徐梓凡,鄭昊涵,謝田華,王曉露,姚 勇

(南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院眼科,江蘇 無錫 214023)

非編碼RNA(noncoding RNA,ncRNA)包括小RNA(microRNA,miRNA)、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)等,是由基因組轉錄而成的不編碼蛋白質的RNA,被認為在許多人類疾病的基因表達和進展中發(fā)揮重要作用[1]。其中,circRNA不同于經典的線性RNA,不具有5’末端帽和3’末端poly-A尾,而是通過共價鍵形成單鏈閉合環(huán)狀結構[2]。早在1976年,circRNA作為類病毒首次被報道,在后來的幾十年間它們因被認為是剪接錯誤的產物而被忽視,后來才被發(fā)現(xiàn)是真核生物中內源性RNA的剪接產物[3]。隨著RNA高通量測序技術和生物信息學的發(fā)展,Hansen等[4]于2013年首次報道了環(huán)狀RNA海綿miR-7 (circular RNA sponge for miR-7,ciRS-7)通過“海綿狀”吸附miR-7發(fā)揮生物學作用。目前,研究發(fā)現(xiàn)circRNA的功能包括作為miRNA海綿[5]、與蛋白質相互作用[6]、調節(jié)轉錄和干預剪接過程[7],甚至可以翻譯產生多肽或蛋白質[8],在血管性疾病、炎癥性疾病、神經系統(tǒng)疾病和惡性腫瘤等多種疾病中發(fā)揮重要的生物學作用[9-10]。近年來,有研究[11-12]報道,circRNA的表達變化在眼睛的組織發(fā)育和眼病的進展中產生重大影響。因此,circRNA可能是眼病的診斷、治療及預后評估過程中重要的生物學標志物和干預靶點,其中具體的作用和分子機制,還需要更多的研究去探索。

1 circRNA的特征

circRNA是一類不具有5’末端帽和3’末端poly-A尾巴,通過反向剪接機制形成環(huán)形結構的內源性ncRNA。RNA測序技術證實,circRNA在真核生物中廣泛表達,在某些情況下其豐富度可能超過同源線性RNA[7,13]。circRNA的獨特環(huán)形結構使它們比線性RNA具有更長的半衰期和更強的核糖核酸酶抗性,不易被降解,從而穩(wěn)定地存在于真核細胞中[14]。此外,多個研究證實circRNA還具有保守性和組織特異性,可以在許多疾病中發(fā)揮特殊的分子標記作用[13-15]。真核生物中大多數(shù)的circRNA可以根據(jù)其組成序列的不同分為三個亞型:①外顯子circRNA(ecircRNA),由一個或多個外顯子環(huán)化而產生;②外顯子-內含子circRNA(elciRNA),由保留內含子的外顯子環(huán)化而成;③內含子circRNA(ciRNA),僅由內含子環(huán)化而成[16]。

2 circRNA的形成機制

circRNA的形成機制主要分為兩種模型,包括套索驅動環(huán)化和內含子配對驅動環(huán)化。在單個基因位點上,兩種模型都發(fā)生選擇性剪接,可以產生包含不同內含子和外顯子組合的各種circRNA[15]。

2.1 內含子配對驅動環(huán)化模型[15-17]先進行反向剪接生成帶有外顯子和內含子的環(huán)形結構,然后加工生成circRNA。側翼內含子配對由重復的側翼內含子序列驅動,例如反向重復的Alu元件或反向互補匹配堿基(RCM),使剪接位點接近形成環(huán)狀結構,然后剪掉內含子形成circRNA[18]。此外,一些反式作用因子在circRNA的產生過程中也起到一定的作用,多種RNA結合蛋白(RBP)例如盲肌(MBL)、選擇性剪接因子Quaking(QKI)和RNA編輯酶腺苷酸脫氨酶(ADAR1),已被報道可以與環(huán)狀外顯子兩側的內含子中的特定靶標結合,并通過蛋白質之間的相互作用調控環(huán)化[7,19-20]。側翼內含子結合位點的QKI二聚體高效表達可以促進circRNA的產生[19]。與之相反,ADAR1可通過干擾RNA配對抑制circRNA的形成,從而減少circRNA的數(shù)量[20]。

