因完全包含在VP1的序列中，全長1755 bp，編碼584個氨基酸。VP2蛋白是CPV病毒衣殼的主要組成部分，在病毒的感染和復(fù)制過程中起著重要作用[6]，其幾個關(guān)鍵堿基和氨基酸的改變就可能導(dǎo)致病毒發(fā)生變異[7]，自1970年CPV被成功分離以來，病毒不斷發(fā)生突變形成了新的基因型CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c，并在不同地區(qū)之間流行，形成了具有不同地理特征的毒株[8]。

本研究于2019年收集8份河南省方城縣某動物醫(yī)院疑似CPV感染犬糞便樣品，并在貓腎細(xì)胞（Crandell-Rees feline kidney cell,CRFK）上接種培養(yǎng)，通過PCR檢測、細(xì)胞病變（cytopathic effct,CPE）情況、電鏡檢測、TCID50測定以及VP2基因序列分析，對病毒進(jìn)行分離鑒定和毒株亞型的確定，為了解河南省CPV的變異狀況和流行趨勢提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品、細(xì)胞和主要試劑 樣品采集于河南省方城縣某動物醫(yī)院犬糞便；CRFK細(xì)胞由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所動物疫病診斷中心實驗室保存；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自Gibco公司；pMD-19T克隆載體、DL2000 DNA marker、DNA凝膠回收試劑盒、Top10感受態(tài)細(xì)胞、DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 樣品處理 向樣品中加入含0.1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液，混合均勻，反復(fù)凍融3次，8000 ×g離心10 min后取上清液，0.22 μm濾膜過濾上清液，收集濾液于-80℃保存，待用。

1.3 樣品PCR檢測 將處理好的樣品按照DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取。參考本實驗室已建立的犬瘟熱病毒（Canine distemper virus,CDV）、犬副流感病毒（Canine parainfluenza virus,CPIV）和CPV的多重PCR檢測方法[9]鑒定CDV、CPV、CPIV。具體引物序列見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)體系為：DNA模板 2 μL，所有引物各0.5 μL，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O補至25 μL。PCR反應(yīng)程序：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min；95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個循環(huán)；72℃再延伸7 min，12℃保存。PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，檢測樣品中是否有犬細(xì)小病毒。

表1 PCR引物序列Table 1 Primers used for PCR Assay

1.4 病毒增殖 將處理好的樣品上清液接種于CRFK細(xì)胞中，細(xì)胞長成單層后加入含2% FBS的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，另設(shè)不接種病毒的CRFK細(xì)胞作為陰性對照。每天觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞病變并記錄，棄掉盲傳3代無CPE的細(xì)胞；產(chǎn)生CPE的細(xì)胞繼續(xù)盲傳3代，當(dāng)出現(xiàn)80%的CPE時，收獲病毒，于-80℃保存待用。

1.5 病毒電鏡觀察 超速離心純化病毒液，吸附銅網(wǎng)1 min，1%磷酸鎢染液負(fù)染后，透射電鏡下觀察病毒粒子形態(tài)。

1.6 病毒TCID50測定 調(diào)整CRFK細(xì)胞懸液濃度接種于96孔板，并對病毒樣品的F6代細(xì)胞毒10倍倍比稀釋，同步接種，每個稀釋度接種8孔，同時設(shè)置正常細(xì)胞作為對照，每天觀察并記錄CPE孔數(shù)，按Reed-Muench法計算病毒的TCID50。

1.7 CPVVP2基因PCR擴(kuò)增 對5份樣品的F6代細(xì)胞毒按照DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行DNA提取，參考GenBank中已發(fā)表的CPVVP2基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物，序列見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)體系為：DNA模板 2 μL，VP2-F/R各0.5 μL，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O補至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，56℃復(fù)性30 s，72℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72℃再延伸10 min，12℃保存。PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定，并用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。將純化后的回收產(chǎn)物連接到pMD-19T載體上，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.8 CPVVP2基因序列分析 運用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接，將所獲得的VP2基因序列與NCBI上已公布的CPV的標(biāo)準(zhǔn)毒株（GenBank登錄號：M24003.1)、疫苗株（GenBank登錄號：GU21279.1、FJ197846.1）、22株國內(nèi)外不同基因型的CPV分離株進(jìn)行比對分析，運用MEGA 7.0進(jìn)行核苷酸序列同源性比對，運用DNAStar分析氨基酸序列，分析氨基酸變異情況并確定所分離的CPV毒株基因型[10]（表2）。運用MEGA 7.0 Neighbor-joining程序（參數(shù)設(shè)置為1000 replications）繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表2 犬細(xì)小病毒基因分型方法Table 2 Genotyping method of Canine parvovirus

