金昊儒,趙俊杰,何霄玥,邱毓淇,何 雷

(1.南方醫(yī)科大學(xué);2.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院內(nèi)分泌科,廣東 廣州 510260)

青蒿素(artemisinin,ART)是高效、低毒的抗瘧藥物,由傳統(tǒng)中藥黃花蒿分離得到。雙氫青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)是通過(guò)ART的硼氫化鈉還原合成的衍生物[1]。為改善DHA半縮醛分子構(gòu)造的穩(wěn)定性,人們經(jīng)過(guò)進(jìn)一步加工后得到了蒿甲醚、蒿乙醚、青蒿琥酯(artesunate,ATS)等化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定的藥物。

上世紀(jì)九十年代初期發(fā)現(xiàn)ART及其衍生物具有抗腫瘤活性,其機(jī)制主要包括調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡(Regulated cell death,RCD)、阻滯或延緩腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期、抗腫瘤血管生成、抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等。其中RCD作用通過(guò)程序性細(xì)胞死亡或由細(xì)胞內(nèi)、外應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡來(lái)消除不需要的細(xì)胞,在抗腫瘤機(jī)制中受到極大關(guān)注[2]。本文對(duì)ART類藥物在細(xì)胞凋亡、鐵死亡、自噬和焦亡等方面的抗腫瘤作用進(jìn)行綜述。

1 ART及其衍生物與凋亡

最初在人類白血病細(xì)胞中報(bào)道了ART及其衍生物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,隨后發(fā)現(xiàn)ART及其衍生物可以通過(guò)調(diào)節(jié)多種因素導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡主要包括內(nèi)源性途徑和外源性途徑,穿孔素/顆粒酶通路作為T細(xì)胞介導(dǎo)的信號(hào)通路也已被定義。內(nèi)源性途徑由B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,bcl-2)家族成員調(diào)控及線粒體介導(dǎo),外源性途徑由跨膜蛋白死亡受體(death receptor,DR)介導(dǎo)[3]。DR是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)受體家族成員,與配體結(jié)合后以復(fù)合物形式激活凋亡蛋白酶引起細(xì)胞凋亡。內(nèi)源性途徑和外源性途徑都依賴半胱天冬水解酶或稱半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族成員參與完成細(xì)胞凋亡。

1.1 ART及其衍生物通過(guò)內(nèi)源性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡ART類藥物誘導(dǎo)活性氧簇(reactive oxygen specie,ROS)增多直接影響通路內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),ART及其衍生物可以通過(guò)多種方式激活內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑。

1.1.1 上調(diào)內(nèi)在通路促凋亡蛋白表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡 Cabello等證明DHA增加黑色素瘤細(xì)胞中佛波-12-肉豆蔻酸-13-乙酸誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)1(Phorbol-12-myristate-13-acetate-induced protein 1,NOXA)表達(dá)[4];Mao等證明DHA可增加乳腺癌細(xì)胞中Bcl-2樣蛋白11(Bcl-2-like protein 11,Bim)表達(dá)[5]。

1.1.2 抑制多種抗凋亡蛋白表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡 Du等證明DHA可下調(diào)Bcl-2和Bcl-xL表達(dá)[6];Qin等證明DHA可減少肝癌細(xì)胞中髓系白血病細(xì)胞分化蛋白-1(Induced myeloid leukemia cell differentiation protein,Mcl-1)表達(dá)[7]。

1.2 ART及其衍生物通過(guò)外源性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡ATS和DHA在殺死結(jié)腸癌細(xì)胞方面比ART更有效,它們誘導(dǎo)死亡受體5(DR5)在人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和DLD-1中以P53依賴性方式表達(dá),激活死亡受體凋亡途徑。Ilamathi等體外研究表明ATS通過(guò)靶向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄3(signal transducers and transcripts 3,STAT3)上調(diào)死亡受體4(DR4)表達(dá),使HepG2細(xì)胞對(duì)致敏腫瘤壞死因子相關(guān)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡敏感[8]。這個(gè)研究表明ART類藥物上調(diào)DR4表達(dá),而不是DR5,提示ART類藥物對(duì)細(xì)胞凋亡途徑的影響是比較復(fù)雜的。此外,Wang等在研究ART在小鼠皮膚炎癥中的抗炎作用時(shí),發(fā)現(xiàn)用ART預(yù)處理細(xì)胞可抑制抗細(xì)胞凋亡蛋白(c-IAP1,Bcl-2和FLIP)表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]?；贏RT類藥物的上述作用,Ji等用多種濃度DHA對(duì)四種人骨肉瘤細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果證明其激活了caspase-3、caspase-8和caspase-9,誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡和DNA 損傷[10]。以上研究表明ART及其衍生物可通過(guò)多種方式激活外源性細(xì)胞凋亡途徑。

