林嘉玲?何夏夢?蒲芳芳?蒙婷?商正云?胡雯?曾獻春

摘要：目的 探討短期抗生素暴露對氧化偶氮甲烷（Azoxymethane，AOM）誘導(dǎo)小鼠結(jié)直腸癌前病變相關(guān)指征變化的影響。方法 40只3～4周齡SPF級雄性ICR小鼠隨機分為4組（10只/組）：對照組（Control組）、AOM干預(yù)組（AOM組）、抗生素+AOM干預(yù)組（Antibiotics+Azoxymethane，AbxAOM組）以及抗生素組（Antibiotics，Abx組）。AbxAOM組和Abx組灌胃抗生素溶液（氨芐西林100 mg/kg+新霉素100 mg/kg+甲硝唑100 mg/kg+萬古霉素50 mg/kg+兩性霉素B 1 mg/kg），Control組和AOM組灌胃等體積純水，2次/天，連續(xù)14 d。灌胃結(jié)束后，AOM組和AbxAOM組腹腔注射AOM溶液（10 mg/kg·bw），Control組和Abx組腹腔注射相應(yīng)體積的無菌0.9% NaCl溶液，1次/周，連續(xù)4周。HE染色觀察小鼠結(jié)直腸組織病理學(xué)改變；RT-qPCR法檢測結(jié)直腸組織中VCAM-1、ICAM-1、Ki-67、IL-1β、IL-6、TNF-α、VEGF-A、TLR4、MyD88、NF-κB p65及COX-2的mRNA表達(dá)水平；免疫組化法觀察結(jié)直腸組織中Ki-67、NF-κB p65蛋白表達(dá)。結(jié)果 與Control組相比，AOM組小鼠結(jié)腸病理組織學(xué)評分顯著升高（P＜0.01），IL-6、TLR4、NF-κB p65及COX-2的mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。與AOM組比較，AbxAOM組異常隱窩灶（Aberrant crypt foci， ACF）數(shù)量增多（P＜0.05），ICAM-1、IL-1β、NF-κB p65的mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。結(jié)論 AOM處理可導(dǎo)致結(jié)腸病理損傷及ACF形成，可能與TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活有關(guān)?？股乇┞对诙唐趦?nèi)有加劇AOM所致結(jié)腸損傷和TLR4/MyD88/NF-κB信號通路進一步激活的趨勢，但此變化趨勢還需在長期實驗基礎(chǔ)上進一步探討。

關(guān)鍵詞：結(jié)直腸癌；抗生素；氧化偶氮甲烷

中圖分類號：R965文獻標(biāo)志碼：A

Effects of short-term antibiotic exposure on changes in indicators related to azomethane-induced colorectal precancerous lesions in mice

Lin Jia-ling1， He Xia-meng2， Pu Fang-fang2， Meng Ting2， Shang Zheng-yun3， Hu Wen2， and Zeng Xian-chun1

（1 School of Laboratory Medicine， Chengdu Medical College， Chengdu 610500; 2 West China Hospital， Sichuan University， Chengdu? 610041; 3 West China School of Public Health， Sichuan University， Chengdu 610041）

Abstract? ? Objective To investigate the effect of short-term antibiotic exposure on the changes of azoxymethane （AOM）-induced colorectal precancerous lesions in mice. Methods Forty 3- to 4-week-old SPF-grade male ICR mice were randomly divided into four groups （10 mice/group）： Control group （Control group）， AOM intervention group （AOM group）， antibiotic+AOM intervention group （Antibiotics+Azoxymethane， AbxAOM group）， and antibiotic group （Antibiotics， Abx group）. The AbxAOM group and the Abx group were administered with antibiotic solution （ampicillin 100 mg/kg+neomycin 100 mg/kg+metronidazole 100 mg/kg+vancomycin 50 mg/kg +amphotericin B 1 mg/kg）， The control group and the AOM group was given an equal volume of pure water， twice a day， for 14 consecutive days. After gavage， the AOM group and the AbxAOM group were intraperitoneally injected with AOM solution （10 mg/kg.bw）， and the control group and the Abx group were intraperitoneally injected with the corresponding volume of sterile 0.9% NaCl solution， once a week for 4 consecutive weeks. HE staining was used to observe the pathological changes of colorectal tissue in mice. The expression of VCAM-1， ICAM-1， Ki-67， IL-1β， IL-6， TNF-α， VEGF-A， TLR4， MyD88， NF-κB p65， and COX-2 mRNA and the expression of Ki-67 and NF-κB p65 protein in colorectal tissues were detected by RT-qPCR and immunohistochemistry， respectively. Results Compared with the control group， mice in the AOM group had significantly higher colonic pathological histological scores （P＜0.01） and significantly higher mRNA expression of IL-6， TLR4， NF-κB p65， and COX-2 （P＜0.05）. Compared with the AOM group， the number of ACF was increased in the AbxAOM group （P＜0.05）， and the expression of mRNA for ICAM-1， IL-1β， and NF-κB p65 was significantly higher （P＜0.05）. Conclusion AOM treatment leads to colon pathological damage and ACF formation， which may be related to the activation of TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Antibiotic exposure tends to aggravate AOM-induced colon damage and further activate TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway in the short term. However， this trend needs to be further explored on the basis of long-term experiments.

