劉亞豫?任釗銳?謝欣茹?王禎?王高揚(yáng)?曹廣祥?付加芳

摘要：目的 探究寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas sp. G4菌株中膜孔蛋白D0Y85_RS06780對(duì)抗生素耐藥性的作用。方法 通過(guò)氨基酸序列比對(duì)和同源建模預(yù)測(cè)D0Y85_RS06780蛋白的生物學(xué)功能；采用大腸埃希菌構(gòu)建D0Y85_RS06780基因的異源表達(dá)菌株，通過(guò)檢測(cè)抗生素MICs探討D0Y85_RS06780對(duì)細(xì)菌抗生素抗性的作用，同時(shí)分析外排泵抑制劑對(duì)D0Y85_RS06780功能的影響；利用分子對(duì)接軟件Discovery Studio的CDOCKER技術(shù)分析D0Y85_RS06780與抗生素和外排泵抑制劑的結(jié)合情況。結(jié)果 同源分析表明D0Y85_RS06780為膜孔蛋白，異源表達(dá)D0Y85_RS06780導(dǎo)致重組大腸埃希菌具有多黏菌素和四環(huán)素抗性，外排泵抑制劑利血平能夠抑制其功能，分子對(duì)接顯示D0Y85_RS06780能結(jié)合多黏菌素、四環(huán)素和利血平。結(jié)論 Stenotrophomonas sp. G4菌株中膜孔蛋白D0Y85_RS06780與其抗生素耐藥性有關(guān)。本研究將為D0Y85_RS06780與抗生素耐藥性的關(guān)聯(lián)提供實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

關(guān)鍵詞：寡養(yǎng)單胞菌；膜孔蛋白；耐藥性；異源表達(dá)；分子對(duì)接

中圖分類號(hào)：R917文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Study on the effect of cell membrane porin D0Y85_RS06780

of Stenotrophomonas sp. on bacterial antibiotic resistance

Liu Ya-yu1， Ren Zhao-rui1， Xie Xin-ru1， Wang Zhen2， Wang Gao-yang1， Cao Guang-xiang1， and Fu Jia-fang1

（1 College of Biomedical Sciences， Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences， Jinan 250117;

2 School of Municipal and Environmental Engineering， Shandong Jianzhu University， Jinan 250101）

Abstract Objective To explore the effect of cell membrane porin D0Y85_RS06780 of Stenotrophomonas sp. G4 on bacterial antibiotic resistance. Methods Biological function of D0Y85_RS06780 was predicted based on amino acid sequence alignment and homologous modeling; D0Y85_RS06780 gene was heterologously expressed in Escherichia coli， and its effect on bacterial antibiotic resistance was determined through MICs; The effect of efflux pump inhibitors on D0Y85_RS06780 were also analyzed through antibiotic MICs; The molecular docking was carried out according to the CDOCKER protocol of Discovery Studio to determine whether D0Y85_RS06780 can bind antibiotics and efflux pump inhibitors. Results Homologous analysis showed that D0Y85_RS06780 is a membrane porin protein. Recombinant E. coli expressing D0Y85_RS06780 obtained polymyxin and tetracycline resistance， and the polymyxin resistance could be inhibited by the efflux pump inhibitor reserpine. Molecular docking revealed that D0Y85_RS06780 could bind polymyxin， tetracycline and the efflux pump inhibitor reserpine. Conclusion Cell membrane porin D0Y85_RS06780 of Stenotrophomonas sp. is associated with bacterial antibiotic resistance. This study provides experimental evidence for further research on antibiotic resistance mechanism of cell membrane porin D0Y85_RS06780.

