鐘福春 陳甜 張抒彧 唐堯 羅薈辰 季文軒 薛飛 張愛芳 薛恒

急性呼吸道感染是引起門診就診和住院治療的主要原因之一，其中80%以上由病毒所致[1]。傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)方法操作煩瑣，臨床常規(guī)開展受限[2]。病毒抗原進(jìn)行準(zhǔn)確、快速檢測，有助于早期診斷，指導(dǎo)臨床精準(zhǔn)選擇用藥，阻止疾病流行，并減少經(jīng)驗(yàn)性檢測敏感性較低，易受其他因素干擾的影響[2]。血清抗體檢測具有滯后性，主要用于病毒流行病調(diào)查[3]。基于病毒核酸的實(shí)時熒光定量RT-PCR方法因其所具備的優(yōu)勢，是早期篩查和診斷呼吸道病毒感染的主要方法之一[4]。其中，對樣本進(jìn)行核酸提取和對提取物進(jìn)行擴(kuò)增是目前通用的病毒核酸檢測步驟，然而核酸提取體系和擴(kuò)增系統(tǒng)常常隨機(jī)混搭組合，形成多套檢測系統(tǒng)。這些不同的檢測系統(tǒng)在核酸檢測性能方面是否存在差別，須通過對比分析進(jìn)行驗(yàn)證。達(dá)安基因核酸提取或純化試劑（磁珠法）為常用的病毒核酸提取試劑，根據(jù)其說明書有常規(guī)核酸提取程序和快速核酸提取程序可供選擇。本研究選用這兩種核酸提取程序與不同的實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行混搭組合，通過比較陽性檢出率、Ct值和批內(nèi)重復(fù)性來探索不同檢測系統(tǒng)的性能差異，預(yù)期為實(shí)驗(yàn)室選擇最適的檢測方案提供參考。

1 資料與方法

1.1 試劑和儀器

核酸提取或純化試劑（廣州達(dá)安基因股份有限公司，粵穗械備20170583，32反應(yīng)/盒）；核酸檢測試劑盒（廣州達(dá)安基因股份有限公司，國械注準(zhǔn)20203400749，96人份/盒）；Smart32核酸提取儀（廣州達(dá)安基因股份有限公司）；ABI7500熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；AGS8830-16實(shí)時熒光定量PCR儀（廣州達(dá)安基因股份有限公司）。

ABI7500和AGS8830-16熒光定量PCR儀分別為普通和快速實(shí)時熒光定量PCR儀。將核酸提取試劑的常規(guī)核酸提取程和快速核酸提取程序分別和兩種擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)行混搭構(gòu)建四種檢測系統(tǒng)，A為常規(guī)核酸提取程序+ABI7500熒光定量PCR儀，B為快速核酸提取程序+ABI7500熒光定量PCR儀，C為常規(guī)核酸提取程序+AGS8830-16實(shí)時熒光定量PCR儀，D為快速核酸提取程序+AGS8830-16實(shí)時熒光定量PCR儀。

1.2 一般材料

假病毒第三方弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品為從廣州邦德盛生物科技有限公司購買的病毒核糖核酸液體室內(nèi)質(zhì)控品（批號 ：2022201）平均濃度為5.1×102copies/mL，濃度參考范圍：2.03×102～1.28×103copies/mL。將弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品用去離子水按1∶2、1∶5、1∶10、1∶50、1∶100和1∶500進(jìn)行稀釋。分別采用A、B、C和D檢測系統(tǒng)對每個濃度質(zhì)控品進(jìn)行20次重復(fù)檢測。

1.3 方法

1.3.1 核酸提取

弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品充分震蕩混勻后，于核酸提取96深孔板第1、7列孔內(nèi)加入200 μL樣本或質(zhì)控品、20200 μL蛋白酶K。將深孔板放入Smart32全自動核酸提取儀底座，磁棒套推入卡槽。按核酸提取試劑說明書設(shè)置57 min的常規(guī)核酸提取程序和18 min的快速核酸提取程序，分別對不同濃度的弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品進(jìn)行核酸提取，具體步驟見核酸提取儀和核酸提取試劑說明書。