1.3 ART及其衍生物通過(guò)穿孔素/顆粒酶通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡Zhou等報(bào)道,DHA有利于γδT細(xì)胞(來(lái)源于外周血單核細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞)擴(kuò)增,并增強(qiáng)γδT細(xì)胞介導(dǎo)的胰腺癌細(xì)胞殺傷活性。上調(diào)細(xì)胞內(nèi)穿孔素、顆粒酶B表達(dá)和IFN-γ產(chǎn)生可能是DHA影響γδT細(xì)胞抗腫瘤活性增加的重要機(jī)制,表明ART類藥物可影響免疫細(xì)胞誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[11]。陳有挺等發(fā)現(xiàn)DHA治療組缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)表達(dá)強(qiáng)度低于對(duì)照組,計(jì)數(shù)微血管密度(MVD)值低于對(duì)照組,凋亡指數(shù)(AI)高于對(duì)照組,提示DHA對(duì)人膽管癌QBC939裸鼠種植瘤具有抑制作用,可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管生成有關(guān)[12]。陳華等觀察DHA給藥后胰腺癌裸鼠移植瘤體積變化,并通過(guò)對(duì)腫瘤組織標(biāo)本Ki-67染色和TUNEL染色檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡情況,發(fā)現(xiàn)DHA可通過(guò)抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡而抑制胰腺癌體內(nèi)生長(zhǎng)[13]。王雙佳等觀察DHA聯(lián)合吉西他賓治療裸鼠胰腺癌效果,發(fā)現(xiàn)DHA可增強(qiáng)吉西他濱抗腫瘤作用,其分子機(jī)制可能與抑制吉西他賓誘導(dǎo)激活的NF-kB活性增加及下調(diào)NF-kB下游靶基因蛋白表達(dá)有關(guān)[14]。

2 ART及其衍生物與鐵死亡

鐵死亡是一種以鐵積累和脂質(zhì)過(guò)氧化為特征的RCD類型。多不飽和脂肪酸自氧化或脂氧合酶介導(dǎo)氧化導(dǎo)致ROS產(chǎn)生并最終引發(fā)鐵死亡。在這個(gè)過(guò)程中,谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(Glutathione peroxidase 4,GPX4)通過(guò)氧化谷胱甘肽(GSH)將有毒的脂質(zhì)氫過(guò)氧化物還原為乙醇,對(duì)誘導(dǎo)鐵死亡至關(guān)重要。谷胱甘肽由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成,其細(xì)胞內(nèi)濃度受胱氨酸/谷氨酸逆轉(zhuǎn)運(yùn)體(System Xc-)調(diào)節(jié),System Xc-阻斷、GSH缺乏或GPX4抑制均會(huì)破壞其抗氧化功能并引發(fā)典型鐵死亡。細(xì)胞內(nèi)Fe3+和Fe2+的不平衡,或不穩(wěn)定鐵池中Fe2+的積累也可以刺激ROS產(chǎn)生并引發(fā)非典型鐵死亡[15]。

有研究表明,ART通過(guò)內(nèi)過(guò)氧化物橋切割產(chǎn)生的ROS可殺死寄生蟲和癌細(xì)胞;同時(shí),ROS積聚會(huì)引發(fā)鐵死亡并影響鐵死亡相關(guān)蛋白[16]。Yi等報(bào)道,用DHA治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞后,不僅在細(xì)胞質(zhì)中而且在線粒體和脂質(zhì)水平上都觀察到更多的ROS產(chǎn)生,提示ROS引發(fā)的鐵死亡是DHA誘發(fā)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵組成部分,其中GPX4是主要靶標(biāo)[17]。Wang等報(bào)道,暴露于DHA的原發(fā)性肝癌細(xì)胞顯示出鐵凋亡的典型特征,包括ROS和丙二醛水平升高、鐵過(guò)載、編碼System Xc-的溶質(zhì)載體家族成員SLC7A11和SLC3A2表達(dá)下調(diào),從而阻礙谷氨酸和半胱氨酸交換,使用鐵凋亡抑制劑(鐵抑素-1和甲磺酸去鐵胺鹽)可顯著削弱DHA的抗腫瘤作用[18]。這一系列研究證明ART及其衍生物可通過(guò)多種方式如鐵代謝途徑、System Xc-途徑等誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡。

