郭小雨,張濤

(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122)

酸面團(tuán)是由谷物、水和活性微生物,如乳酸菌和(或)酵母菌,經(jīng)過(guò)發(fā)酵制得的面團(tuán),是一種歷史悠久的面食發(fā)酵劑。這些微生物將內(nèi)在化學(xué)成分發(fā)酵成有機(jī)酸、風(fēng)味化合物和其他重要代謝物,影響發(fā)酵面團(tuán)或烘焙食品的質(zhì)地、感官、營(yíng)養(yǎng)和保質(zhì)期特性[1]。目前,除小麥或黑麥外,其他谷物面粉,如鷹嘴豆,由于其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)和功能特征,已被提議用于制作烘焙產(chǎn)品的酸面團(tuán)[2]。在小麥粉中加入豆類(lèi)面粉可以制成富含蛋白質(zhì)的面制品,鷹嘴豆的氨基酸分布均衡和纖維含量高[3],可提高面包營(yíng)養(yǎng)特性,為消費(fèi)者提供一系列健康益處。

γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)是神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[4],在預(yù)防糖尿病[5]、抗焦慮[6]、降血壓[7]以及促進(jìn)睡眠[8]等方面具有十分重要的作用。同時(shí)GABA還是食品當(dāng)中重要的生物活性成分添加劑。因此富含GABA的功能性新食品的開(kāi)發(fā)越來(lái)越受研究者關(guān)注,可將其用于發(fā)酵健康食品,制作富含GABA的功能性食品,以滿足消費(fèi)者需求。豆類(lèi)含有豐富的底物谷氨酸,是乳酸菌產(chǎn)GABA重要的發(fā)酵基質(zhì)。其中,鷹嘴豆蛋白質(zhì)含量是小麥等谷物的2倍,它們是高質(zhì)量、低成本且環(huán)境友好的蛋白質(zhì)來(lái)源,可以用于控制和預(yù)防高血壓等疾病[9]。利用高產(chǎn)GABA乳酸菌發(fā)酵酸面團(tuán)以增加面制品中GABA含量,將GABA以面包等成品的形式呈現(xiàn),使其成為消費(fèi)者日常補(bǔ)充GABA的良好途徑。

本研究以鷹嘴豆為發(fā)酵基質(zhì),通過(guò)胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)、GABA等活性成分指標(biāo),選擇短乳桿菌作為發(fā)酵菌株。以小麥面包面團(tuán)(wheat bread dough, WBD)、鷹嘴豆面包面團(tuán)(chickpea bread dough, CBD)和化學(xué)酸化鷹嘴豆面包面團(tuán)(lactic/acetic acid acidified bread dough, LA/AA-BD)為對(duì)照,研究富集GABA乳酸菌發(fā)酵鷹嘴豆添加對(duì)面包面團(tuán)的流變特性等影響,為開(kāi)發(fā)富集GABA功能性發(fā)酵食品的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

金龍魚(yú)面包用高筋小麥粉(淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)68.54%,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)11.56%),益海嘉里糧油;高活性干酵母(高糖型),安琪酵母有限公司;優(yōu)級(jí)白砂糖,中糧集團(tuán)(中國(guó))有限公司;食用鹽、新疆卡布里鷹嘴豆,市售;上述均為食品級(jí)。MRS固/液體培養(yǎng)基、酸面團(tuán),由實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 主要儀器設(shè)備

ZCZY-CS8型恒溫培養(yǎng)搖床、DNP-9082型恒溫培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司;GI54DWS型立式高壓滅菌鍋,廈門(mén)致微儀器有限公司;高效液相色譜系統(tǒng)(VWD檢測(cè)器),美國(guó)安捷倫(Agilent)公司;TA.XT Plus物性分析儀,英國(guó)SMS公司;DISCOVERY HR-3流變儀,美國(guó)TA儀器公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 具GABA富集能力的乳酸菌初篩及酸面團(tuán)發(fā)酵