Key words Colorectal cancer; Antibiotics; Azoxymethane

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球常見腫瘤之一。WHO報道每年CRC發(fā)病人數(shù)超過百萬，死亡人數(shù)超過50萬[1]。2020年，中國CRC新發(fā)病例56萬，在惡性腫瘤中發(fā)病率位居第二[2]。CRC的病因復(fù)雜多樣，主要包括遺傳背景因素和環(huán)境危險因素[3]。近年來，大量證據(jù)提示，抗生素暴露可以損傷腸黏膜、造成毒性影響和變態(tài)反應(yīng)、刺激腸道收縮和蠕動、改變腸道微生態(tài)平衡等，進而引起腸道病變，與結(jié)直腸癌的患病風(fēng)險存在關(guān)聯(lián)[4-9]。異常隱窩灶（aberrant crypt foci，ACF）是CRC癌前病變過程中最早期出現(xiàn)的病理結(jié)構(gòu)，既往文獻認(rèn)為，在腸道腫瘤進展期，ACF數(shù)量隨組織學(xué)改變的嚴(yán)重性增加，并且ACF可作為CRC的獨立預(yù)測因素[10-13]。此外，一些重要的炎性因子（如白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等）和炎癥通路（NF-κB信號通路）被認(rèn)為是促進腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素，會加速大腸癌的發(fā)展，尤其是結(jié)腸炎相關(guān)CRC[14-17]。但不同種類、劑量或時間的抗生素暴露和受試對象自身差異等因素，可能導(dǎo)致不同的研究結(jié)論。因此，需要進一步探索抗生素暴露對結(jié)直腸癌前病變相關(guān)指征變化的影響。本研究目的旨在研究短期抗生素暴露對氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）誘導(dǎo)小鼠CRC癌前病變相關(guān)指征變化的影響，并探索其可能的作用機制是否與NF-κB信號通路的激活有關(guān)。

1 實驗對象與方法

1.1 實驗動物

ICR小鼠，SPF級，雄性，3～4周齡，40只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006，并飼養(yǎng)于四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院分析測試中心，動物中心許可證號：SYXK（川）2018-209。飼養(yǎng)溫度設(shè)定在23～25℃范圍，濕度設(shè)定在40%～70%范圍，晝夜明暗交替周期設(shè)定為12 h，飼以SPF級大小鼠維持飼料并自由飲水，飼料和飲水均經(jīng)無菌處理，正式試驗開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 主要試劑與液體的制備

AOM購自Sigma-Aldrich公司，用無菌0.9% NaCl溶液配制，使AOM溶液終濃度為1 mg/mL。

根據(jù)參考文獻[18-20]報道的抗生素聯(lián)用方案，確定本研究抗生素種類及劑量方案為：氨芐西林100 mg/kg? （Cas： 7177-48-2）、新霉素100 mg/kg（Cas： 1405-10-3）、甲硝唑100 mg/kg（Cas： 443-48-1）、萬古霉素50 mg/kg （Cas： 1404-93-9）和兩性霉素B 1 mg/kg（Cas： 1397-89-3）。以上抗生素均購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與處理

