曾建林 呂建樹 段宏偉 楊 帥 張 榕 張 勇 胡俊杰

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/甘肅省動(dòng)物生殖生理及繁殖調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070）

輸卵管是女性生殖系統(tǒng)的一部分，是連接卵巢和子宮的管道，為精卵結(jié)合提供適宜的環(huán)境，是輸送卵母細(xì)胞以及合子初步發(fā)育的重要場(chǎng)所。輸卵管內(nèi)環(huán)境紊亂可能影響輸卵管功能，導(dǎo)致雌性動(dòng)物生產(chǎn)性能下降［1］。輸卵管上皮細(xì)胞之間通過(guò)緊密連接（tight junction，TJ）蛋白相連。緊密連接蛋白廣泛存在于輸卵管上皮，參與上皮細(xì)胞間的緊密連接及細(xì)胞粘附，調(diào)節(jié)細(xì)胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、防止細(xì)菌、內(nèi)毒素等侵染，構(gòu)成了一種上皮特有的初級(jí)防御屏障［2］。封閉蛋白-1（Claudin-1）和閉合蛋白（Occludin）是緊密連接蛋白家族中兩個(gè)重要的跨膜蛋白，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞旁通透性、介導(dǎo)離子選擇性擴(kuò)散及細(xì)胞遷移［3-4］。輸卵管上皮緊密連接蛋白構(gòu)成的上皮屏障是維持輸卵管正常生理功能和管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)不可或缺的。

脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是革蘭氏陰性菌釋放的內(nèi)毒素。當(dāng)機(jī)體受脂多糖刺激會(huì)產(chǎn)生一系列免疫防御機(jī)制，誘機(jī)體發(fā)炎癥反應(yīng)［5-6］。反芻動(dòng)物異常代謝和炎癥性疾病是外周循環(huán)LPS的主要來(lái)源。研究表明，亞急性瘤胃酸中毒期間產(chǎn)生的大量LPS會(huì)造成瘤胃上皮炎癥反應(yīng)，破壞上皮屏障，導(dǎo)致LPS易位至外周循環(huán)，誘發(fā)乳腺、子宮等部位炎癥反應(yīng)［6-8］。如患有子宮內(nèi)膜炎的奶牛血清中的LPS濃度上升，卵泡液中的LPS濃度比正常時(shí)期高出2 900倍［9-11］；腸道菌群紊亂造成腸道炎癥和腸上皮損傷，導(dǎo)致LPS或病原菌通過(guò)血液從腸道遷移到子宮造成子宮炎［11-12］；家兔耳緣靜脈注射LPS可誘發(fā)輸卵管炎癥反應(yīng)［13］。上述研究均表明，外周循環(huán)中的LPS是造成輸卵管炎癥反應(yīng)的潛在誘因，但在反芻動(dòng)物飼養(yǎng)管理過(guò)程中，亞急性瘤胃酸中毒等疾病造成的大量LPS 易位易被忽視，從而可能增加誘發(fā)輸卵管炎癥的風(fēng)險(xiǎn)。

然而，Claudin-1、Occludin 在綿羊輸卵管中的表達(dá)特性，以及LPS是否會(huì)通過(guò)影響Claudin-1、Occludin 的表達(dá)，進(jìn)而造成輸卵管上皮細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)及屏障功能障礙，最終造成綿羊生殖性能下降，均鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究首先明確Claudin-1、Occludin在綿羊輸卵管中的表達(dá)特性，其次通過(guò)LPS 誘導(dǎo)的綿羊輸卵管炎癥模型闡明LPS 對(duì)輸卵管上皮Claudin-1、Occludin 表達(dá)的影響，試圖闡明LPS 對(duì)綿羊輸卵管屏障損傷的機(jī)制，以期為反芻動(dòng)物飼養(yǎng)管里的科學(xué)發(fā)展及提高綿羊生殖機(jī)能的相關(guān)研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