1.3.1.1 鷹嘴豆發(fā)酵基質(zhì)的制備

將保藏的6株乳酸菌作為發(fā)酵菌株,分別為嗜熱乳桿菌ST(StreptococcusthermophilusHH-ST08)、保加利亞乳桿菌IB(LactobacillusbulgaricusHH-IB57)、植物乳桿菌LP(LactobacillusplantarumHH-LP56)、植物乳桿菌FS(LactobacillusplantarumFSB7)、植物乳桿菌CI(LactobacillusplantarumCICC21796)和短乳桿菌CG(LactobacillusbrevisCGMCC1.214)。取上述乳酸菌以體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種至液體MRS培養(yǎng)基中,30 ℃培養(yǎng)6 h。將菌液在4 ℃、6 000 r/min離心10 min,棄上清液,用生理鹽水洗滌菌體2次并重懸于無(wú)菌水中。水與生鷹嘴豆粉按質(zhì)量比1∶1混合,使其總菌落數(shù)達(dá)到107CFU/g,于30 ℃發(fā)酵24 h。為提高乳酸菌鷹嘴豆酸面團(tuán)中EPS產(chǎn)量,將10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的鷹嘴豆粉用蔗糖替代。發(fā)酵完成后得到上述6株乳酸菌對(duì)應(yīng)的鷹嘴豆酸面團(tuán),分別簡(jiǎn)稱(chēng)為SCSD、ICSD、LCSD、FCSD、CCSD和BCSD;未發(fā)酵的鷹嘴豆面團(tuán)為CD。

1.3.1.2 不同乳酸菌發(fā)酵鷹嘴豆中pH、可滴定酸度(titratable acid,TTA)和菌落總數(shù)的測(cè)定

按配方制備的發(fā)酵基質(zhì)在30 ℃培養(yǎng)箱中觀察24 h,定時(shí)取樣。參考KATINA等[10]的方法,測(cè)定鷹嘴豆酸面團(tuán)發(fā)酵前后pH和TTA。

用90 mL 8.5 g/L 的生理鹽水稀釋10 g鷹嘴豆酸面團(tuán),測(cè)定樣品中的乳酸菌菌落數(shù),繼續(xù)稀釋并在MRS瓊脂上接種100 μL的稀釋液,30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h用于菌落計(jì)數(shù)。

1.3.1.3 鷹嘴豆酸面團(tuán)凍干粉的制備

將樣品放入-80 ℃冰箱中冷凍2 h后,置于冷凍干燥機(jī)中凍干。完成后使用研缽研磨成粉狀,置于干燥器中以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.1.4 鷹嘴豆酸面團(tuán)中理化性質(zhì)的測(cè)定

參照程新[11]的方法利用HPLC測(cè)定有機(jī)酸含量,并計(jì)算發(fā)酵熵。發(fā)酵熵是酸面團(tuán)產(chǎn)生的乳酸與乙酸的比值。

參考TANG等[12]的方法測(cè)定EPS的含量;參考羅昆等[13]的方法測(cè)定多肽分子質(zhì)量的分布;參考張賓樂(lè)[14]的方法測(cè)定游離氨基酸和GABA含量。

1.3.2 鷹嘴豆酸面團(tuán)對(duì)面包面團(tuán)性質(zhì)的影響

1.3.2.1 面包面團(tuán)制作

面包面團(tuán)配方詳見(jiàn)表1。將除黃油外的所有配料倒入攪拌缸中,設(shè)置攪拌參數(shù):慢速攪拌3.0 min,使原料混合均勻;快速攪拌3.0 min,將原料攪拌成團(tuán)。加入黃油后慢速攪拌1 min,再快速攪拌3.0 min,至面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成。將攪拌好的面團(tuán)取出,覆上保鮮膜,室溫下擠壓走氣泡,松弛10 min后收于自封袋中,備用。WBD、CBD、LA/AA-BD和BCSBD分別代表小麥面包面團(tuán)、鷹嘴豆面包面團(tuán)、乳酸/乙酸酸化面包面團(tuán)和鷹嘴豆酸面包面團(tuán)。其中,LA/AA-BD是在CBD配方的基礎(chǔ)上,將850 g/L乳酸與醋酸按4∶1的體積比額外添加,面團(tuán)pH值約為4.20,30 ℃培養(yǎng)箱中密封孵育24 h。

表1 四種面包面團(tuán)的配方 單位:g

1.3.2.2 酸面團(tuán)動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性分析

應(yīng)用具有平板(直徑40 mm,間隙1 mm)的動(dòng)態(tài)流變儀,在25 ℃下對(duì)面團(tuán)進(jìn)行振蕩頻率掃描測(cè)試。取2～3 g面團(tuán)放置于帕爾貼板上,平衡松弛1 min,進(jìn)行頻率掃描(0.1～10 Hz)測(cè)試,應(yīng)變?yōu)?.20%。記錄彈性模量(G′)、黏性模量(G″)和損耗角正切(tanδ=G″/G′)。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理分析