Key words Stenotrophomonas sp.; Membrane porin; Antibiotic resistance; Heterologous express; Molecular docking

微生物通過(guò)多種機(jī)制產(chǎn)生耐藥性[1]，其中，細(xì)菌主動(dòng)外排作用是其主要耐藥機(jī)制之一[2]。根據(jù)外排泵蛋白的氨基酸序列和能量利用可分為5大類：耐藥結(jié)節(jié)化細(xì)胞分化超家族（Resistance-nodulation-cell division，RND）、易化子超家族（Major facilitator superfamily，MFS）、多重耐藥及毒性化合物蛋白家族（multi antimicrobial extrusion，MATE）、耐多藥性家族（small multidrug resistance，SMR）和ATP結(jié)合盒超家族（ATP-binding cassette，ABC），這些外排泵廣泛存在于革蘭陽(yáng)性菌和陰性菌中[3-9]。研究顯示多數(shù)外排泵介導(dǎo)多重耐藥性，而部分外排泵具有底物特異性[10]。除外排泵蛋白外，革蘭陰性菌外膜還存在許多通道蛋白，親水性的溶質(zhì)和其他小分子物質(zhì)可以通過(guò)膜孔蛋白進(jìn)出細(xì)菌[11-12]。一方面，抗菌藥物通過(guò)膜孔蛋白進(jìn)入菌體將細(xì)菌殺死[13-14]，另一方面膜孔蛋白也可能與多重耐藥密切相關(guān)[15]，但膜孔蛋白與抗生素耐藥性的關(guān)聯(lián)尚有待深入闡釋。

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）是重要的醫(yī)源性感染菌，在重癥患者和免疫缺陷患者中可引起致死性感染，其日益嚴(yán)重的多重耐藥性加劇了臨床治療難度（Brooke JS， 2017）[16]。Stenotrophomonas sp. G4菌株為本課題組前期分離獲得的一株多重耐藥菌，對(duì)多種抗生素表現(xiàn)為抗性，其中多黏菌素MIC值>128 mg/L[17]?；蚪M注釋顯示D0Y85_RS06780為膜孔蛋白，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析表明多黏菌素壓力下D0Y85_RS06780轉(zhuǎn)錄水平顯著上升，但其與抗生素抗性之間的關(guān)系仍然未知。本研究通過(guò)構(gòu)建D0Y85_RS06780異源表達(dá)菌株，分析膜孔蛋白D0Y85_RS06780與細(xì)菌抗生素抗性之間的關(guān)聯(lián)，可為闡釋膜孔蛋白參與抗生素耐藥機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

Stenotrophomonas sp. G4菌株為從污水中分離的多重耐藥菌[17]，保存于本實(shí)驗(yàn)室。Escherichia coli DH5α菌株，購(gòu)自上海昂宇生物技術(shù)有限公司。D0Y85_RS06780的異源表達(dá)菌株R06780和P06780，為本研究構(gòu)建。

1.1.2 試劑和儀器

限制酶Hind Ⅲ和 Xba Ⅰ（北京Sibenzyme公司），pMD18-T載體（北京Takara公司），2×clone express（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），Pfu DNA Polymerase（北京艾德萊生物科技有限公司），膠回收試劑盒（美國(guó)Omega公司），質(zhì)粒提取試劑盒（美國(guó)Omega公司）。多黏菌素、氟苯尼考、紅霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、美羅培南、頭孢克肟、四環(huán)素、氨芐青霉素、羰基氰化物間氯苯腙、利血平、維拉帕米、N-甲基吡咯烷酮（麥克林公司）。MTH-100型恒溫混勻儀（杭州米歐儀器有限公司），P-800型酶標(biāo)儀ScanReady（杭州遂真生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 引物

根據(jù)Stenotrophomonas sp. G4菌株基因組（GenBank號(hào)：CP031741.1）序列，通過(guò)BioXM2.6軟件設(shè)計(jì)引物序列。本研究所設(shè)計(jì)的引物序列及其擴(kuò)增長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 D0Y85_RS06780蛋白的同源分析

通過(guò)NCBI查找D0Y85_RS06780蛋白的同源序列，采用CLUSTALW軟件比對(duì)同源蛋白的氨基酸序列，利用ESPript 3軟件查看比對(duì)結(jié)果[18]。

