王 立, 謝 靜, 宋 毅, 謝 鵬, 賀小武, 余力棟, 嚴(yán) 爍, 周建平

1.聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇六醫(yī)院 普通外科,浙江 寧波 315040;2.寧波美晶醫(yī)療技術(shù)有限公司,浙江 寧波 315040

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,截止2021年,胃癌在世界范圍內(nèi)發(fā)病率位于腫瘤的第5位,病死率高居腫瘤第4位,中國是胃癌大國,每年新發(fā)胃癌病例全球第一,幾乎占到全球每年新發(fā)病例的50%[1]。由于缺乏早期特異性癥狀,且早期篩查率低,我國胃癌患者預(yù)后更差[2-3]。近年來,隨著分子生物學(xué)檢測的發(fā)展,胃癌的診斷及預(yù)后評估已不僅僅局限于組織學(xué)[4],找出對胃癌的診斷及預(yù)后評估具有意義的新分子生物學(xué)標(biāo)記物非常重要。微管馬達(dá)驅(qū)動(dòng)蛋白4A(KIF4A)屬于kinesin-4家族成員,其在有絲分裂中通過參與染色質(zhì)的濃縮及分離、紡錘體的分離及細(xì)胞質(zhì)的移動(dòng)對真核細(xì)胞有絲分裂的管控、調(diào)節(jié)起著重要作用[5]。KIF4A表達(dá)異常已在多種人類癌癥細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[6-7]。江濤等[6]發(fā)現(xiàn),KIF4A在結(jié)直腸癌中高表達(dá),且與直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)。Wang等[7]研究報(bào)道,KIF4A與阿霉素誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞凋亡相關(guān),影響乳腺癌患者預(yù)后。本研究旨在探討KIF4A在胃癌組織中的表達(dá)水平及其與預(yù)后的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 將聯(lián)勤保障部隊(duì)906醫(yī)院自2021年6月至2022年5月收治的接受手術(shù)治療的19例胃癌患者納入A組。把患者術(shù)中切下的新鮮胃癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織(距離腫瘤>5 cm)加入RNA保存液中,置入-80℃冰箱存放,采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測。再將本院自2006年5月至2015年4月收治的接受手術(shù)治療的103例胃癌患者納入B組,通過手術(shù)獲得103例石蠟包埋胃癌樣本,通過胃鏡獲得35例正常組織樣本。將B組樣本制成組織芯片,采用免疫組化二部法染色方法進(jìn)行染色,并由病理醫(yī)師確認(rèn)結(jié)果。兩組患者術(shù)前均未接受放療、化療,且未合并其他惡性腫瘤?；颊呒捌浼覍倬炇鹬橥鈺?。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器 RNeasy Plus Mini Kit、QuantiTect Reverse Transcription Kit(德國QIAGEN 公司),Power SYBRTM Green PCR預(yù)混液、7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀(美國 Applied Biosystems公司),KIF4A和GAPDH基因引物(上海生工公司),一抗、KIF4A 抗體(武漢ABclonal 公司),兔二抗、DAB顯色試劑盒(上海碧云天公司),CX43生物顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 按照產(chǎn)品說明書使用RNeasy Plus Mini Kit對19對新鮮樣本進(jìn)行RNA提取,以此為逆轉(zhuǎn)錄模板生成cDNA。KIF4A擴(kuò)增的正向引物為5′-AAACGCCATCTGAATGACCTC-3′,反向引物為5′-CGAAACTTGACCACGCACT-3′。GAPDH作為同一個(gè)定量PCR反應(yīng)中的內(nèi)參,其正向引物為5′-TCTGACTTCAACAGCGACACC-3′,反向引物為5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3′。擴(kuò)增條件:1個(gè)預(yù)變性階段(95℃,5 min)和40個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增定量階段(95℃,15 s;60℃,45 s)。每個(gè)樣本的實(shí)驗(yàn)均需重復(fù)3次。Ct表示目的基因的熒光值設(shè)定的閾值時(shí)反應(yīng)循環(huán)數(shù)。采用公式△△Ct=△Ct(腫瘤樣本)-△Ct(對照樣本)計(jì)算每個(gè)腫瘤樣本對于正常對照樣本目的基因的相對Ct值差異。

1.4 組織芯片免疫組化分析 對4 μm厚的組織芯片樣本進(jìn)行脫蠟、水化、檸檬酸抗原修復(fù),加內(nèi)源性過氧化酶阻斷劑,加KIF4A一抗(1∶100)過夜,加兔二抗,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,封片。實(shí)驗(yàn)中陰性對照使用PBS代替一抗進(jìn)行蘇木精染色。結(jié)果由兩名病理科醫(yī)師進(jìn)行判讀。評分標(biāo)準(zhǔn):染色面積0～3分,未著色0分,面積<25% 1分,25%～75% 2分,面積>75% 3分;染色強(qiáng)度0～3分,未著色0分,淡黃色1分,黃色2分,棕色3分。以染色面積與染色強(qiáng)度的乘積為最終評分,按最終評分將樣本分為陰性組(評分<3分)和陽性組(評分≥3分)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料以例(百分率)表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精準(zhǔn)概率法。生存曲線以Kaplan-Meier評估,比較采用log-rank檢驗(yàn)。采用單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型預(yù)測生存時(shí)間。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KIF4A mRNA在胃癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織中mRNA水平比較 在A組的19對樣本中,13例胃癌組織中的KIF4A mRNA水平低于其相應(yīng)癌旁正常組織。見圖1。