2 結(jié)果

2.1 樣品PCR檢測 參考本實驗室已建立的PCR檢測方法進(jìn)行檢測，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示，本次收集的8份樣品中，1、2、5、6、7號樣品采用CPV擴(kuò)增引物均能擴(kuò)增出1033 bp目的條帶，其余3、4、8號樣品未出現(xiàn)目的條帶，8份樣品采用CDV和CPIV特異性引物擴(kuò)增未出現(xiàn)目的條帶（圖1）。

圖1 糞便樣品PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR result of stool samples

2.2 病毒增殖 將5份陽性樣品分別接種于單層培養(yǎng)的CRFK細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變。接毒細(xì)胞均出現(xiàn)拉網(wǎng)、空泡和變圓脫落的典型細(xì)胞病變，對照組細(xì)胞正常（圖2）。接毒細(xì)胞繼續(xù)盲傳3代，觀察到穩(wěn)定的細(xì)胞病變現(xiàn)象，證明成功分離到5株病毒，將出現(xiàn)CPE的樣品分別命名為China-HN-01、China-HN-02、China-HN-05、China-HN-06、China-HN-07。

圖2 感染CPV的CRFK細(xì)胞和健康CRFK細(xì)胞Fig.2 Healthy CRFK cell and CRFK cell infected with CPV

2.3 電鏡形態(tài)學(xué)觀察 取純化后的CPV病毒液進(jìn)行1%磷酸鎢負(fù)染，透射電鏡下5株CPV分離株均可觀察到外形結(jié)構(gòu)呈圓形或二十面體結(jié)構(gòu)、直徑為20～25 nm的無囊膜病毒粒子（圖3），符合細(xì)小病毒的形態(tài)大小特征。

圖3 病毒粒子電鏡下形態(tài)觀察Fig.3 Electron microscopy image of virus particles

2.4 TCID50測定結(jié)果 將5株CPV分離株的細(xì)胞毒倍比稀釋后同步接種于CRFK細(xì)胞，每日觀察CPE情況，處理數(shù)據(jù)后按照Reed-Muench法計算毒株的TCID50（如表3）。

表3 CPV毒株TCID50測定結(jié)果Table 3 TCID50 of CPV isolates

2.5 CPVVP2基因PCR擴(kuò)增 提取5株CPV毒株的F6代細(xì)胞培養(yǎng)液中DNA，對其VP2基因進(jìn)行擴(kuò)增，通過1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。結(jié)果表明，5份樣品均在1755 bp處出現(xiàn)目的條帶（圖4）。

圖4 CPV VP2 PCR鑒定結(jié)果Fig.4 The PCR result of CPV VP2

2.6 CPVVP2基因序列分析

2.6.1 CPV毒株亞型分析 根據(jù)測序所獲得的CPVVP2基因序列翻譯獲得其氨基酸序列，參考分型標(biāo)準(zhǔn)確定CPV毒株亞型。對CPV毒株進(jìn)行氨基酸突變分析，發(fā)現(xiàn)5株CPV毒株的第297位氨基酸都由S突變?yōu)锳，且China-HN-01、China-HN-02、China-HN-05、China-HN-07毒株中第426位氨基酸為N，故其屬于New CPV-2a亞型，China-HN-06發(fā)生了5A→G、370Q→R、426N→E和440A→T的突變，通過和參考毒株的比對以及參考分型標(biāo)準(zhǔn)，確定China-HN-06為CPV-2c亞型。

2.6.2 CPV VP2主要氨基酸位點突變分析 CPVVP2基因全長為1755 bp，共編碼584個氨基酸。通過核苷酸序列翻譯5株CPV毒株及參考毒株的氨基酸序列，運用MEGA 7.0軟件進(jìn)行比對分析，結(jié)果見表4。與4株基因型為New CPV-2a的參考毒株相比，China-HN-01、China-HN-05較為保守，VP2蛋白沒有發(fā)生氨基酸突變，China-HN-02、China-HN-07發(fā)生了不同程度的氨基酸突變。與5株基因型為CPV-2c的參考毒株相比，China-HN-06在VP2蛋白上發(fā)生了4處氨基酸突變。New CPV-2a亞型毒株的突變情況為China-HN-02的T101A、I357T和China-HN-07的P74L，CPV-2c亞型毒株China-HN-06發(fā)生氨基酸突變的位點較多，有R16G、R191G、T223I、L294S共4處突變。