1.2.2 D0Y85_RS06780自身啟動(dòng)子異源表達(dá)菌株的構(gòu)建

以G4菌株的基因組為模板，RS06780-F和RS06780-R為引物（表1），PCR擴(kuò)增D0Y85_RS06780基因含啟動(dòng)子的DNA片段。采用2×clone express重組酶將PCR片段連接至 pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐青霉素篩選轉(zhuǎn)化子，提取重組載體進(jìn)行Hind Ⅲ和Xba Ⅰ酶切驗(yàn)證以及DNA測(cè)序驗(yàn)證，獲得異源表達(dá)D0Y85_RS06780基因（自身啟動(dòng)子）的R06780重組菌株。R06780重組菌株經(jīng)過(guò)Hind Ⅲ和Xba Ⅰ酶切驗(yàn)證、PCR驗(yàn)證及DNA測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.3 D0Y85_RS06780大腸埃希菌啟動(dòng)子異源表達(dá)菌株的構(gòu)建

以G4的基因組為模板，以P06780-F和P06780-R為引物（表1），擴(kuò)增D0Y85_RS06780的基因片段；以pMD18-T載體為模板，AP-F和AP-R為引物（表1），擴(kuò)增β-內(nèi)酰胺酶基因的啟動(dòng)子片段；切膠回收后混合上述兩個(gè)PCR產(chǎn)物作為模板，以AP-F和P06780-R 為引物，采用Pfu DNA聚合酶擴(kuò)增融合基因片段，最后加Taq DNA聚合酶在72℃繼續(xù)反應(yīng)30 min，使PCR產(chǎn)物的末端加3'-A尾巴。通過(guò)T4 DNA連接酶將PCR產(chǎn)物連接至 pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐青霉素篩選轉(zhuǎn)化子，提取重組載體進(jìn)行HindⅢ和XbaⅠ酶切驗(yàn)證以及DNA測(cè)序驗(yàn)證，獲得D0Y85_RS06780基因融合大腸埃希菌啟動(dòng)子的P06780重組菌株。P06780重組菌株經(jīng)過(guò)HindⅢ和XbaⅠ酶切驗(yàn)證、PCR驗(yàn)證及DNA測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4 肉湯微量稀釋法測(cè)定抗生素最低抑菌濃度（MICs）

R06780菌株和P06780菌株采用肉湯微量稀釋法測(cè)定抗生素MICs，測(cè)定方法根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所（CLSI 2018）指南所述[19]。抗生素包括多黏菌素、氟苯尼考、紅霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、美羅培南、頭孢克肟和四環(huán)素。同時(shí)以攜帶pMD18-T載體的DH5α（18T）菌株作為對(duì)照。

1.2.5 抑制劑對(duì)抗生素MICs的影響

使用肉湯微量稀釋法測(cè)定抑制劑對(duì)抗生素MICs的影響，如臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所（CLSI 2018）指南所述[19]。抑制劑選擇羰基氰化物間氯苯腙（CCCP）、利血平、維拉帕米和N-甲基吡咯烷酮，首先用肉湯微量稀釋法測(cè)定P06780重組菌株對(duì)上述4種抑制劑的MICs，然后確定不影響P06780菌株生長(zhǎng)的供試濃度，然后在供試濃度條件下測(cè)定抗生素MICs，同時(shí)以不加抑制劑的P06780菌株作為對(duì)照。

1.2.6 D0Y85_RS06780蛋白與抗生素和抑制劑的分子對(duì)接

從SWISS MODEL數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白同源建模[20]，獲取核心靶蛋白結(jié)構(gòu)，從Chemspider數(shù)據(jù)庫(kù)獲取抗生素和抑制劑小分子配體結(jié)構(gòu)式[21]，用分子對(duì)接軟件Discovery Studio的CDOCKER技術(shù)對(duì)接靶蛋白與小分子配體，分析D0Y85_RS06780蛋白與抗生素和抑制劑分子之間的結(jié)合情況[22]。