蘇木精（D10393，Bioss，北京）、伊紅（S0159，Bioss，北京）、TRIzol 裂解液（R1100，Solarbio，北京）、RIPA裂 解 液（radio immunoprecipitation assay lysis buffer）（R0010，Solarbio，北京）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（Hycione，美國(guó)）、DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)基（Hycione，美國(guó)）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega，北京）、脂多糖（Cat.No.L2880，Sigma，美國(guó)）、角蛋白18（18708-1-AP，Proteintech Group，武漢）、Claudin-1（28674-1-AP，Proteintech Group，武漢）、Occludin（66378-1-Ig，Proteintech Group，武漢）、β-actin（bs-0061R，Bioss，北京）、熒光二抗（ab150077、ab150115）（Abcam，美國(guó)）、免疫印跡二抗（bs-0295GHRP、bs-40296G-HRP，Bioss，北京）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa Bio， 大連）。

1.2 樣品采集

于甘肅省蘭州市當(dāng)?shù)赝涝讏?chǎng)采集健康成年綿羊的輸卵管組織。部分置于37 ℃、含青鏈霉素的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）中，迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室用于細(xì)胞培養(yǎng)（n=10）；部分用4%多聚甲醛固定輸卵管組織（n=5）用于石蠟包埋；其余樣品（n=10）在液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 綿羊輸卵管組織的蘇木精-伊紅染色

將4%多聚甲醛固定的輸卵管組織，按照傘部、壺腹部、峽部分割，石蠟包埋后制作成5 μm石蠟切片，在60 ℃條件下烘片2 h，二甲苯、梯度酒精脫蠟，蘇木精染色2 min，流水沖洗，后利用1%（v/v）的鹽酸酒精分化液分化3 s后取出，伊紅染色1 min。梯度酒精浸泡脫水，后通過(guò)二甲苯浸泡透明，封片。使用Olympus-dp73 光學(xué)顯微鏡（Olympus，日本）觀察拍照。

1.4 組織免疫熒光

將4%多聚甲醛固定的輸卵管組織，按照傘部、壺腹部、峽部分割，石蠟包埋，制作成5 μm 石蠟切片，60 ℃烘片2 h，二甲苯、梯度酒精脫蠟，0.01 mol·L-1的檸檬酸鈉溶液98 ℃抗原修復(fù)15 min，自然冷卻至室溫，PBS洗滌，3% H2O2室溫孵育15 min，PBS洗滌，5%的山羊血清37 ℃封閉30 min，4 ℃一抗孵育過(guò)夜（1∶250）。PBS 洗滌，熒光二抗37 ℃避光孵育1 h，PBS 洗滌，1 μg·mL-1的4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（diamidino-2-phenylindole，DAPI）染核后，使用Revolve Omega 熒光顯微鏡（Apex Bio， 美國(guó)）拍照。

1.5 蛋白免疫印跡（western blot, WB）

將輸卵管組織按照傘部、壺腹部、峽部混合（n=10），液氮研磨并各自稱取相同重量樣本。分別在組織及細(xì)胞樣本中加入等量RIPA 裂解液及苯甲磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride， PMSF）進(jìn)行充分裂解。4 ℃、12 000 r·min-1條件下離心15 min 提取上清液，加入4×蛋白上樣緩沖液混勻后，在98 ℃、15 min條件下處理獲得變性蛋白。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），目的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDE），Tris-HCl緩沖鹽溶液+Tween（Tris buffered saline with Tween， TBST）洗滌，5%脫脂奶粉室溫孵育30 min，一抗4 ℃孵育過(guò)夜（1：500），β-actin（1：3 000）作為內(nèi)參。TBST 洗滌，二抗37 ℃孵育1 h（1：3 000），TBST 洗滌。通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光溶液檢測(cè)免疫復(fù)合物，并用Image-J 軟件分析目的蛋白灰度值，參照β-actin 計(jì)算灰度值，即為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 原代輸卵管上皮細(xì)胞培養(yǎng)

