郄夢(mèng)潔 李 政 趙姍姍 陽曉婷 趙 燕

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100081）

甘肅省慶陽市環(huán)縣水質(zhì)苦咸、礦化程度高、無污染，野生草藥資源豐富，盛產(chǎn)地椒、麻黃等供羊食用的100多種中藥材［1］。環(huán)縣草場(chǎng)廣闊，羊只年飼養(yǎng)量70萬只以上，農(nóng)戶按照“10+1”模式養(yǎng)殖灘羊、小尾寒羊、湖羊；按照“30+2”模式養(yǎng)殖絨山羊和黑山羊［1］。盛產(chǎn)的羊羔肉是環(huán)縣傳統(tǒng)地方風(fēng)味名吃，具有嫩而不膻、瘦而不柴、營養(yǎng)豐富、味道鮮美的特質(zhì)，素有“朝登黃土地、暮住土窯洞、饑食中藥草、渴飲礦泉水”的美譽(yù)［2］?！碍h(huán)縣羊羔肉”是著名的地理標(biāo)志產(chǎn)品，榮獲全國十佳羊肉品牌第一名和全國綠色農(nóng)業(yè)十佳畜牧地標(biāo)品牌等殊榮［2-3］。雖然環(huán)縣已逐漸形成肉羊產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；?、機(jī)械化、舍飼化發(fā)展，但部分散戶也面臨著飼養(yǎng)管理不規(guī)范、不分舍飼養(yǎng)、防疫技術(shù)滯后等食品安全問題［1，4］。此外，在巨大的經(jīng)濟(jì)利潤刺激下，不法商人屢次將其他產(chǎn)地低等級(jí)的羊肉貼上地理標(biāo)志羊肉的標(biāo)簽后投入市場(chǎng)［5］。為了維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，實(shí)現(xiàn)政府對(duì)市場(chǎng)上羊肉的監(jiān)管，在發(fā)生食品安全事故后快速實(shí)施產(chǎn)品的召回，以及對(duì)“環(huán)縣羊羔肉”地理標(biāo)志品牌進(jìn)行保護(hù)，為“環(huán)縣羊羔肉”產(chǎn)品打入國際市場(chǎng)提供技術(shù)支持，對(duì)環(huán)縣肉羊進(jìn)行溯源研究極為必要。

生物體內(nèi)的穩(wěn)定同位素組成受氣候、環(huán)境、生物代謝類型等因素的影響，上述因素可導(dǎo)致穩(wěn)定同位素分餾，從而使不同種類及地域來源的動(dòng)植物食品中穩(wěn)定同位素自然豐度存在差異，可作為一種“自然指紋”區(qū)分不同來源的動(dòng)植物食品［5-7］。近年來，采用穩(wěn)定同位素技術(shù)對(duì)肉羊進(jìn)行產(chǎn)地溯源的報(bào)道日漸增多［8］，例如米瑞芳等［9］從內(nèi)蒙古、新疆、寧夏、新西蘭和意大利5個(gè)地區(qū)采集羊肉樣品并利用穩(wěn)定同位素技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)地溯源，判別準(zhǔn)確率達(dá)100%。然而，目前的肉羊溯源研究的最小范圍僅止步于縣［9-11］，更小范圍的產(chǎn)地溯源有待深入探究。此外，以往的研究通常采用羊肉組織對(duì)肉羊進(jìn)行產(chǎn)地溯源研究［12］，需要將羊進(jìn)行宰殺取肉，有采集、攜帶不方便，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，容易變質(zhì)等缺點(diǎn)，導(dǎo)致試驗(yàn)誤差大和樣品采集成本高等問題；而毛發(fā)組織和血液樣品具有可活體取樣、容易采取、組織性質(zhì)穩(wěn)定、容易保存等優(yōu)點(diǎn)。Sun等［13］測(cè)定了我國5個(gè)不同地區(qū)2 種飼養(yǎng)方式下綿羊肌肉和羊毛中的δ13C、δ15N 和δ2H 值，結(jié)果表明，羊肉和羊毛的δ13C、δ15N 和δ2H 組合的判別準(zhǔn)確率分別為88.9%和83.8%，且羊肉與羊毛中的3 種穩(wěn)定同位素比值呈線性相關(guān)。由此推測(cè)，采用易取的羊毛或羊血樣品進(jìn)行溯源是一種更為經(jīng)濟(jì)、省時(shí)、省力、有效的方法。