2.2 套索驅動環(huán)化模型[15]首先形成典型的線性RNA,然后通過外顯子跳躍生成套索結構。內含子被移除后形成ciRNA,剩余的結構通過內剪接頭尾相連,產生ecircRNA或elciRNA。

3 circRNA的功能

3.1 作為miRNA的分子海綿 外顯子circRNA含有miRNA識別元件(MREs),可作為海綿吸附體競爭性結合miRNA,抑制其與mRNA結合,從而靶向基因的翻譯[4]。

3.2 與蛋白質的相互作用 蛋白質和circRNA之間的相互作用非常復雜,circRNA可以作為蛋白質的轉運體、誘餌或支架,調節(jié)蛋白質之間的相互作用及其活性[21]。

3.3 調控基因轉錄、剪接和翻譯 細胞核中的circRNA可以調控基因的轉錄和剪接,circRNA與RNA聚合酶Ⅱ通過特定的RNA-RNA相互作用,促進同源基因的轉錄[22]。此外,circRNA可以通過調節(jié)基因剪接,或者通過競爭RNA結合蛋白(RBPs)來調節(jié)基因翻譯[23]。

3.4 翻譯成多肽或蛋白質 當circRNA序列中存在內部核糖體啟動位點(IRES)時,已經被證明可以在體內和體外翻譯[24],也可以由N6-甲基腺苷(M6A)修飾以不依賴5’帽的方式驅動[25]。

3.5 生成假基因 與mRNAs類似,circRNA有可能被逆轉錄,并整合到宿主基因組中,以產生假基因,參與多種生理和病理過程中DNA、RNA或蛋白質水平的調節(jié)[26]。

3.6 調控表觀遺傳 circRNA可以調節(jié)表觀遺傳修飾,例如DNA或組蛋白甲基化[27]。

4 circRNA與眼科相關疾病

4.1 糖尿病視網膜病變 糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病的主要并發(fā)癥,也是全球范圍內視力下降、致盲的罪魁禍首[28]。視網膜微血管功能障礙(包括視網膜無灌注、血管通透性增加和病理性的視網膜血管新生等)和神經變性(包括神經細胞凋亡和膠質細胞功能障礙等)參與了DR的發(fā)生和發(fā)展[29]。血管內皮生長因子(VEGF)的異常表達和其他因素,如晚期糖基化終末產物、氧化應激、活化的蛋白激酶C(PKC)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路,也被認為是DR血管功能障礙的分子基礎[28]。高糖可以顯著的引起視網膜血管內皮細胞的損傷,增加血管滲出和黃斑水腫,促進病理性的視網膜血管生成等[30]。之前的一項研究通過高通量circRNA微陣列分析檢測了circRNA表達譜的差異,發(fā)現(xiàn)circ-0005015在DR患者的血漿、玻璃體和視網膜前纖維血管膜(FVM)中顯著上調[31]。circRNA可以通過分泌在細胞外囊泡 (EVs)中或組裝成核糖核蛋白復合物,而在體液中被檢測到。研究發(fā)現(xiàn),circ-0005015充當miR-519d-3p海綿來抑制其活性,增加基質金屬蛋白酶-2(MMP-2),X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)和信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)的表達,促進內皮細胞生長、增殖和遷移,參與病理性的視網膜血管生成[31]。在高糖刺激的內皮細胞和DR患者的臨床樣品中,circHIPK3和circCOL1A2的表達上調,circHIPK3通過特異性吸附miR-30a-3p,激活血管內皮生長因子-C(VEGF-C)/FZD4/WNT2的調節(jié)網絡,參與了DR視網膜血管功能障礙的進展[32]。與其類似,circCOL1A2通過調節(jié)miR-29b/VEGF軸,參與DR小鼠的血管生成[33]。另有研究表明,circ-0002570/miR-1243/AMOT(angiomotin)軸[34]和cZNF609/miR-615-5p/MEF2A軸以ceRNA機制調控DR的進展[35]。在高糖環(huán)境中,作為miR-20b-5p海綿的circDNMT3B表達下調,進而下調骨形態(tài)發(fā)生蛋白和激活素膜結合抑制劑(BAMBI),促進了人視網膜微血管內皮細胞的增殖、遷移和管狀形成;過表達circDNMT3B可以減少糖尿病大鼠視網膜無細胞毛細血管數(shù)量,減輕視力損害[36]。