1.3.2 核酸擴(kuò)增

按擴(kuò)增試劑說明書配置反應(yīng)的體系、設(shè)置熒光定量PCR儀擴(kuò)增反應(yīng)的程序和熒光收集的通道。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后按擴(kuò)增試劑說明書進(jìn)行結(jié)果判定。具體步驟按儀器和擴(kuò)增試劑說明書進(jìn)行設(shè)置和操作。該擴(kuò)增試劑可同時檢測3個靶基因，靶基因1和靶基因2為病毒相關(guān)基因，靶基因3為人源性內(nèi)標(biāo)基因，用于監(jiān)控采樣質(zhì)量。由于擴(kuò)增試劑設(shè)置了擴(kuò)增反應(yīng)程序不采集前10個循環(huán)的熒光信號，因此，Ct值＝原始Ct值+10。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料運(yùn)用（±s）表示，各組間靶基因Ct值選用單因素方差分析來比較，當(dāng)方差齊性時兩組間比表較選用LSD-t檢驗(yàn)來比較，不齊時采用Tamhane's檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用n（%）表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4種檢測系統(tǒng)在不同濃度假病毒弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品中靶基因的檢出率

在假病毒弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品原濃度和1∶2稀釋度時，4種組合均100%檢出靶基因1及靶基因2。1∶5稀釋度時，A、B檢測系統(tǒng)均可100%檢出靶基因1及靶基因2；C、D檢測系統(tǒng)均可100%檢出靶基因2，但靶基因1的檢出率分別為90.00%和80.00%。隨弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品濃度的降低，4種檢測系統(tǒng)靶基因的檢出率均隨之下降，其中靶基因檢出率由高到低為A＞B＞C＞D，見表1。

表1 4種檢測系統(tǒng)在不同濃度假病毒弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品中的靶基因檢出率（%）

2.2 4種檢測系統(tǒng)在不同濃度假病毒弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品中的靶基因Ct值

4種檢測系統(tǒng)在質(zhì)控品原濃度和1:2稀釋度時均可100%檢出靶基因，故比較這兩濃度擴(kuò)增的Ct值。原濃度時，A、B、C和D系統(tǒng)擴(kuò)增靶基因1的Ct值分別為（31.35±0.90）、（32.00±0.79）、（32.40±0.97）和（33.12±1.15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝11.286，P＜ 0.05）；A系統(tǒng)靶基因1的Ct值小于B系統(tǒng)（LSD-t＝-2.080，P＜0.05）、小于C系統(tǒng)（LSD-t＝-3.364，P＝0.001）、小于D系統(tǒng)（LSD-t＝-5.673，P＜0.0001），B系統(tǒng)靶基因1的Ct值低于D系統(tǒng)（LSD-t＝-3.593，P＜0.001），C系統(tǒng)靶基因1的Ct值低于D系統(tǒng)（LSD-t＝-2.309，P＜0.05）；A、B、C和D系統(tǒng)靶基因2的Ct值分別為（30.99±0.81）、（31.49±0.68）、（32.08±0.78）和（32.41±0.80），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝12.749，P＜0.05），A系統(tǒng)靶基因2的Ct值小于B系統(tǒng)（LSD-t＝-2.017，P＜0.05）、小于C系統(tǒng)（LSD-t＝-4.378，P＜0.0001）、小于D系統(tǒng)（LSD-t＝-5.694，P＜0.0001），B系統(tǒng)靶基因2的Ct值小于C系統(tǒng)（LSD-t＝-2.361，P＜0.05）、小于D系統(tǒng)（LSD-t＝-3.677，P＜0.001），見圖1a。1∶2稀釋度時，A、B、C和D系統(tǒng)靶基因1的Ct值分別為（32.88±0.47）、（33.07±0.62）、（33.62±0.55）和（34.32±0.70），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝22.748，P＜0.05），A系統(tǒng)靶基因1的Ct值小于C系統(tǒng)（LSD-t＝-3.847，P＜0.001）、小于D系統(tǒng)（LSD-t＝-7.501，P＜0.0001），B系統(tǒng)靶基因1的Ct值小于C系統(tǒng)（LSD-t＝-2.889，P＜0.01）、小于D系統(tǒng)（LSD-t＝-6.543，P＜0.0001），C系統(tǒng)靶基因1的Ct值低于D系統(tǒng)（LSD-t＝-3.654，P＜0.001）；A、B、C和D系統(tǒng)靶基因2的Ct值分別為（32.70±0.52）、（32.97±0.62）、（33.19±0.62）和（34.12±0.81），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝16.961，P＜0.0001），A系統(tǒng)靶基因2的Ct值小于C系統(tǒng)（LSD-t＝-2.338，P＜0.05）、小于D系統(tǒng)（LSD-t＝-6.713，P＜0.0001），B系統(tǒng)靶基因2的Ct值低于D系統(tǒng)（LSD-t＝-5.415，P＜0.0001），C系統(tǒng)靶基因2的Ct值低于D系統(tǒng)（LSD-t＝-4.375，P＜0.0001），見圖1b。