用37 ℃含有青鏈霉素的PBS 和75%酒精依次清洗輸卵管，重復(fù)3 次，將輸卵管壺腹部?jī)啥擞脽o(wú)菌棉線結(jié)扎，管腔內(nèi)注入0.2% IV 型膠原酶37 ℃孵育10 min，收集管腔內(nèi)容物并用培養(yǎng)液沖洗，1 200 r·min-1離心5 min 后棄去上清。在含有100 IU·mL-1青霉素、100 IU·mL-1鏈霉素及10%胎牛血清的DMEM/F12 完全培養(yǎng)基中重懸，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37 ℃、95% O2和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d 換一次培養(yǎng)基，細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid， EDTA）重懸，1 200 r·min-1離心棄去上清，重懸轉(zhuǎn)移至每孔含2 mL完全培養(yǎng)基的6 孔板中進(jìn)行培養(yǎng)。處理前DMEM/F12 原培處理12 h，換液后以終濃度為0、10、50和100 ng·mL-1的LPS 處理12 h，棄上清，用4 ℃預(yù)冷的PBS 洗滌3 遍后，在-80 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 細(xì)胞免疫熒光

6 孔板中細(xì)胞密度至70%～80%時(shí)棄去培養(yǎng)液，在預(yù)冷至4 ℃的PBS 中洗滌，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌，后用0.1%的曲拉通室溫處理15 min，PBS洗滌，5%山羊血清37 ℃孵育30 min，一抗孵育過(guò)夜（1∶250）。PBS 洗滌，熒光二抗37 ℃避光孵育1 h，PBS 洗滌，1 μg·mL-1的DAPI 染核后用Revolve Omega 熒光顯微鏡拍照。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）

TRIzol處理細(xì)胞樣品，提取總RNA，微量核算測(cè)定儀（Pultton，美國(guó)）測(cè)定OD260/OD280值在1.8～2.0之間，調(diào)整濃度后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟進(jìn)行cDNA鏈的合成，引物參考NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）上已經(jīng)公布的綿羊TLR4、NFκB、TNF-α和β-actin基因序列（表1）。反轉(zhuǎn)錄后使用LightCycler 480 Real-time Detection System（Roche， 瑞士）檢測(cè)目的基因相對(duì)表達(dá)量，反應(yīng)體系20 μL：cDNA 1 μL、正反向引物各0.4 μL、2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL、ddH2O 8.2 μL。將樣品充分混勻，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性300 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，45 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.9 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 21.0（IBM）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和同方差檢驗(yàn)、單因素方差分析和鄧肯多重檢驗(yàn)。P＜0.05水平表示數(shù)據(jù)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊輸卵管峽部、壺腹部、傘部的結(jié)構(gòu)及免疫熒光檢測(cè)

利用蘇木精-伊紅染色法對(duì)綿羊輸卵管組織切片進(jìn)行染色觀察。峽部和壺腹部從內(nèi)而外由粘膜層、肌層及外膜組成，黏膜層包含上皮層和固有層并向內(nèi)突出褶皺，黏膜上皮緊貼管壁基底部呈單層柱狀纖維上皮、頂部為假?gòu)?fù)層柱狀纖毛上皮。傘部為膜結(jié)構(gòu)由外側(cè)假?gòu)?fù)層柱狀纖毛上皮和內(nèi)側(cè)疏松的結(jié)締組織構(gòu)成，箭頭標(biāo)記為上皮細(xì)胞（圖1）。免疫熒光檢測(cè)Claudin-1、Occludin發(fā)現(xiàn)兩種蛋白主要存在于黏膜上皮的柱狀上皮中（圖2、3）。

圖1 綿羊輸卵管峽部、壺腹部、傘部的HE染色（100×）Fig.1 HE staining （100×） photoes of sheep oviduct isthmic portion， ampulla and fimbriae

圖3 綿羊輸卵管峽部、壺腹部、傘部的Occludin免疫熒光染色分析（×100）Fig.3 immunofluorescence staining analysis of Occludin in the isthmic portion， ampulla and fimbriae of sheep oviduct （100×）