表4 CPV VP2蛋白氨基酸突變位點Table 4 Variable amino acid sites of VP2 protein

2.6.3 同源性分析 將此次分離得到的5株CPV毒株和GenBank上已發(fā)表的國內(nèi)14株和國外11株CPV的基因序列進(jìn)行比對。結(jié)果可知，5株CPV毒株之間的核苷酸同源性為95.1%～99.7%，與商品化疫苗株GU212791.1和FJ197846.1的同源性為97.8%～98.7%，與其他參考毒株的同源性為94.0%～99.0%（圖5）。

圖5 CPV毒株VP2基因核苷酸同源性比對分析Fig.5 Nucleotide homology alignment analysis of VP2 gene of the CPV isolate

2.6.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 運用MEGA 7.0軟件，對5株CPV毒株以及GenBank數(shù)據(jù)庫中14株國內(nèi)和11株國外CPV的VP2基因序列進(jìn)行比對，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。由結(jié)果可知，China-HN-01、China-HN-02、China-HN-05、China-HN-07與國內(nèi)四川地區(qū)分離到的同為New CPV-2a亞型毒株的親緣關(guān)系較近；China-HN-06與蒙古國的CPV-2c亞型分離株位于同一分支，親緣關(guān)系較近，與我國河南地區(qū)分離到的其中1株CH-HN-D27親緣關(guān)系接近但不同屬一支，與河南地區(qū)的CH-HN-D22、CH-HN-D23、CH-HN-D25株CPV-2c分離株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，5株CPV毒株與疫苗株Nobivac DHPPL和Vanguardplus5屬于不同分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖6）。

圖6 CPV VP2核苷酸序列遺傳進(jìn)化樹Fig.6 The nucleotide sequence genetic tree analysis of VP2 gene of CPV

3 討論

本實驗從8份疑似CPV感染的犬只糞便中檢測出5份CPV陽性樣品，后經(jīng)PCR檢測、電鏡檢測、細(xì)胞病變觀察和VP2基因測序分析確定所增殖的病毒為CPV。根據(jù)CPV亞型分型標(biāo)準(zhǔn)對毒株進(jìn)行分型和命名，確定China-HN-01、China-HN-02、China-HN-05、China-HN-07為New CPV-2a亞型，China-HN-06為CPV-2c亞型。目前全球流行的CPV毒株主要為2a、2b和2c亞型，我國以New CPV-2a亞型為主要流行毒株[11]，2000年，CPV-2c于意大利首次被報道[12]，其后，CPV-2c逐漸成為歐美國家的主要流行亞型。2010年，我國首次檢測到CPV-2c[13]，2014年成功分離第一株中國CPV-2c毒株[14]，隨后，我國多個城市陸續(xù)發(fā)現(xiàn)CPV-2c型，包括吉林、黑龍江、北京、廣西等地[15]，本研究從河南方城地區(qū)再次檢測到CPV-2c毒株，說明CPV-2c亞型毒株在我國的流行呈上升趨勢。

VP2基因是CPV的特異性基因，是最主要的毒力基因，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。本試驗根據(jù)VP2基因參考序列設(shè)計合成特異性引物，對VP2基因進(jìn)行了克隆分析。結(jié)果顯示，5份樣品的細(xì)胞培養(yǎng)物均能擴(kuò)增出1755 bp的目的片段，測序比對顯示目的序列與已發(fā)表的CPV同源性均達(dá)99%以上，從分子水平證明了5株均為CPV毒株。經(jīng)過氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)China-HN-02株的VP2基因發(fā)生了T101A突變，但是China-HN-02株的VP2蛋白功能是否發(fā)生改變還有待后續(xù)研究。CPV-2c亞型的China-HN-06毒株與疫苗株的核苷酸同源性稍低為97.8%和97.9%，且該毒株與參考毒株比對有4個氨基酸位點突變：R16G、R191G、T223I、L294S，但這四個非同義位點的突變是否會對病毒的生物學(xué)特性產(chǎn)生影響還有待進(jìn)一步研究。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，CPV在進(jìn)化過程中形成不同的分支，4株New CPV-2a亞型毒株與四川分離株的親緣關(guān)系最近，屬于同一分支，推測4株New CPV-2a的毒株可能由四川分離株進(jìn)化而來。CPV-2c亞型的China-HN-06毒株與另外3株河南地區(qū)的CPV-2c分離株不在同一分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，說明CPV仍在不斷進(jìn)化突變，河南地區(qū)目前已經(jīng)存在不同突變的CPV-2c亞型的分離株，因此有必要及時監(jiān)測CPV的變異情況，加強對CPV-2c亞型的監(jiān)測。

本實驗對河南方城地區(qū)發(fā)現(xiàn)的CPV毒株進(jìn)行分析，為研究CPV變異株在河南地區(qū)的傳播和寵物疫病防控提供了理論依據(jù)。