目前還沒有對(duì)鄉(xiāng)鎮(zhèn)級(jí)別的肉羊進(jìn)行產(chǎn)地溯源的有效技術(shù)，不利于地理標(biāo)志產(chǎn)品“環(huán)縣羊羔肉”的品牌保護(hù)。本研究對(duì)環(huán)縣肉羊羊毛和羊血樣品中的碳、氮、氫、氧4 種穩(wěn)定同位素比值進(jìn)行檢測(cè)分析，研究羊毛和羊血中穩(wěn)定同位素比值的相關(guān)性，并通過對(duì)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)羊毛和羊血樣品中的穩(wěn)定同位素比值進(jìn)行判別分析，構(gòu)建鄉(xiāng)鎮(zhèn)級(jí)別的肉羊產(chǎn)地溯源模型，以期實(shí)現(xiàn)肉羊的活體建檔，以低成本構(gòu)建肉羊數(shù)據(jù)庫，從而完成對(duì)“環(huán)縣羊羔肉”品牌保護(hù)的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 樣品信息

用于溯源的樣品分別來自于環(huán)縣南湫鄉(xiāng)楊國禮農(nóng)場(chǎng)和新龍輝養(yǎng)殖合作社，甜水鄉(xiāng)宏康養(yǎng)殖農(nóng)民專業(yè)合作社及曲子鎮(zhèn)西溝村豪順養(yǎng)殖專業(yè)合作社。所有肉羊均為散欄飼養(yǎng)，均在7 月下旬采樣。每個(gè)農(nóng)場(chǎng)各采集20 只肉羊身上的頸毛樣品和全血樣品，共計(jì)160 份羊血和羊毛樣品。采用無添加劑的干燥真空采血管進(jìn)行血液樣品采集，采樣量約20 mL。在每只羊的頸部貼皮層處剪取約1 cm2的羊頸毛作為羊毛樣品，采樣量約2 g，用密封袋保存。樣品具體信息和采集樣品的具體地理位置分別如表1和圖1所示。

表1 環(huán)縣羊血和羊毛樣品地理信息Table 1 Region information of sample for sheep blood and wool in Huan county

1.2 儀器及試劑

Flash 2000-Conflo IV interface-Delta V 元素分析與穩(wěn)定同位素質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Thermo 公司；WGL-230D 電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；SCIENTZ-48高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司；H1850臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

氯仿和甲醇，分析純，北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；去離子水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；USGS43、USGS62、USGS42、CBS、KHS 穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，美國Geological Survey Reston；IAEA-600 穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，奧地利國際原子能機(jī)構(gòu)。

1.3 前處理方法

采集的羊毛樣品用去離子水浸泡清洗后，在60 ℃條件下恒溫干燥12 h。稱量1.00 g清洗后的羊毛樣品置于10 mL 離心管中。按照固液比1∶5 的比例加入5 mL 氯仿/甲醇（v/v=2∶1）混合溶液浸泡2 h 進(jìn)行脫脂處理。樣品用去離子水清洗后，浸泡30 min，再按照固液比1∶5 的比例加入5 mL 氯仿/甲醇（v/v=2∶1）混合溶液浸泡2 h。用去離子水清洗后，在60 ℃條件下將樣品烘至全干（質(zhì)量差小于0.02 mg）。脫脂后的羊毛樣品剪成約1 mm備用。