2 結(jié)果

2.1 D0Y85_RS06780功能注釋與同源性分析

Stenotrphomonas sp. G4菌株的基因注釋顯示D0Y85_RS06780基因全長(zhǎng)1212 bp，編碼含402個(gè)氨基酸的蛋白。氨基酸序列分析顯示，D0Y85_RS06780與S. maltophilia K279a菌株中OprO和OprP膜孔蛋白的相似性分別為96.5%和30.4%（圖1），與Pseudoxanthomonas suwonensis 11-1菌株中OprO蛋白的相似性為69.1%，與Lysobacter sp. A03菌株中OprP蛋白的相似性為58%，說(shuō)明D0Y85_RS06780可能為OprO類型的膜孔蛋白。

2.2 D0Y85_RS06780異源表達(dá)菌株的抗生素MICs分析

通過(guò)PCR擴(kuò)增得到D0Y85_RS06780基因（含啟動(dòng)子區(qū)）的DNA片段（圖2A），與pMD18-T載體連接獲得重組載體pMD-R06780（圖2B），最后轉(zhuǎn)到DH5α菌株構(gòu)建得到重組菌株R06780。同時(shí)通過(guò)重疊PCR獲得融合大腸埃希菌啟動(dòng)子的D0Y85_RS06780片段（圖2C），與pMD18-T載體連接獲得重組載體pMD-P06780（圖2D），構(gòu)建得到重組菌株P(guān)06780。

肉湯微量稀釋法檢測(cè)R06780和P06780重組菌株的抗生素MICs，結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示DH5α（18T）菌株的四環(huán)素MIC值為8 μg/mL，而P06780菌株（大腸埃希菌啟動(dòng)子）的四環(huán)素MIC值為

64 μg/mL，R06780菌株（自身啟動(dòng)子）的四環(huán)素MIC值為16 μg/mL，顯著高于攜帶pMD18-T載體的DH5α（18T）菌株，說(shuō)明異源表達(dá)D0Y85_RS06780會(huì)導(dǎo)致大腸埃希菌對(duì)四環(huán)素產(chǎn)生抗性。而P06780菌株（大腸埃希菌啟動(dòng)子）的多黏菌素和四環(huán)素MICs值分別為32 μg/mL和64 μg/mL，表明其對(duì)多黏菌素和四環(huán)素均具有抗性。此外，P06780菌株的多黏菌素和四環(huán)素MICs值顯著高于R06780菌株，提示采用宿主啟動(dòng)子可能更有利于D0Y85_RS06780在大腸埃希菌中表達(dá)。

2.3 抑制劑對(duì)P06780菌株抗生素MICs的影響分析

羰基氰化物間氯苯腙（CCCP）、利血平、維拉帕米和N-甲基吡咯烷酮是常用的外排泵抑制劑。本研究首先通過(guò)肉湯微量稀釋法測(cè)定了P06780菌株對(duì)這些外排泵抑制劑的MICs，確定0.1 μg/mL CCCP、

8 μg/mL利血平、8 μg/mL維拉帕米和8 μg/mL N-甲基吡咯烷酮不影響P06780菌株的生長(zhǎng)，因此采用上述濃度作為供試濃度進(jìn)行抑制劑試驗(yàn)。抑制劑對(duì)P06780菌株抗生素MICs的影響見(jiàn)表3，在供試濃度下CCCP、維拉帕米、N-甲基吡咯烷酮對(duì)抗生素MICs值無(wú)顯著影響，而添加8 μg/mL 利血平時(shí)P06780菌株對(duì)多黏菌素的MIC下降為4 μg/mL，比不加抑制劑時(shí)的MIC值（32 μg/mL）明顯降低，說(shuō)明利血平能抑制D0Y85_RS06780蛋白對(duì)多黏菌素的抗性。文獻(xiàn)顯示利血平能夠抑制ABC家族和MFS家族外排泵的功能[23]，提示D0Y85_RS06780可能通過(guò)發(fā)揮外排泵作用使細(xì)菌產(chǎn)生對(duì)多黏菌素抗性。此外，添加8 μg/mL 利血平時(shí)P06780菌株對(duì)四環(huán)素的MIC仍為64 μg/mL，與不加抑制劑時(shí)的MIC值（64 μg/mL）一致，提示利血平能不能抑制D0Y85_RS06780蛋白對(duì)四環(huán)素的抗性。