采用Origin Pro 2018以及SPSS 26等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)重復(fù)3次,數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株發(fā)酵鷹嘴豆酸面團(tuán)pH、TTA和菌落總數(shù)的測(cè)定

如圖1所示,酸面團(tuán)的初始接種量為7 lg CFU/g。在鷹嘴豆發(fā)酵基質(zhì)中,乳酸菌經(jīng)過(guò)短暫的遲緩期迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。短乳桿菌CG(即BCSD中乳酸菌)在12 h趨于穩(wěn)定,菌落總數(shù)達(dá)到10.30 lg CFU/g左右。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),乳酸菌繼續(xù)保持良好的生長(zhǎng)繁殖的平衡態(tài)勢(shì)。短乳桿菌CG在整個(gè)過(guò)程中對(duì)數(shù)期最長(zhǎng)、后期生長(zhǎng)最穩(wěn)定。

圖1 不同菌株發(fā)酵時(shí)期的菌落總數(shù)

發(fā)酵過(guò)程中,乳酸菌代謝產(chǎn)生多種有機(jī)酸。這一過(guò)程降低了酸面團(tuán)的pH,提高了TTA值,并影響了發(fā)酵基質(zhì)中的內(nèi)源性酶活力,進(jìn)而改變了酸面團(tuán)的各種生化特性[15]。整個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期正是乳酸菌快速累積產(chǎn)酸的時(shí)期,發(fā)酵后期pH變化趨于平緩,可能是因?yàn)榇x產(chǎn)物的積累通過(guò)反饋調(diào)節(jié)從而減緩后期pH下降速率。如表2所示,酸面團(tuán)在30 ℃下發(fā)酵24 h時(shí)pH下降至4.00左右。與酸面團(tuán)的pH變化趨勢(shì)相反的是,鷹嘴豆酸面團(tuán)的可滴定酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升,從最初的TTA為5.75～6.35 mL增加到發(fā)酵24 h時(shí)26.20～27.65 mL。6株乳酸菌中,BCSD的pH值最高,且TTA最大,表明反應(yīng)到達(dá)滴定終點(diǎn)時(shí)所需的堿液含量最多,推測(cè)其發(fā)酵后可能形成了更多pKa大的有機(jī)酸,從而使酸性環(huán)境更加穩(wěn)定、緩沖能力更強(qiáng)。

表2 不同菌株發(fā)酵時(shí)期的pH和TTA

2.2 酸面團(tuán)有機(jī)酸分析

酸面團(tuán)發(fā)酵時(shí),微生物代謝發(fā)酵基質(zhì)中的糖類(lèi)物質(zhì)并生成以乳酸和乙酸為主的有機(jī)酸[16]。發(fā)酵熵是影響酸面團(tuán)發(fā)酵品質(zhì)的重要參數(shù),常用來(lái)關(guān)聯(lián)酸化和風(fēng)味的發(fā)酵參數(shù)之一[17]。發(fā)酵24 h后,BCSD的乳酸和乙酸的含量最低,分別為28.10和7.38 mmol/100 g。有機(jī)酸的差異導(dǎo)致不同酸面團(tuán)的TTA值不同,主要是因?yàn)椴煌袡C(jī)酸躍變范圍不同[18],從而滴定時(shí)消耗的堿液量不同。從表3中可知,CCSD和BCSD最終發(fā)酵熵均在1.5～4的適宜范圍內(nèi)。

表3 不同菌株發(fā)酵前后有機(jī)酸含量和發(fā)酵熵

2.3 酸面團(tuán)EPS含量測(cè)定

如圖2所示,BCSD中發(fā)酵產(chǎn)生的EPS量最多,為1 396.29 mg/L。結(jié)果表明,在乳酸菌發(fā)酵過(guò)程中,添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的蔗糖更加有利于菌種的生長(zhǎng)代謝,加快其產(chǎn)酸速率。高糖和低pH等壓力條件使得乳酸菌在保護(hù)機(jī)制作用下更偏向于合成EPS來(lái)增強(qiáng)自身存活能力[19]。