圖1 A組19對樣本KIF4A mRNA表達(dá)量差(腫瘤組織-正常組織)

2.2 胃癌和正常組織樣本中KIF4A蛋白陽性率比較 KIF4A蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。B組103例胃癌組織樣本的KIF4A蛋白陽性率為58.3%(60/103),35例正常組織樣本的KIF4A蛋白陽性率為80.0%(28/35)。胃癌組織樣本的KIF4A蛋白陽性率低于正常組織樣本,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 B組胃癌和正常組織免疫組化染色圖片(a.胃癌組織,IHC×100;b.胃癌組織,IHC×400;c.正常組織,IHC×100;d.正常組織,IHC×400)

2.3 KIF4A表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 KIF4A與胃壁浸潤深度、TNM分期相關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 KIF4A表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系/例(百分率/%)

2.4 KIF4A表達(dá)對胃癌患者生存時(shí)間影響Kaplan-Meier曲線 以電話或門診形式對B組患者進(jìn)行隨訪,隨訪至2022年12月,隨訪率為100.0%(103/103)。隨訪中,49例患者死亡,中位生存時(shí)間為58個(gè)月。KIF4A陰性組患者總生存時(shí)間短于KIF4A陽性組患者,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 KIF4A表達(dá)對胃癌患者生存時(shí)間影響Kaplan-Meier曲線

2.5 胃癌患者生存時(shí)間影響因素分析 在單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型中,KIF4A表達(dá)水平、TNM分期、分化程度、胃壁浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與生存時(shí)間相關(guān)(P<0.05)。為校正上述結(jié)果,將單因素分析中的陽性因素納入多因素Cox回歸,結(jié)果提示,KIF4A表達(dá)水平、TNM分期、分化程度可以作為胃癌的預(yù)后影響因子(P<0.05)。見表2。

表2 胃癌患者生存時(shí)間影響因素分析

3 討論

KIF4A最早在小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn),其在神經(jīng)細(xì)胞的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮作用[8]。KIF4A的異常表達(dá)與多種疾病相關(guān),如艾滋病毒感染[9]、阿爾茨海默病[10]及多種癌癥(包括口腔癌[11]、骨肉瘤[12]、胰腺導(dǎo)管腺癌[13]、肝癌[14]、腎透明細(xì)胞癌[15]、子宮癌[16]、腸癌[17])等。KIF4A在腫瘤中的表達(dá)似乎具有兩面性,其低表達(dá)或過表達(dá)均可能抑制癌細(xì)胞的增殖或遷移。例如:KIF4A在肝癌和宮頸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織[18-19],乙型肝炎病毒可能激活KIF4A基因啟動(dòng)子,上調(diào)KIF4A mRNA和蛋白表達(dá),最終導(dǎo)致肝癌發(fā)生[14];而另一方面,KIF4A在多發(fā)性骨髓瘤和急性髓系白血病[20]中表達(dá)顯著降低,骨肉瘤中的KIF4A表達(dá)增加也會(huì)顯著抑制腫瘤生長[12],有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),基因敲除KIF4A可引起小鼠胚胎干細(xì)胞非整倍體發(fā)生,最后導(dǎo)致裸鼠體內(nèi)形成腫瘤[21]。這可能與KIF4A在不同腫瘤中具有不同的調(diào)節(jié)機(jī)制有關(guān)[22]。

有研究報(bào)道,KIF4A的表達(dá)可抑制胃癌細(xì)胞系增殖[23]。本研究首先通過熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)胃癌組織中的KIF4A mRNA水平低于其相應(yīng)癌旁正常組織,然后再通過免疫組化染色方法發(fā)現(xiàn)組織芯片中胃癌組織樣本的KIF4A蛋白陽性率低于正常組織樣本,進(jìn)一步結(jié)合臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)KIF4A與胃壁浸潤深度、TNM分期相關(guān),最后在多因素分析中發(fā)現(xiàn)KIF4A表達(dá)水平、TNM分期、分化程度可以作為胃癌的預(yù)后影響因子。胃癌患者KIF4A低表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)可能是由于KIF4A缺失會(huì)導(dǎo)致有絲分裂缺陷,包括染色體過縮、紡錘體異常形成、后期橋、細(xì)胞質(zhì)分裂缺陷和非整倍體產(chǎn)生[24]。上述問題中的任何一個(gè)均可能會(huì)激活有絲分裂檢查點(diǎn)和DNA損傷反應(yīng)途徑。盡管大部分有絲分裂缺陷細(xì)胞會(huì)通過凋亡或細(xì)胞周期阻滯被消滅,但仍有少部分基因缺陷會(huì)逃脫這些檢查點(diǎn),最終促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[25]。

綜上所述,KIF4A表達(dá)水平與胃癌惡性程度呈負(fù)相關(guān),其低表達(dá)提示預(yù)后不良。隨著研究的深入,KIF4A可能有助于胃癌治療領(lǐng)域新靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)。