2.4 膜孔蛋白D0Y85_RS06780與抗生素的分子對(duì)接

CDOCKER分子對(duì)接顯示D0Y85_RS06780蛋白可以結(jié)合多黏菌素和四環(huán)素等抗生素分子（圖3）。分子對(duì)接結(jié)果顯示多黏菌素可結(jié)合D0Y85_RS06780蛋白的B環(huán)Ser-364、 Lys-104、Leu-129、Phe-120、Asn-102氨基酸殘基，四環(huán)素結(jié)合B環(huán)Leu-99、Val-76、Asn-102、Ser-131、Asp-100氨基酸殘基，表明膜孔蛋白D0Y85_RS0678可能具有運(yùn)輸多黏菌素和四環(huán)素的功能，與細(xì)菌的多黏菌素和四環(huán)素抗性有關(guān)。分子對(duì)接顯示外排泵抑制劑利血平也可以結(jié)合D0Y85_RS06780蛋白的B環(huán)和C環(huán) Leu-368、Phe-366、Val-103、Lys-104、Tyr-105、Ile-115氨基酸殘基，考慮到利血平可以顯著降低P06780菌株的多黏菌素MIC（表3），提示利血平可與多黏菌素競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合D0Y85_RS06780蛋白并抑制其運(yùn)輸功能。此外，D0Y85_RS06780蛋白與氟苯尼考、環(huán)丙沙星、卡那霉素、紅霉素、美羅培南和頭孢克肟等抗生素均不能成功對(duì)接，分子對(duì)接數(shù)據(jù)與上述抗生素MICs的結(jié)果一致（表2）。

3 討論

膜孔蛋白與抗生素耐藥性的關(guān)聯(lián)尚有待深入闡釋[24]。生物信息學(xué)分析表明Stenotrphomonas sp. G4菌株中D0Y85_RS06780蛋白為OprO類型的膜孔蛋白，已有的研究顯示假單胞菌中OprO膜孔蛋白與其多重耐藥性相關(guān) [25-26]，提示D0Y85_RS06780可能與細(xì)菌的抗生素抗性有關(guān)。本文進(jìn)一步探討了Stenotrphomonas sp. G4菌株中D0Y85_RS06780膜孔蛋白與抗生素耐藥性的關(guān)聯(lián)。本研究表明異源表達(dá)D0Y85_RS06780時(shí)重組大腸埃希菌P06780的多黏菌素和四環(huán)素MICs值分別為32 μg/mL和64 μg/mL，表明D0Y85_RS06780介導(dǎo)了細(xì)菌的多黏菌素和四環(huán)素抗性。外排泵抑制試驗(yàn)分析顯示添加8 μg/mL利血平時(shí)P06780菌株對(duì)多黏菌素的MIC比不加抑制劑時(shí)明顯降低，提示D0Y85_RS06780可能發(fā)揮外排泵作用從而使細(xì)菌產(chǎn)生多黏菌素抗性。分子對(duì)接分析進(jìn)一步表明多黏菌素和外排泵抑制劑利血平均能結(jié)合D0Y85_RS06780蛋白上的Lys-104氨基酸位點(diǎn)，上述結(jié)果表明Stenotrphomonas sp. G4中膜孔蛋白D0Y85_RS06780與細(xì)菌的多黏菌素抗性之間存在關(guān)聯(lián)。但分子對(duì)接顯示利血平與膜孔蛋白D0Y85_RS0678結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)不同于四環(huán)素與D0Y85_RS0678結(jié)合的氨基酸位點(diǎn)，與抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果（利血平能不能降低D0Y85_RS06780蛋白對(duì)四環(huán)素的MIC值）一致，暗示D0Y85_RS0678雖具有四環(huán)素抗性但其抗性不能被利血平抑制。