稱量1.00 g 冷凍干燥后的羊血樣品置于10 mL 離心管中。按照固液比1∶5 的比例加入5 mL 氯仿/甲醇（v/v=2∶1）混合溶液進(jìn)行脫脂處理。隨后將樣品放置在渦旋振蕩器上震蕩10 min。振蕩結(jié)束后，樣品在5 000 r·min-1條件下離心5 min。去除上清液，再次按照固液比1∶5 的比例在樣品中加入5 mL 氯仿/甲醇（v/v=2∶1）混合溶液脫脂，再次震蕩離心。如此重復(fù)兩次后，將樣品冷凍干燥至全干（質(zhì)量差小于0.02 mg）。脫脂后的羊血樣品經(jīng)磨粉過篩后備用。

1.4 δ13C和δ15N的測(cè)定

稱量150 μg 干燥脫脂后的樣品用錫杯稱量包裹后投入元素分析與穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜聯(lián)用儀（elemental analyzer-isotope ratio mass spectrometer，EAIRMS）進(jìn)行碳氮同位素比值分析。樣品通過自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)入元素分析儀，元素分析儀的裂解管溫度為960 ℃，樣品中的C和N被裂解爐中的玻璃化碳還原為CO2和N2，全過程在線自動(dòng)進(jìn)行。CO2和N2通過氣相進(jìn)行分離，色譜柱溫為50 ℃。CO2和N2分別經(jīng)由ConFlo IV 裝置進(jìn)入EA-IRMS，測(cè)定C 和N 同位素的比值。載氣氦氣的流速為100 mL·min-1。選用USGS43（δ13C=-21.28‰，δ15N=8.44‰），USGS62（δ13C=-14.79‰，δ15N=20.17‰）和IAEA-600（δ13C=-27.77‰，δ15N=1.00‰）作為校正δ13C 和δ15N 的標(biāo)準(zhǔn)樣品。δ13C 和δ15N 的分析精度均為±0.15‰。

1.5 δ2H和δ18O的測(cè)定

稱量250 μg 干燥脫脂后的樣品用銀杯包裹后投入EA-IRMS 進(jìn)行氫氧同位素比值分析。樣品通過自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)入元素分析儀，元素分析儀的裂解管溫度為1 420 ℃，樣品中的H 和O被裂解爐中的玻璃化碳還原為H2和CO，全過程在線自動(dòng)進(jìn)行。H2和CO 通過氣相進(jìn)行分離，色譜柱溫為80 ℃，H2和CO 分別經(jīng)由ConFlo IV 裝置進(jìn)入IRMS，測(cè)定H 和O 同位素的比值。載氣氦氣的流速為100 mL·min-1。選用CBS（δ2H=- 197‰，δ18O=3.8‰）、KHS（δ2H= -51.4‰，δ18O=20.3‰）和USGS42（δ2H=-78.5‰，δ18O=8.56‰）作為校正δ2H 和δ18O 的標(biāo)準(zhǔn)樣品。δ2H 的分析精度為±3‰。δ18O的分析精度為±0.4‰。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（Duncan 多重比較）及線性判別分析（linear discriminant models，LDA）。采用SIMCA 14.1 軟件對(duì)不同農(nóng)場(chǎng)的羊毛和羊血樣品進(jìn)行主成分分析（principal components analysis，PCA）及正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）。采用Excel 2016 軟件對(duì)羊毛和羊血樣品的穩(wěn)定同位素比值進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 肉羊羊毛和羊血穩(wěn)定同位素組成特征

如表2 所示，3 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)羊毛樣品的δ13C 和δ2H 均值大于羊血樣品的δ13C和δ2H均值，而羊血樣品的δ15N和δ18O 均值大于羊毛樣品δ15N 和δ18O 均值。3 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)羊毛樣品中δ13C、δ15N、δ2H和δ18O的均值分別為-16.90‰、3.94‰、-89.19‰和12.50‰。所有羊血樣品中δ13C、δ15N、δ2H 和δ18O 的均值分別為-19.39‰、4.08‰、-112.41‰和12.87‰。