2.2 Claudin-1、Occludin 在峽部、壺腹部、傘部的表達(dá)差異

通過(guò)WB 檢測(cè)綿羊輸卵管峽部、壺腹部、傘部中Claudin-1、Occludin 的相對(duì)表達(dá)。結(jié)果顯示，Claudin-1、Occludin 在傘部的表達(dá)顯著高于峽部和壺腹部（P＜0.05）（圖4）。

圖4 Claudin-1、Occludin在峽部、壺腹部、傘部的表達(dá)差異Fig.4 Claudin-1 and Occludin in isthmic portion， ampulla and fimbriae expressi on differences

2.3 體外培養(yǎng)原代輸卵管上皮細(xì)胞的鑒定

如圖5 所示，通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞角蛋白18（cytokeratin18，CK18），在細(xì)胞質(zhì)中可見綠色熒光激發(fā)。

圖5 體外培養(yǎng)綿羊輸卵管壺腹部上皮細(xì)胞角蛋白18的免疫熒光染色（200×）Fig.5 Immunofluorescence staining of cytokeratin18 in sheep ampulla epithelial cells cultured in vitro （200×）

2.4 脂多糖誘導(dǎo)輸卵管上皮炎癥模型的鑒定

利用終濃度為0、10、50和100 ng·mL-1的LPS分別處理原代輸卵管上皮細(xì)胞，qRT-PCR 檢測(cè)TLR4、NFκB及TNFα的mRNA表達(dá)，結(jié)果如圖6所示。與0 ng·mL-1處理組相比，10、50 和100 ng·mL-1的LPS 均可顯著促進(jìn)TLR4、NFκB及TNFα的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）。

圖6 LPS誘導(dǎo)輸卵管上皮細(xì)胞TLR4、NFκB及TNFα 的mRNA相對(duì)表達(dá)水平Fig.6 Relative mRNA expression levels of LPS induced epithelial cells TLR4， NFκB and TNFα

2.5 脂多糖對(duì)輸卵管上皮Claudin-1、Occludin 表達(dá)的影響

WB 檢測(cè)LPS 處理原代細(xì)胞Claudin-1、Occludin的相對(duì)蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖7 所示。10、50 和100 ng·mL-1濃度的LPS 不同程度地促進(jìn)了Claudin-1表達(dá)，但抑制了Occludin 表達(dá)，并與0 ng·mL-1處理組表達(dá)量均差異顯著（P＜0.05）。

圖7 LPS誘導(dǎo)輸卵管上皮細(xì)胞Claudin-1、Occludin的蛋白相對(duì)表達(dá)水平Fig.7 Relative protein expression levels of LPS induced epithelial cells Claudin-1、Occludin

3 討論

輸卵管傘部為漏斗狀，呈不規(guī)則褶皺，由外側(cè)假?gòu)?fù)層柱狀纖毛上皮和內(nèi)側(cè)疏松的結(jié)締組織構(gòu)成（圖1），主要功能是將卵巢排出的卵子運(yùn)輸至輸卵管內(nèi)；壺腹部是輸卵管中長(zhǎng)度最長(zhǎng)、管腔最粗的一段（圖1），壺腹部上皮具有分泌功能維持輸卵管內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)。輸卵管峽部是連接壺腹部與子宮的一段較短直、且細(xì)的部位，主要發(fā)揮運(yùn)輸功能［14-16］。構(gòu)成輸卵管上皮TJ 的關(guān)鍵蛋白Claudin-1、Occludin表達(dá)于峽部、壺腹部及傘部上皮（圖2、3），且Claudin-1、Occludin 在傘部的蛋白表達(dá)水平顯著高于壺腹部及峽部（圖4）。由此推測(cè)，Claudin-1、Occludin 在輸卵管維持上皮屏障完整性及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的作用。