P06780菌株（大腸埃希菌啟動(dòng)子）的多黏菌素和四環(huán)素MICs值均高于R06780菌株（自身啟動(dòng)子），提示膜孔蛋白D0Y85_RS06780的表達(dá)水平可能影響其對(duì)抗生素的抗性。此外，Stenotrphomonas sp. G4菌株的多黏菌素和四環(huán)素MICs值[17]與P06780菌株和R06780菌株均有較大差異，除膜孔蛋白D0Y85_RS06780在不同菌體內(nèi)表達(dá)量不同的原因之外，也可能與細(xì)菌體內(nèi)微環(huán)境有關(guān)，還可能與G4菌株存在其它抗生素耐藥機(jī)制有關(guān)，提示細(xì)菌的抗生素抗性受到多因素的復(fù)雜影響。

細(xì)菌外排泵主動(dòng)外排過(guò)程所消耗的能量來(lái)源于質(zhì)子移動(dòng)力（PMF）或ATP水解，研究認(rèn)為SMR家族、MATE家族、MFS家族和RND家族都屬于PMF型，ABC家族為ATP型[27]。研究顯示外排泵抑制劑利血平會(huì)抑制ABC家族外排泵的功能[28]。盡管本文研究表明Stenotrphomonas sp. G4菌株中D0Y85_RS06780膜孔蛋白介導(dǎo)細(xì)菌的抗生素抗性，且其對(duì)多黏菌素的抗性可被利血平抑制，但D0Y85_RS06780能量驅(qū)動(dòng)類型尚需進(jìn)一步深入研究。

參 考 文 獻(xiàn)

Rowe-Magnus D A， Guerout A M， Mazel D. Bacterial resistance evolution by recruitment of super-integron gene cassettes[J]. Mol Microbiol， 2002， 43（6）： 1657-1669.

張剛， 馮婕. 細(xì)菌固有耐藥的研究進(jìn)展[J]. 遺傳， 2016， 38（10）： 872-880.

Coyne S， Courvalin P， Périchon B. Efflux-mediated antibiotic resistance in Acinetobacter spp[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2011， 55（1）： 947-953.

Magnet S， Courvalin P， Lambert T. Resistance-nodulation-cell division-type efflux pump involved in aminoglycoside resistance in Acinetobacter baumannii strain BM4454[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2001， 45（12）： 3375-3380.

Wong E W， Yusof M Y， Mansor M B， et al. Disruption of adeB gene has a greater effect on resistance to meropenems than adeA gene in Acinetobacter spp. isolated from University Malaya Medical Centre[J]. Singapore Med J， 2009， 50（8）： 822-826.

Blanc V， Salah-Bey K， Folcher M， et al. Molecular characterization and transcriptional analysis of a multidrug resistance gene cloned from the pristinamycin-producing organism， Streptomyces pristinaespiralis[J]. Mol Microbiol， 1995， 17（5）： 989-999.

Brown M H， Paulsen I T， Skurray R A. The multidrug efflux protein NorM is a prototype of a new family of transporters[J]. Mol Microbiol， 1999， 31（1）： 394-395.

Bay D C， Rommens K L， Turner R J. Small multidrug resistance proteins： A multidrug transporter family that continues to grow[J]. Biochim Biophys Acta， 2008， 1778（9）： 1814-1838.

Schuldiner S. EmrE， a model for studying evolution and mechanism of ion-coupled transporters[J]. Biochim Biophys Acta， 2009， 1794（5）： 748-762.

Li X Z， Nikaido H. Efflux-mediated drug resistance in bacteria： An update[J]. Drugs， 2009， 69（12）： 1555-1623.