表2 3個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)羊血和羊毛中δ13C、δ15N、δ2H和δ18O值Table 2 The values of δ13C， δ15N， δ2H and δ18O for sheep blood and wool in three towns

各鄉(xiāng)鎮(zhèn)羊血和羊毛樣品的的δ13C、δ15N、δ2H 和δ18O整體均具有顯著差異。羊毛和羊血中δ13C值從大到小的鄉(xiāng)鎮(zhèn)順序均依次為甜水＞曲子＞南湫。南湫羊毛的δ13C 值明顯低于其他鄉(xiāng)鎮(zhèn)羊毛的δ13C 值。羊毛和羊血中δ15N值從大到小的鄉(xiāng)鎮(zhèn)順序均依次為南湫＞甜水＞曲子。羊毛和羊血中δ2H 值從大到小的鄉(xiāng)鎮(zhèn)順序均依次為南湫＞甜水＞曲子。此外，南湫鄉(xiāng)肉羊羊血中δ18O 值大于羊毛中δ18O 值，而甜水和曲子肉羊羊毛中δ18O 值均大于羊血中δ18O 值。羊毛中δ18O 值從大到小的鄉(xiāng)鎮(zhèn)順序依次為曲子＞南湫＞甜水。羊血中δ18O值從大到小的鄉(xiāng)鎮(zhèn)順序依次為南湫＞甜水＞曲子。曲子肉羊羊毛的δ18O值明顯高于其他鄉(xiāng)鎮(zhèn)羊毛的δ18O值。

2.2 羊毛和羊血中穩(wěn)定同位素比值的相關(guān)性

羊毛和羊血的相關(guān)性分析結(jié)果表明（圖2），羊毛和羊血中δ13C 值呈顯著線性正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.813，其相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)的概率P值近似為0.000，說明羊血和羊毛組織δ13C 分餾速率較為一致。而羊毛和羊血中δ15N、δ2H 和δ18O的相關(guān)性較弱，相關(guān)系數(shù)分別為0.369、0.080 和0.000，其相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)的概率P值均近似為0.000，表明二者的氮?dú)溲醴€(wěn)定同位素分餾速率差異較大。

圖2 3個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)羊毛和羊血樣品的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis for sheep blood and wool in three towns

2.3 穩(wěn)定同位素比值對(duì)肉羊產(chǎn)地的判別分析

分別對(duì)3 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)羊毛和羊血進(jìn)行PCA 和OPLSDA 分析，結(jié)果如圖3 所示。PCA 結(jié)果表明，南湫、甜水和曲子的羊毛樣品被明顯區(qū)分開，而甜水和曲子的羊血樣品未被區(qū)分開。OPLS-DA 結(jié)果表明，無論是羊毛樣品還是羊血樣品，南湫、甜水和曲子3個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的樣品均被完全區(qū)分開。有監(jiān)督的OPLS-DA 分析結(jié)果明顯優(yōu)于無監(jiān)督的PCA分析結(jié)果。

圖3 3個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)羊毛和血液的PCA和OPLS-DA圖Fig.3 The PCA plot and OPLS-DA plot for sheep blood and wool in three towns

通過3 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)羊毛和羊血樣品中不同穩(wěn)定同位素組合的線性判別分析結(jié)果可知（表3），不論是羊毛還是羊血樣品，4 種穩(wěn)定同位素組合的線性判別準(zhǔn)確率最高：3 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的羊毛原始判別準(zhǔn)確率為95.0%，交叉驗(yàn)證判別準(zhǔn)確率為91.3%，其線性判別模型得分圖如圖4所示；3個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的羊血原始判別準(zhǔn)確率和交叉驗(yàn)證判別準(zhǔn)確率均為97.5%。因此，羊血對(duì)環(huán)縣肉羊溯源的準(zhǔn)確度優(yōu)于羊毛。此外，羊毛的碳氮穩(wěn)定同位素組合原始判別準(zhǔn)確率和交叉驗(yàn)證判別準(zhǔn)確率高達(dá)92.5%，而羊血不論是碳氮穩(wěn)定同位素組合還是氫氧穩(wěn)定同位素組合的判別準(zhǔn)確率均高于90.0%。