本實驗選取40只雄性ICR小鼠作為實驗對象，在實驗初始階段，采用隨機數(shù)字表法將所有小鼠隨機等分為4組，每組10只，分別為：對照組（control組）、AOM干預(yù)組（AOM組）、抗生素+AOM干預(yù)組（antibiotics+azoxymethane，AbxAOM組）以及抗生素組（antibiotics，Abx組）。各組處理措施如下：AbxAOM組和Abx組灌胃含廣譜抗生素的純水溶液，control組、AOM組則灌胃相應(yīng)體積的純水，每天2次，連續(xù)14 d。灌胃結(jié)束后，AOM組和AbxAOM組腹腔注射AOM溶液（10 mg/kg·bw），control組和Abx組則腹腔注射相應(yīng)體積的無菌0.9% NaCl溶液，每周1次，連續(xù)4周。干預(yù)期間，每天監(jiān)測小鼠生長狀況及精神狀態(tài)，每周測量并記錄1次小鼠體重變化，并于處死前1天再進行1次體重稱量及糞便采集。實驗第11周，處死所有小鼠，采集1 cm結(jié)腸組織于4%多聚甲醛中固定48 h后，以備后續(xù)病理及免疫組化檢測；剩余結(jié)腸組織則立即轉(zhuǎn)于-80℃保存，以備后續(xù)RT-qPCR檢測。

1.3.2 ACF的識別與計數(shù)

取多聚甲醛固定后的結(jié)腸組織約1 cm，在顯微鏡下（40～100）觀察并計數(shù)各病灶的ACF總數(shù)。ACF具有以下形態(tài)學(xué)特征：①隱窩較正常黏膜增大、增高；②隱窩周圍間隙增大、管腔不規(guī)則[21]。ACF發(fā)生率=發(fā)生ACF動物數(shù)/實驗動物數(shù)×100%。

1.3.3 結(jié)直腸組織蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE染色）

將結(jié)直腸組織置于4%多聚甲醛（W/V）溶液中固定48 h后，石蠟包埋、切片，隨后行常規(guī)HE染色，封片后于光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片隨機選擇合格的3處視野，根據(jù)參考文獻[22]標(biāo)準(zhǔn)進行病理組織學(xué)評分。

1.3.4 結(jié)直腸組織RNA提取與RT-qPCR分析

嚴(yán)格按照試劑盒（動物組織總RNA提取試劑盒，成都福際生物科技有限公司）說明書步驟提取RNA。隨后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（iscript cDNA Synthesis Kit，Bio-rad）從總RNA合成互補DNA。根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫提供的基因序列，通過Primer 5軟件自行設(shè)計本研究所需目的基因和內(nèi)參的基因序列，退火溫度均設(shè)置為60℃，如表1所示。采用反轉(zhuǎn)錄-定量PCR（quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）法檢測小鼠結(jié)直腸組織核因子-κB p65（nuclear factor-kappa B p65，NF-κB p65）、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、IL-6、Ki-67、Toll樣受體4（toll-like receptors 4，TLR4）、TNF-α、細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）及血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）的mRNA。RT-qPCR反應(yīng)嚴(yán)格遵照試劑盒（SsoFast EvaGreen? Supermix，Bio-rad）說明書所示步驟進行。

1.3.5 免疫組化實驗

每組隨機挑選3只小鼠，采用免疫組化印跡（immunohistochemistry staining，IHC）檢測結(jié)直腸組織中Ki-67、NF-κB p65蛋白含量。使用Image-Pro Plus 6.0分析軟件，統(tǒng)一以像素面積pixel作為標(biāo)準(zhǔn)單位，分別測量每張切片中5個視野陽性的累積光密度值（IOD）以及對應(yīng)的組織像素面積（Area），并計算出面密度=IOD/Area；分別測量每張照片中陽性細(xì)胞數(shù)以及對應(yīng)的總細(xì)胞數(shù)，計算陽性率（%）=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均通過SPSS 26.0進行。不服從正態(tài)分布的資料，使用中位數(shù)和四分位數(shù)間距M（Q1～Q3）進行描述；定量資料條件若滿足正態(tài)性、方差齊，采取均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）的形式進行描述，多組獨立樣本則采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩組間比較采用LSD法。定性資料或不滿足參數(shù)檢驗運用規(guī)則的定量資料，則采用非參數(shù)檢驗，若差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，將各組原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為秩次后，對秩次使用LSD法進行兩兩比較。病理組織學(xué)評分分析用Kruskal-Wallis秩和檢驗。按檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05或P＜0.01則認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重增長趨勢及生長情況