視網膜血管中的血管內皮細胞和周細胞之間的串擾對于血管的穩(wěn)態(tài)和重塑是至關重要的。然而,糖尿病時,周細胞的缺失,可以導致視網膜血管滲漏、閉塞和新血管的形成。Jiang等[37]報道,CZNF532在糖尿病應激下的周細胞中表達上調。與其類似,Liu 等[38]研究發(fā)現(xiàn)cPWWP2A在周細胞中表達上調,而在內皮細胞中的表達沒有統(tǒng)計學差異。DR時,高血糖和氧化應激可以誘導轉錄因子特異性蛋白1(SP1)的表達。已證實SP1通過與cZNF532啟動子區(qū)域結合,激活cZNF532轉錄。增加的cZNF532作為海綿吸附miR-29a-3p而抑制其活性,誘導硫酸軟骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、賴氨酰氧化酶樣蛋白2(LOXL2)和細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)表達增加,從而促進周細胞增殖以及周細胞向內皮細胞的募集[37]。高血糖環(huán)境下,周細胞變性還會導致視網膜毛細血管細胞的進行性喪失,以及脫細胞毛細血管和微動脈瘤的產生。CZNF532基因敲除或miR-29a-3p過表達可加重STZ誘導的視網膜周細胞變性和血管功能障礙,增加未灌注的無細胞毛細血管和微動脈瘤的數(shù)量[37]。周細胞來源的cPWWP2A通過吸附miR-579,調節(jié)血管生成素1(Ang1)/閉合蛋白(occludin)沉默信息調節(jié)因子1(SIRT1)通路,從而影響周細胞覆蓋率和血管完整性。此外,cPWWP2A可以以細胞外囊泡為載體,調控內皮細胞的結構和功能[38]。CPWWP2A的過表達或抑制其下游分子miR-29a-3p和miR-579,可消除糖尿病引起的視網膜血管通透性增高和周圍細胞覆蓋率降低的影響,延緩視網膜血管功能紊亂的進展[38]。

另外,最近兩項研究發(fā)現(xiàn)circ-0041795[39]和circ-0084043[40]在高糖誘導的視網膜色素上皮(RPE)細胞中異常表達,參與了糖尿病條件下的視網膜血管的功能障礙。circ-0041795作為海綿吸附miR-646,靶向VEGF-C,參與HG誘導的ARPE-19細胞分泌促炎因子,如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)和白細胞介素6(IL-6)等水平的調節(jié)[39]。circ-0084043通過海綿樣吸附miR-140-3p,靶向轉化生長因子α(TGFα);沉默circ-0084043可以顯著降低氧化應激的水平,降低丙二醛(MDA)的含量,提高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的活性,從而抑制高糖誘導的炎性反應和細胞凋亡[40]。

4.2 年齡相關性黃斑變性 年齡相關性黃斑變性(AMD)根據(jù)臨床表現(xiàn)和病理改變的不同 AMD 分為兩型:萎縮性 AMD(非滲出型 AMD,或干性型 AMD) 與滲出型 AMD(濕性型 AMD)。RPE、脈絡膜毛細血管和光感受器的萎縮是萎縮性AMD的特征[41]。研究發(fā)現(xiàn),線粒體活性氧的產生促進RPE的去分化,是導致萎縮性AMD發(fā)生發(fā)展的重要因素[42]。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)RPE細胞胞質中的circNR3C1含有多個miRNA結合位點[43]。circNR3C1可以作為海綿結合miR-382-5P,競爭內源性RNA,靶向磷酸酶基因(PTEN)/AKT/mTOR信號通路。而沉默了circN3C1,miR-382-5P活性增強,RPE特征性轉錄本和蛋白水平降低,吞噬作用被抑制,線粒體活性氧產生增多,促進了RPE超微結構的損傷和功能障礙,進而加劇了萎縮性AMD的疾病進展[44]。