表3 3個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)羊毛和羊血樣品中不同穩(wěn)定同位素組合的線性判別分析結(jié)果Table 3 The results of LDA for different stable isotope combinations in sheep blood and wool samples from three towns

圖4 以δ13C、δ15N、δ2H和δ18O為組合的3個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)羊毛和羊血線性判別模型得分圖Fig.4 Score chart of linear discriminant model of sheep blood and wool in three towns based on four isotopic values of δ13C，δ15N， δ2H and δ18O

3 討論

3.1 肉羊中穩(wěn)定同位素比值的影響因素

動(dòng)物體δ13C值與飼料中C3和C4植物的比例密切相關(guān)［14-15］。C3植物的δ13C 值（-32‰～-21‰）低于C4植物（-19‰～-12‰）［9］。動(dòng)物組織δ13C 值越高，表明其飲食中含有C4植物的比例越高［12，16］。3 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)羊血和羊毛樣品中δ13C 值均具有顯著差異。羊毛和羊血樣品中δ13C值從大到小的順序均依次為甜水＞曲子＞南湫。南湫肉羊的飼料為玉米和大燕麥草；甜水肉羊的飼料為玉米、苜蓿和育肥料；曲子肉羊的飼料為玉米、苜蓿、黃豆、小麥和干草（表1）。除了玉米為C4植物，其他均為C3植物。由此可知，甜水肉羊飼料中玉米所占比例最高，而南湫肉羊飼料中玉米所占比例最低。此外，動(dòng)物體內(nèi)的δ13C值在生物體內(nèi)的積累與變化除與飼料相關(guān)外，還與其品種相關(guān)。南湫肉羊主要品種為山羊，而甜水和曲子肉羊?yàn)楹?，即品種為綿羊。如表2 所示，山羊δ13C值明顯低于綿羊。王倩［17］研究發(fā)現(xiàn)在飼料相同的情況下，阿拉善左旗的山羊中δ13C 值明顯低于阿拉善右旗和額濟(jì)納旗的綿羊中δ13C 值，這與本研究結(jié)果相同。推測(cè)其原因可能是不同品種肉羊的生活習(xí)性和代謝機(jī)制不同，從而導(dǎo)致其體內(nèi)穩(wěn)定同位素的分餾差異。

各鄉(xiāng)鎮(zhèn)羊血和羊毛樣品中δ15N 值均具有顯著差異。羊毛和羊血樣品中δ15N值從大到小均依次為南湫＞甜水＞曲子。前人研究表明，施用化肥種植出的飼料δ15N值較低［18］。動(dòng)物食用施用化肥種植的植物飼料導(dǎo)致動(dòng)物組織中δ15N 值也相應(yīng)降低。除玉米外，南湫和甜水肉羊主要以野生大燕麥草和苜蓿為食。而曲子肉羊飼料中還包括施用化肥種植出的黃豆和小麥。此外，攝入可以直接利用大氣固氮的豆科植物會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物體δ15N 值降低［8，11］。甜水和曲子肉羊飼料中有豆科植物，如苜蓿和黃豆。因此，南湫樣品δ15N 值最高，而曲子樣品δ15N值最低。