整個實驗過程中，AbxAOM組有3只小鼠意外死亡，分別發(fā)生在實驗第3、4周，AOM組有1只小鼠死亡，發(fā)生在實驗第3周，解剖未發(fā)現(xiàn)特殊病變或腫瘤。如圖1所示，在總體趨勢上，4組小鼠的體重均呈增加趨勢。組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 小鼠結(jié)直腸組織病理組織學(xué)觀察、ACF及腫瘤發(fā)生情況

HE染色結(jié)果顯示：各組小鼠結(jié)直腸組織在肉眼及鏡下均未觀察到腫瘤形成，但有癌前病變ACF形成。AOM組中ACF發(fā)生率為11.11%，AbxAOM組中ACF發(fā)生率為28.57%，Abx組及Control組中無ACF形成。AOM組與AbxAOM組之間ACF發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此外，AbxAOM組的小鼠結(jié)直腸組織中ACF數(shù)量顯著高于AOM組（P＜0.01），如表2所示。

圖2所示，AOM組可見異常隱窩，腸黏膜腺體輕度異型性（可見腺腔增大），輕度不典型增生，可見腸黏膜不同程度炎細(xì)胞浸潤，與Control組相比，AOM組病理評分極顯著升高（P＜0.01）；AbxAOM組結(jié)直腸組織病理學(xué)改變與AOM組類似，兩者病理組織學(xué)評分不具有統(tǒng)計學(xué)差異。Control組和Abx組小鼠腸道病理損傷明顯減輕，結(jié)直腸組織少見或未見腸黏膜輕度炎細(xì)胞浸潤，上皮無明顯缺損，無隱窩萎縮，無ACF、腫瘤等改變。

2.3 AOM和抗生素干預(yù)對CRC小鼠結(jié)直腸組織相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

小鼠結(jié)直腸組織相關(guān)炎癥因子基因的mRNA表達(dá)量如圖3A所示，與Control組相比，AOM組的IL-6 mRNA（P＜0.05）表達(dá)顯著升高；IL-1β mRNA、TNF-α mRNA、VEGF-A mRNA呈升高趨勢?？股馗深A(yù)后，與AOM組相比，AbxAOM組IL-1β mRNA（P＜0.01）表達(dá)水平顯著增加；IL-6 mRNA、TNF-α mRNA、VEGF-A mRNA表達(dá)呈升高趨勢。

小鼠結(jié)直腸組織NF-κB信號通路基因mRNA表達(dá)量如圖3B所示，與Control組相比，AOM組的TLR4 mRNA（P＜0.05）、NF-κB p65mRNA（P＜0.05）、COX-2 mRNA（P＜0.01）表達(dá)均顯著升高；MyD88 mRNA表達(dá)呈升高趨勢?？股馗深A(yù)后，與AOM組相比，AbxAOM組的NF-κB p65 mRNA（P＜0.05）表達(dá)水平顯著增加；TLR4 mRNA、MyD88 mRNA表達(dá)呈升高趨勢。

小鼠結(jié)直腸組織黏附分子基因的mRNA表達(dá)量如圖3C所示，與Control組相比，AOM組的VCAM-1 mRNA、ICAM-1 mRNA呈升高趨勢?？股馗深A(yù)后，與AOM組相比，AbxAOM組的ICAM-1 mRNA（P＜0.01）表達(dá)水平顯著增加；VCAM-1 mRNA表達(dá)呈升高趨勢。

小鼠結(jié)直腸組織增殖相關(guān)抗原基因的mRNA表達(dá)量如圖3D所示，與Control組相比，AOM組的Ki-67 mRNA呈升高趨勢?？股馗深A(yù)后，與AOM組相比，AbxAOM組的ki-67 mRNA表達(dá)呈升高趨勢。