3 ART及其衍生物與自噬

自噬過(guò)程表現(xiàn)為吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡,并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其所包裹內(nèi)容物,借此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新,在正常生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要作用。自噬是一種分解代謝過(guò)程,可降解溶酶體中聚集或永生的蛋白質(zhì)、受損細(xì)胞器、無(wú)活性病原體等。細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激,如缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏、生長(zhǎng)因子耗竭、ROS積累和DNA損傷,可啟動(dòng)自噬發(fā)生。多種自噬相關(guān)蛋白(ATG)組裝成重要復(fù)合物,如ULK1復(fù)合物、PI3KIII復(fù)合物或PI3P結(jié)合復(fù)合物,以啟動(dòng)吞噬細(xì)胞形成。同時(shí),微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈3(light chain 3,LC3)被ATG4切割成LC3-I,通過(guò)ATG7和ATG3進(jìn)一步修飾以與脂質(zhì)磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合生成LC3-II[19]。LC3-II被納入自噬體前[20],招募各種自噬受體(P62、NBR1、Surf1、NIX/BNIP3L)與LC3-II結(jié)合以識(shí)別和吞噬目標(biāo)物質(zhì)并形成自噬體。最后,成熟的雙膜自噬體與溶酶體融合形成自溶酶體并降解隔離其內(nèi)部物質(zhì),隨后釋放出重要的細(xì)胞成分[21]。

在許多癌細(xì)胞中ART類藥物通過(guò)形成LC3或自噬體來(lái)誘導(dǎo)自噬。張澤舜等報(bào)道DHA可以誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(SKMG-4)自噬,自噬相關(guān)蛋白Beclin-1及LC3-B表達(dá)上升,而凋亡相關(guān)蛋白caspase-3卻沒有明顯變化[22],DHA增加LC3-II表達(dá),誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2.2.15自噬。此外還發(fā)現(xiàn)ATS通過(guò)上調(diào)ROS,激活A(yù)MPK-mTOR-ULK1通路誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞自噬。Jiang等發(fā)現(xiàn),ATS處理后的結(jié)腸癌細(xì)胞LC3和beclin-1蛋白表達(dá)水平升高,并發(fā)現(xiàn)自噬小體,表現(xiàn)出自噬作用。使用自噬抑制劑羥氯喹(Hydroxychloroquine,HCQ)可顯著加強(qiáng)ATS誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的自噬效果[23]。

4 ART及其衍生物與焦亡

焦亡是由細(xì)菌、病毒入侵、化療藥物或毒素等因素誘發(fā)的Caspase-1依賴性細(xì)胞程序性死亡。焦亡相關(guān)模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRR)包括Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)、細(xì)胞內(nèi)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(intracellular nucleotide-binding oligomerization domain like receptors,NLR)和AIM2樣受體,它們通過(guò)ASC募集Procaspase-1以形成炎性體[24]。Jiang等報(bào)道,使用DHA處理食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞ESCC后,一些死亡細(xì)胞表現(xiàn)出典型焦變形態(tài),如從細(xì)胞膜上鼓起大泡、可檢測(cè)到丙酮酸激酶亞型M2(Pyruvate kinase subtype M2,PKM2)下調(diào)、Caspase-8/3激活以及GSDME-NT產(chǎn)生。敲除GSDME和應(yīng)用Caspase-8/3特異性抑制劑(z-ITED-FMK/Ac-DEVD-CHO)均能顯著抑制DHA誘導(dǎo)的焦亡?？梢奃HA可通過(guò)PKM2-Caspase-8/3-GSDME途徑誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞焦亡[25]。以上研究表明,ART及其衍生物誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡主要通過(guò)激活Caspase-3誘導(dǎo)的GSDME-NT孔形成,這個(gè)過(guò)程通過(guò)Caspase-3與ART類藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)聯(lián)。

綜上所述,ART及其衍生物可以通過(guò)細(xì)胞凋亡、鐵死亡、自噬和細(xì)胞焦亡等多種RCD途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡,發(fā)揮明確的抗腫瘤作用。深入研究RCD途徑有助于進(jìn)一步開發(fā)ART類藥物在腫瘤治療中的應(yīng)用,同時(shí)為開發(fā)靶向RCD通路分子藥物提供理論依據(jù)。目前ART及其衍生物抗腫瘤效果的臨床研究尚待完善,我們也期待更多相關(guān)基礎(chǔ)與臨床研究為其提供有力的臨床應(yīng)用依據(jù)。