Brunson D N， Maldosevic E， Velez A， et al. Porin loss in Klebsiella pneumoniae clinical isolates impacts production of virulence factors and survival within macrophages[J]. Int J Med Microbiol， 2019， 309（3-4）： 213-224.

Srinivasan V B， Venkataramaiah M， Mondal A， et al. Functional characterization of a novel outer membrane porin KpnO， regulated by PhoBR two-component system in Klebsiella pneumoniae NTUH-K2044[J]. PLoS One， 2012， 7（7）： e41505.

Li Y， Yang H， Zou X， et al. Analysis of the CYP2C19 genetic polymorphism in Han and Uyghur patients with cardiovascular and cerebrovascular diseases in the Kashi area of Xinjiang[J]. Med Sci Monit， 2014， 20： 2213-2218.

Chambers J R， Sauer K. The MerR-like regulator BrlR impairs Pseudomonas aeruginosa biofilm tolerance to colistin by repressing PhoPQ[J]. J Bacteriol， 2013， 195（20）： 4678-4688.

Brunson D N， Maldosevic E， Velez A， et al. Porin loss in Klebsiella pneumoniae clinical isolates impacts production of virulence factors and survival within macrophages[J]. Int J Med Microbiol， 2019， 309（3-4）： 213-224.

Brooke J S， Di Bonaventura G， Berg G， et al. Editorial： A multidisciplinary look at Stenotrophomonas maltophilia： An emerging multi-drug-resistant global opportunistic pathogen[J]. Front Microbiol， 2017， 8： 1511.

Li J， Liu S， Fu J， et al. Co-occurrence of colistin and meropenem resistance determinants in a Stenotrophomonas strain isolated from sewage water[J]. Microb Drug Resist， 2019， 25（1）： 317-325.

Guo R， Huang D， Ji J， et al. A novel mutation GJA8 NM_005267.5： c.124G > A， p.（E42K） causing congenital nuclear cataract[J]. BMC Ophthalmol， 2022， 22（1）： 172.

Tenover F C. Antimicrobial Susceptibility Testing Methods for Bacterial Pathogens[J]. Antimicrob Drug Resist， 2018， 46： W296-W303.

Waterhouse A， Bertoni M， Bienert S， et al. SWISS-MODEL： homology modelling of protein structures and complexes[J]. Nucleic Acids Res，2018， 46（W1）： W296-W303.

Little J L， Williams A J， Pshenichnov A， et al. Identification of “known unknowns” utilizing accurate mass data and ChemSpider[J]. J Am Soc Mass Spectrom， 2012， 23（1）： 179-185.

Rampogu S， Baek A， Son M， et al. Discovery of lonafarnib-like compounds： Pharmacophore modeling and molecular dynamics studies[J]. ACS Omega， 2020， 5（4）： 1773-1781.

Pasca M R， Guglierame P， De Rossi E， et al. mmpL7 gene of Mycobacterium tuberculosis is responsible for isoniazid efflux in Mycobacterium smegmatis[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2005， 49（11）： 4775-4777.

Delcour A H. Outer membrane permeability and antibiotic resistance[J]. Biochim Biophys Acta， 2009， 1794（5）： 808-8016.

Modi N， Ganguly S， Bárcena-Uribarri I， et al. Structure， dynamics， and substrate specificity of the OprO porin from Pseudomonas aeruginosa[J]. Biophys J， 2015， 109（5）： 1429-1438.

Moraes T F， Bains M， Hancock R E， et al. An arginine ladder in OprP mediates phosphate-specific transfer across the outer membrane[J]. Nat Struct Mol Biol， 2007， 14（1）： 85-87.

Rahman T， Yarnall B， Doyle D A. Efflux drug transporters at the forefront of antimicrobial resistance[J]. Eur Biophys J， 2017， 46（1）： 647-653.

顧覺(jué)奮. 外排泵抑制劑研究進(jìn)展[J]. 國(guó)外醫(yī)藥（抗生素分冊(cè)），2020， 41（1）： 1-10.