圖1 4種檢測系統(tǒng)在不同濃度假病毒弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品中的靶基因Ct值

2.3 4種檢測系統(tǒng)的檢測耗時和批內(nèi)重復(fù)性比較

常規(guī)核酸提取程序和快速核酸提取程序核酸提取耗時分別為57 min和18 min，ABI 7500熒光定量PCR儀和AGS8830-16實(shí)時熒光定量PCR儀擴(kuò)增耗時分別為63 min和42 min。4種檢測系統(tǒng)檢測耗時由低到高為：D＜C＜B＜A。A、B、C和D檢測系統(tǒng)在弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品原濃度和1∶2稀釋度時檢測靶基因1和靶基因2Ct值的變異系數(shù)（CV）均＜5%，均符合核酸提取和擴(kuò)增試劑說明書批內(nèi)重復(fù)性≤5%的標(biāo)準(zhǔn)，見表2。

表2 4種檢測系統(tǒng)的檢測耗時和批內(nèi)重復(fù)性比較

3 討論

急性呼吸道病毒感染的常規(guī)檢測方法包括基于病毒蛋白的抗原檢測、基于人體免疫反應(yīng)的抗體檢測和基于病毒核酸的核酸檢測?？乖涂贵w檢測無需專用分析儀器，通常30 min內(nèi)即可判讀[5-6]。但是，需體內(nèi)病毒載量足夠高時，才可得到準(zhǔn)確結(jié)果，且存在交叉反應(yīng)[5]。與其他檢測方法不同，實(shí)時熒光RT-PCR的特異性幾乎為100%，同時又具有較高的敏感性，病毒感染早期即能診斷[4]。這些特性使實(shí)時熒光RT-PCR成為病毒感染診斷的主要方法之一。在實(shí)際臨床檢測過程中，每個基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室通常使用多種核酸提取系統(tǒng)、擴(kuò)增試劑和擴(kuò)增系統(tǒng)，不同品牌的試劑和設(shè)備多混搭組合建立起多種核酸檢測系統(tǒng)。這些不同的檢測系統(tǒng)在核酸檢測性能方面是否存在差別，必須通過對比分析進(jìn)行驗(yàn)證。

實(shí)時熒光RT-PCR檢測病毒起始核酸模板質(zhì)量，尤其當(dāng)體內(nèi)病毒載量十分低時能否順利檢出病毒核酸，直接關(guān)系到檢測結(jié)果是否準(zhǔn)確，是否導(dǎo)致漏檢[7]。為了更好地體現(xiàn)4種檢測系統(tǒng)在病毒核酸檢測中性能差異，本研究選擇了第三方弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品作為研究材料，并對其進(jìn)行了不同程度的稀釋。對上述樣本進(jìn)行核酸提取和擴(kuò)增，就可以更好地摸清不同檢測系統(tǒng)的靶基因檢出能力及假陰性差異。