動(dòng)物體δ2H 值和δ18O 值會(huì)受到地域環(huán)境的海拔、緯度、溫度、氣候、地形和季節(jié)等多種地理參數(shù)的綜合影響［5，19］。在地域環(huán)境變化明顯的情況下，動(dòng)物體中的δ2H 值和δ18O 值呈現(xiàn)隨緯度升高和海拔增加而降低的變化規(guī)律［9，20］。而本研究中羊毛樣品δ18O 值從大到小依次為曲子＞南湫＞甜水；羊毛樣品δ2H值與羊血樣品δ2H 值和δ18O 值從大到小的順序?yàn)槟箱校咎鹚厩?，結(jié)果與海拔和緯度無相關(guān)性。大氣水隨全球系統(tǒng)性循環(huán)，經(jīng)過蒸發(fā)、冷凝和結(jié)晶等步驟最終沉降成為地下水，地下水中的δ2H和δ18O通過飲用水和飼料轉(zhuǎn)移到動(dòng)物組織中［21］。因此，動(dòng)物體中的δ2H值和δ18O值反映了地下水中的δ2H 值和δ18O 值，與地理位置相關(guān)［22］。曲子羊毛樣品的δ2H 值遠(yuǎn)小于南湫和甜水羊毛樣品的δ2H值。甜水與南湫僅相距9.1 km，而甜水與曲子相距114.2 km，說明兩地距離越大，羊毛樣品的δ2H 值相差越大。但有關(guān)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的地下水中δ2H、δ18O 值和動(dòng)物體中δ2H、δ18O 值的相關(guān)性至今未有報(bào)道，還需進(jìn)一步研究。

3.2 肉羊不同組織的穩(wěn)定同位素分餾效應(yīng)

以往肉羊產(chǎn)地溯源多采用羊肉進(jìn)行溯源研究［23］，但羊肉樣品具有采集、攜帶不方便，容易變質(zhì)、誤差大和成本高等問題。采用血液和毛發(fā)部位進(jìn)行肉羊溯源研究除具有組織性質(zhì)穩(wěn)定、容易保存的特點(diǎn)，還具有不用宰殺取樣即可為肉羊建立檔案的優(yōu)點(diǎn)。此外，血液樣品和毛發(fā)樣品也是非常好的溯源樣品。劉澤鑫等［24］對(duì)陜西關(guān)中不同區(qū)縣來源的牛尾毛樣品的δ13C和δ15N 值進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明陜西關(guān)中不同地區(qū)肉牛組織中同位素組成存在差異，可利用牛尾毛對(duì)區(qū)縣內(nèi)小范圍肉牛進(jìn)行溯源。但本研究采用羊血和羊毛進(jìn)行的是同一個(gè)縣內(nèi)不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)的產(chǎn)地溯源研究，3 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的羊毛原始判別準(zhǔn)確率為95.0%，交叉驗(yàn)證判別準(zhǔn)確率為91.3%；3 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的羊血原始判別準(zhǔn)確率和交叉驗(yàn)證判別準(zhǔn)確率均為97.5%，結(jié)果也非常理想。

動(dòng)物不同組織中穩(wěn)定同位素組成隨飲食的改變而變化，且穩(wěn)定同位素分餾作用會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物不同組織中的同位素比值存在較大差異［25-26］。組織之間的同位素差異可以反映組織的化學(xué)成分和周轉(zhuǎn)率的變化［23，27］。動(dòng)物糞便或胃內(nèi)容物的分析應(yīng)提供有關(guān)動(dòng)物即時(shí)飲食的信息［28］；血液能反映動(dòng)物幾個(gè)小時(shí)內(nèi)到幾天的短期穩(wěn)定同位素變化的情況［25，29］；脂肪、肝臟、肌肉和毛發(fā)反映幾星期到幾個(gè)月的較長(zhǎng)期飲食信息［29］；相比其他組織，骨膠原所反映的飲食信息時(shí)間更長(zhǎng)［25］。可根據(jù)不同的溯源需求選擇合適的采樣組織。因此，羊毛樣品主要反映肉羊較長(zhǎng)期幾個(gè)月的飼料中穩(wěn)定同位素組成信息，而血液樣品可以反映肉羊較短期幾天內(nèi)飼料和飲水中穩(wěn)定同位素組成信息。這便是羊毛和羊血中δ13C值呈顯著線性正相關(guān)，而δ15N、δ2H和δ18O值相關(guān)性較弱的原因。