滲出性AMD的典型表現(xiàn)是脈絡膜的新生血管(CNV)突破Bruch膜進入視網膜色素上皮(RPE)或隱藏在視網膜下,造成視網膜水腫、滲出、出血等功能障礙,嚴重的還會造成視力下降。在激光誘導小鼠CNV脈絡膜中,CZBTB44的表達顯著上調[45]。CZBTB44作為miR-578海綿,抑制miR-578活性,導致血管內皮生長因子A(VEGFA)和血管細胞黏附分子-1(VCAM1)表達增加;沉默cZBTB44可以延緩激光誘導的CNV的進展[45]。

4.3 角膜疾病 Wu等[46]重點探索了cZNF609在角膜血管新生調控中的生物學作用。角膜縫合術后角膜上皮中的cZNF609表達持續(xù)上調,miR-184表達持續(xù)下調。cZNF609通過抑制miR-184的活性,促進AKT/β-catenin/VEGF信號轉導通路的激活,促進內皮細胞增殖、遷移和管狀形成,從而調控角膜新生血管。然而,cKifap3的作用相反,cKifap3可以顯著抑制內皮細胞的增殖、遷移和成管能力[47]。

4.4 青光眼 直接或間接改善視網膜神經變性是預防、延緩和逆轉青光眼所致視網膜神經變性的一種很有前途的治療方法。血管和神經是體內兩個重要的通道,可以相互作用,通常具有共同的分化、生長調節(jié)功能[48]。之前有研究證明CZNF609參與了缺血誘導的視網膜血管功能障礙[35]。膠質纖維酸性蛋白(GFAP)在青光眼視網膜神經變性過程中明顯增高,視網膜膠質細胞被激活,通過釋放細胞因子、活性氧(ROS)或一氧化氮(NO)等途徑,導致谷氨酸受體的生物合成下降,加重神經元損傷,造成RGC凋亡[49]。最近的兩項研究發(fā)現(xiàn)CZNF609和CZRANB1的表達水平在青光眼引起的視網膜神經變性中顯著上調,通過調節(jié)Müller細胞功能,間接調節(jié)RGC功能,在視網膜神經退行性變中起著重要作用[50-51]。CZNF609作為miR-615海綿,抑制miR-615活性,上調METRN基因表達,而CZRANB1通過CZRANB1/miR-217/RUNX2組成的調控網絡調節(jié)Müller細胞功能,進而影響視網膜神經退行性變的發(fā)生發(fā)展[50-51]。沉默了CZNF609和CZRANB1可以顯著抑制視網膜反應性膠質細胞增生,減少Müller細胞對視網膜節(jié)細胞的有害影響,促進視網膜節(jié)細胞在青光眼中的存活。

4.5 白內障 晶狀體上皮細胞(LECs)的凋亡和氧化損傷被報道參與了晶狀體蛋白氧化、降解、聚集和交聯(lián),是非先天性白內障發(fā)生和發(fā)展的共同分子基礎[52]。有研究報道circHIPK3的異常表達與人晶狀體上皮細胞的凋亡和增殖有關,circHIPK3/miR-193a-3p/α-晶狀體蛋白(CRYAA)網絡參與了體外LECs功能的調節(jié)[53]。最新研究發(fā)現(xiàn),過表達circHIPK3可以顯著抑制miR-221-3p的水平,激活PI3K/AKT通路,通過調節(jié)氧化應激標志物,如MDA和GSH-PX的水平,進而減少了LECs的損傷和凋亡[54]。這些新發(fā)現(xiàn)也提供了新的線索和潛在的治療目標,以揭示年齡相關白內障(ARC)的發(fā)病機制。另一項研究分析了糖尿病相關的白內障患者晶狀體組織中差異表達的circRNA,其中circKMT2E的表達比正常組織高2倍以上,與miR-204-5p的表達趨勢相反。

5 結 語

隨著科技的發(fā)展,越來越多的研究表明了circRNA的異常表達與眼科疾病的進展密切關系。circRNA作為一類新的內源性lncRNA,可能在白內障、青光眼、DR等眼部疾病的進展中發(fā)揮重要作用。circRNA在患者的血漿、房水等中可以被檢測到,可作為潛在的生物標志物和預后評估指標;并且生物合成的circRNA有希望成為治療干預手段。然而,仍有許多未知的circRNA在眼病的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的調控角色。此外,相較于miRNA和lncRNA,circRNA在眼部生物學過程中的作用及分子機制仍有許多空白,迫切需要更多的研究去探索。