TLR4可識(shí)別LPS刺激激活TLR4-NFκB炎癥通路，導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)發(fā)生［5-6］。前人用LPS處理大鼠腸黏膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不同處理時(shí)間的TLR4的mRNA 表達(dá)均上升，無(wú)時(shí)間依賴性；而不同濃度LPS 處理9 h后，TLR4表達(dá)呈劑量依賴性升高［17］。奶牛乳腺上皮細(xì)胞的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度LPS處理不同時(shí)間后NFκB的表達(dá)水平均升高，但是未出現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性［18］。本研究通過(guò)不同濃度LPS處理輸卵管上皮細(xì)胞12 h，發(fā)現(xiàn)LPS可刺激輸卵管上皮TLR4、NFκB、TNFα的mRNA 表達(dá)水平上升，無(wú)劑量依賴性，這可能與LPS 處理的濃度、時(shí)間以及細(xì)胞種類有關(guān)（圖6）。結(jié)合上述前人研究結(jié)果表明，LPS 可刺激綿羊輸卵管上皮激活TLR4-NFκB炎癥通路，從而發(fā)生炎癥反應(yīng)。TNFα是一種多效應(yīng)炎癥因子，參與炎癥反應(yīng)，抑制精子及卵子在輸卵管中的進(jìn)一步發(fā)育、阻礙精卵結(jié)合、誘發(fā)輸卵管黏連和阻塞、阻礙胰島素信號(hào)傳導(dǎo)造成多囊卵巢綜合征，誘發(fā)其他盆腔器官炎癥反應(yīng)［19-20］。結(jié)合本研究結(jié)果表明，低濃度LPS 刺激輸卵管上皮細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)就可引發(fā)輸卵管上皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)，造成輸卵管損傷。

前人在LPS誘導(dǎo)的犬子宮內(nèi)膜炎中發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜中的Occludin 蛋白表達(dá)水平［21］，大腸桿菌處理的小鼠子宮內(nèi)膜Occludin 蛋白和mRNA 的表達(dá)水平均顯著降低［22］。TNFα 可過(guò)度活化子宮內(nèi)膜上皮中性粒細(xì)胞造成其損傷［23］，TNFα 可誘導(dǎo)Alport 小鼠及馬的腎小管TJs中Claudin-1表達(dá)升高［24-25］。本研究結(jié)果顯示，LPS刺激輸卵管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致上皮細(xì)胞Claudin-1 蛋白表達(dá)水平上升，Occludin 蛋白表達(dá)降低（圖7）。表明LPS可通過(guò)影響Claudin-1、Occludin的表達(dá)破壞輸卵管上皮屏障。子宮頸鱗狀上皮和喉鱗癌病程發(fā)展過(guò)程中Claudin-1 表達(dá)都呈現(xiàn)出較高的水平［26-27］，Claudin-1 缺失會(huì)導(dǎo)致皮膚等多個(gè)部位上皮細(xì)胞收緊［28-29］。Occludin 參與調(diào)節(jié)跨上皮中性粒細(xì)胞遷移，Occludin 缺失導(dǎo)致組織上皮分化缺陷［30-31］，其表達(dá)水平與細(xì)胞旁通透性成反比［32］。表明Claudin-1、Occludin 表達(dá)的改變和上皮細(xì)胞增殖、旁通透性、細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)、物質(zhì)運(yùn)輸及胞間連接等密切相關(guān)。推測(cè)LPS 刺激輸卵管炎癥反應(yīng)造成上皮緊密連接蛋白表達(dá)紊亂，可能造成輸卵管上皮細(xì)胞增殖、上皮通透性增大及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂導(dǎo)致輸卵管堵塞、充血、黏連等，影響輸卵管生理功能，從而影響綿羊經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，Claudin-1、Occludin 表達(dá)于綿羊輸卵管上皮并參與維持輸卵管上皮微環(huán)境穩(wěn)態(tài)。低濃度的LPS 在短時(shí)間內(nèi)便可誘發(fā)輸卵管上皮炎癥反應(yīng)，造成輸卵管上皮Claudin-1、Occludin表達(dá)紊亂，破壞輸卵管上皮緊密連接，造成輸卵管上皮損傷，進(jìn)而導(dǎo)致輸卵管生理機(jī)能下降。