2.4 AOM和抗生素干預(yù)對CRC小鼠NF-κB p65、Ki-67信號通路基因蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，與Control組相比，AOM組NF-κB p65蛋白表達(dá)呈上升趨勢；與AOM組相比，AbxAOM組NF-κB p65蛋白表達(dá)呈進一步增高趨勢，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。Ki-67蛋白表達(dá)各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

本實驗研究終點時未觀察到各組小鼠體重的組間差異，這或許受實驗時間所限。而腸道損傷是CRC進展過程中的重要環(huán)節(jié)，本研究結(jié)果顯示出AOM所致的結(jié)腸黏膜損傷，與Control組相比，AOM組病理評分顯著升高，可見ACF形成、腸黏膜腺體異型性（部分可見腸腔增大），以及輕度不典型增生，而ACF被認(rèn)為是CRC發(fā)生發(fā)展過程中在光鏡下可觀察到的最早期、最小的腸黏膜上皮的癌前病變，與腺瘤、腺癌的發(fā)生密切相關(guān)[23]。有研究顯示，ACF的發(fā)生率以及數(shù)量在正常組、腺瘤組、CRC組呈逐步上升趨勢，CRC組ACF發(fā)生率高達(dá)95%[24]。本實驗研究結(jié)果顯示，AOM組、AbxAOM組均有ACF出現(xiàn)，與AOM組比，不論是ACF發(fā)生率還是均數(shù)，AbxAOM組均呈增長趨勢，提示短期抗生素暴露可能加速AOM誘導(dǎo)CRC癌前病變的發(fā)生發(fā)展。

先前研究揭示了微生物群在結(jié)直腸癌Toll樣受體（Toll-liked receptors，TLRs）依賴性識別中的作用[25]。一旦腸道屏障被微生物破壞，TLRs將識別這些微生物并誘導(dǎo)某些細(xì)胞因子的表達(dá)，最終激活免疫應(yīng)答[26]。例如，革蘭陰性細(xì)菌脂多糖作用于TLR4使其活化后，在細(xì)胞質(zhì)膜表面誘導(dǎo)MyD88的形成，并導(dǎo)致腸黏膜中NF-κB的激活，并誘導(dǎo)許多促炎因子（如細(xì)胞因子和黏附分子）的表達(dá)，從而放大炎癥級聯(lián)反應(yīng)[27-28]。NF-κB的持續(xù)激活可以促進VEGF的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，促進惡性腫瘤血管生成[29]。Wang等[30-31]發(fā)現(xiàn)，在大腸癌患者中，高水平的TLR4和MyD88與肝轉(zhuǎn)移風(fēng)險增加和生存率降低相關(guān)。作為TLR4蛋白的下游因子，NF-κB是一種重要的調(diào)節(jié)因子，與炎癥和癌癥在多個水平上相關(guān)[32-33]。NF-κB p65在CRC組織中的過度表達(dá)與腫瘤分期增加和總生存率低相關(guān)[34-36]。COX-2是NF-κB的靶基因，COX-2在CRC中過表達(dá)，與CRC的發(fā)生有直接相關(guān)[37-40]。有研究顯示全身炎性細(xì)胞因子與TLR4通路關(guān)鍵蛋白（即TLR4、MyD88、NF-κB p65）表達(dá)呈正相關(guān)[41]。類似地，本研究發(fā)現(xiàn)TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活，TNF-α、IL-6、IL-1β、VEGF-A、ICAM-1、VCAM-1在AOM處理后也有升高趨勢?？股靥幚砗笸酚羞M一步激活促炎因子和黏附分子有進一步升高的趨勢，提示短期抗生素暴露可能會加速AOM誘導(dǎo)CRC。

綜上所述，AOM引起結(jié)腸損傷，并導(dǎo)致ACF等癌前病變的產(chǎn)生，其部分機制可能為引起TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的激活，并導(dǎo)致下游COX-2、炎癥因子、黏附分子以及增殖相關(guān)基因表達(dá)升高。而在短期內(nèi)抗生素暴露有加劇AOM所致結(jié)腸損傷和進一步激活TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的可能。然而，腫瘤形成是長期、慢性、多因素影響的過程，本研究不足之處為樣本量較小、抗生素暴露時間較短，研究抗生素暴露對CRC發(fā)生發(fā)展的影響還需設(shè)計更長干預(yù)時間、更全面的實驗予以論證。

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