3.3 穩(wěn)定同位素在肉羊產(chǎn)地來源判別中的應(yīng)用

不論是PCA分析還是OPLS-DA分析，南湫樣品均與其他兩鄉(xiāng)鎮(zhèn)的樣品完全分離。南湫樣品為大于6 個(gè)月的成年山羊，而曲子和甜水樣品為5個(gè)月和6個(gè)月的幼年綿羊。兩種羊被投喂的飼料不同，體內(nèi)代謝不同，進(jìn)而導(dǎo)致同位素分餾機(jī)制不同［17］。羊血PCA 分析結(jié)果表明，曲子和甜水樣品有部分混合的現(xiàn)象。曲子和甜水樣品雖均為湖羊，但兩地的羊被投喂的飼料不同，地理位置不同。因此羊血和羊毛的OPLS-DA 分析圖表明兩地的樣品被全部區(qū)分開。

不論是羊毛還是羊血樣品，4種穩(wěn)定同位素組合的線性判別準(zhǔn)確率最高，3個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的羊毛原始判別準(zhǔn)確率為95.0%，交叉驗(yàn)證判別準(zhǔn)確率為91.3%；羊血原始判別準(zhǔn)確率和交叉驗(yàn)證判別準(zhǔn)確率均為97.5%。以δ13C、δ15N、δ2H 和δ18O 為組合的3 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)羊毛和羊血線性判別模型得分圖表明，3 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的羊毛和羊血樣品均被明顯分開（圖4）。如圖1 所示，甜水與曲子相距114.2 km，而南湫與甜水僅相距9.1 km。如此小區(qū)域內(nèi)的肉羊溯源，判別準(zhǔn)確率均大于90.0%，充分表明4種穩(wěn)定同位素比值在肉羊溯源領(lǐng)域的準(zhǔn)確性與有效性。此外，除全部4種穩(wěn)定同位素組合外，羊血和羊毛樣品線性判別最有效的穩(wěn)定同位素組合為δ13C 和δ15N，這主要是由3 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)肉羊的年齡、品種和飼料組成不同所致。而羊血樣品的δ2H 和δ18O 組合線性判別準(zhǔn)確率也能達(dá)到91.3%。血液中主要成分是水，即羊血的δ2H 和δ18O 值主要與肉羊的飲水相關(guān)。這一結(jié)果表明，在同一區(qū)域肉羊年齡、品種和飼料組成一致的情況下，根據(jù)δ2H 和δ18O 值的差異足以區(qū)分不同小區(qū)域的肉羊。

4 結(jié)論

本研究采用穩(wěn)定同位素技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)環(huán)縣南湫鄉(xiāng)、甜水鄉(xiāng)和曲子鎮(zhèn)的肉羊進(jìn)行產(chǎn)地溯源，結(jié)果表明，3 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的肉羊羊毛和羊血樣品中δ13C、δ15N、δ2H 和δ18O 整體均存在顯著性差異，且羊毛和羊血中的穩(wěn)定同位素分餾速率差異較大。羊毛的4 種穩(wěn)定同位素比值原始判別準(zhǔn)確率為95.0%，交叉驗(yàn)證判別準(zhǔn)確率為91.3%；羊血的4 種穩(wěn)定同位素比值原始判別準(zhǔn)確率和交叉驗(yàn)證判別準(zhǔn)確率均為97.5%。本研究首次基于穩(wěn)定同位素技術(shù)對(duì)鄉(xiāng)鎮(zhèn)級(jí)別（最小距離為9.1 km）的肉羊進(jìn)行產(chǎn)地溯源，實(shí)現(xiàn)了肉羊的活體建檔及低成本構(gòu)建肉羊數(shù)據(jù)庫，不僅為環(huán)縣肉羊鄉(xiāng)鎮(zhèn)級(jí)別的小產(chǎn)地溯源研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持，也為其他食品小產(chǎn)地溯源研究提供了新思路。