本研究中在弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品原濃度和1∶2稀釋度時，A、B、C和D檢測系統(tǒng)均可以100%檢出靶基因；但檢測系統(tǒng)C和D在1∶5稀釋度時靶基因1的檢出率分別為90%和80%，而靶基因2可100%檢出，提示靶基因1和靶基因2的檢測敏感性存在著差異。隨著弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品濃度的降低，A、B、C和D檢測系統(tǒng)靶基因的檢出率均隨之下降，檢出率由高到低為A＞B＞C＞D，提示不同檢出系統(tǒng)靶基因檢出率存在著差別。進(jìn)一步對靶基因的Ct值進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品原濃度和1∶2稀釋度時，A檢測系統(tǒng)靶基因1和靶基因2的Ct值最低，D檢出系統(tǒng)最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此，可認(rèn)為A檢測系統(tǒng)靶基因的Ct值越低，靶基因的檢出率越高，在病毒載量十分低時，其檢測優(yōu)勢就越發(fā)明顯。由于4種檢測系統(tǒng)在弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品原濃度和1∶2稀釋度時均可100%檢出靶基因，因此對這兩濃度質(zhì)控品提取擴(kuò)增后的C進(jìn)行結(jié)果接近程度的評估，結(jié)果顯示4種檢測系統(tǒng)的批內(nèi)重復(fù)性均在5%的范圍內(nèi)，檢測結(jié)果均穩(wěn)定，符合要求。在檢測耗時方面，常規(guī)核酸提取程序耗時57 min、快速核酸提取程序耗時18 min，普通實(shí)時熒光定量PCR儀耗時63 min、快速實(shí)時熒光定量PCR儀耗時42 min；因此，D檢測系統(tǒng)總體檢測耗時最低，A檢測系統(tǒng)最高，D檢測系統(tǒng)可明顯縮短全程檢測耗時，在特殊原因需要盡快得到核酸檢測結(jié)果的情形下具有明顯優(yōu)勢。

既往研究發(fā)現(xiàn)，不同品牌核酸提取系統(tǒng)、擴(kuò)增試劑和擴(kuò)增系統(tǒng)的核酸檢測結(jié)果可出現(xiàn)一些差異[8-12]。黃裕游等[8]采用4種品牌的核酸提取試劑對第3方質(zhì)控品進(jìn)行了核酸提取，擴(kuò)增提取物后發(fā)現(xiàn)不同提取試劑在陽性率、靶基因Ct值有差異。本研究使用同一種核酸提取系統(tǒng)，選用不同核酸提取程序進(jìn)行核酸提取，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的核酸提取程序不僅在核酸提取耗時，而且在靶基因檢出率和擴(kuò)增Ct值上也存在不同程度的差異。黃玉蘭等[9]選用3種普通擴(kuò)增系統(tǒng)分別進(jìn)行標(biāo)本檢測，發(fā)現(xiàn)不同品牌擴(kuò)增儀的檢測原理和使用維護(hù)狀況不同可引起檢測結(jié)果不同。本研究對普通實(shí)時熒光定量PCR儀和快速實(shí)時熒光定量PCR儀進(jìn)行比較，也得出相似的結(jié)果。李卓敏等[10]采用不同的核酸提取儀與不同的擴(kuò)增儀組合檢測陰性樣本和弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品，發(fā)現(xiàn)不同系統(tǒng)組合在檢測效能上存在差別。本研究選用同一核酸提取試劑不同核酸提取程序與不同的擴(kuò)增系統(tǒng)進(jìn)行組合建立4種檢測系統(tǒng)，也發(fā)現(xiàn)這些不同試劑和儀器設(shè)備隨機(jī)混搭組也可對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響，甚至出現(xiàn)漏診的風(fēng)險。

綜上所述，本研究采用不同的核酸提取程序與不同的擴(kuò)增系統(tǒng)組合建立了4種核酸檢測系統(tǒng)，結(jié)果顯示4種檢測系統(tǒng)的檢測性能存在差別。同時也顯示，同一核酸提取系統(tǒng)不同的核酸提取程序也可對病毒核酸檢測結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自身?xiàng)l件和檢測需求選擇最適的核酸檢測體系。本研究的不足在于使用弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品代替病毒感染患者樣本來比較不同檢測系統(tǒng)的性能，弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品為假病毒，而且與患者樣本在基質(zhì)上存在著不同，可能影響檢測的結(jié)果。