圖2 不同菌株發(fā)酵產(chǎn)生的EPS含量

2.4 酸面團(tuán)游離氨基酸和GABA含量的分析

在乳酸菌發(fā)酵鷹嘴豆酸面團(tuán)過(guò)程中,鷹嘴豆的內(nèi)源蛋白酶和乳酸菌自身酶系會(huì)促進(jìn)蛋白和糖類(lèi)代謝產(chǎn)生氨基酸,其對(duì)面包的營(yíng)養(yǎng)性、特征風(fēng)味的形成以及整體感官有很大的積極影響[20]。圖3-a顯示,經(jīng)短乳桿菌CG發(fā)酵得到的鷹嘴豆酸面團(tuán)(BCSD)中總游離氨基酸含量為1 645.73 mg/100 g,與未經(jīng)發(fā)酵的鷹嘴豆酸面團(tuán)(755.18 mg/100 g)相比,游離氨基酸含量顯著提高。經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后,BCSD中必需氨基酸含量占總游離氨基酸的比例從鷹嘴豆面團(tuán)(CD)的10.92%增至31.53%;由圖3-b可知,6組發(fā)酵乳酸菌組中,BCSD組的GABA含量最高,是CD組的49.43倍。GABA在鷹嘴豆酸面團(tuán)發(fā)酵過(guò)程中得到富集,面團(tuán)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值增強(qiáng)。

a-游離氨基酸含量;b-GABA含量

2.5 酸面團(tuán)多肽分子質(zhì)量分布的分析

由圖4所示,與對(duì)照組CD相比,經(jīng)過(guò)6株乳酸菌發(fā)酵的鷹嘴豆酸面團(tuán)的蛋白質(zhì)得到很大程度的水解。經(jīng)過(guò)24 h發(fā)酵,分子質(zhì)量>5 000 Da的部分占比顯著降低,從65.95%降到5.89%～3.9%,而分子質(zhì)量在3 000～5 000 Da的大肽含量提高了1.25～2.08倍。尤其是分子質(zhì)量<1 000 Da的低聚肽含量增加的最為顯著,分別提高了47.37%～49.48%,BCSD中的低聚肽含量最多。小分子低聚肽直接被人體吸收,進(jìn)而更好地發(fā)揮其生物學(xué)功能[21],增強(qiáng)產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。實(shí)驗(yàn)表明乳酸菌發(fā)酵能有效地水解蛋白質(zhì),提高鷹嘴豆酸面團(tuán)的低聚肽含量。6株乳酸菌中短乳桿菌CG水解效果最好,可能是因?yàn)槠渥陨懋a(chǎn)生的蛋白酶和肽酶更活躍[22],酸面團(tuán)酸化的環(huán)境更有利于激活蛋白酶水解,從而提高了低聚肽含量。小分子低聚肽能參與酶的合成、激發(fā)酶的活性,從而形成蛋白水解的良性循環(huán)促進(jìn)。該結(jié)果與鷹嘴豆酸面團(tuán)中游離氨基酸的含量較一致。

圖4 不同菌株發(fā)酵前后的多肽分子質(zhì)量分布圖

2.6 流變學(xué)特性分析

如圖5所示,在同一掃描頻率下,各面團(tuán)的G′、G″大小為WBD>BCSBD>LA/AA-BD>CBD。與WBD比,BCSBD的G′和G″均明顯下降。OSBORNE[23]和TAKEDA等[24]認(rèn)為面筋蛋白在酸性pH下溶解度增加,可能是酸性環(huán)境中存在相當(dāng)多的正凈

a-彈性模量;b-黏性模量;c-損耗角正切值

電荷[25],分子間靜電排斥增大導(dǎo)致面筋蛋白的展開(kāi)和疏水基團(tuán)的暴露增加,促進(jìn)部分化學(xué)鍵的斷裂和阻止新鍵的形成,從而導(dǎo)致酸面團(tuán)中的面筋網(wǎng)絡(luò)更加柔軟[26]。與LA/AA-BD相比,BCSBD的G′和G″都顯著提高。這可能因?yàn)槿樗峋a(chǎn)生的EPS可以作為親水膠體[27],改善面團(tuán)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并促進(jìn)其與谷蛋白交聯(lián),增強(qiáng)面團(tuán)的黏彈性。與CAD相比,BCSBD的G′和G″都顯著提高。這可能是因?yàn)辁椬於狗鄣奶砑酉♂屃嗣鎴F(tuán)面筋,鷹嘴豆中的大分子蛋白質(zhì)和淀粉顆粒等影響蛋白質(zhì)分子之間二硫鍵的生成。損耗角(δ)表示面筋蛋白的弱化程度,tanδ值越大,表明弱化程度越顯著。從圖5-c可看出,隨著頻率的增加,4組面包面團(tuán)的tanδ值均呈現(xiàn)先降低、后增大的趨勢(shì)。BCSBD的tanδ值較接近于WBD,說(shuō)明其有類(lèi)似的硬度,易于加工成型。而CBD的tanδ值最大,面團(tuán)的流動(dòng)性較強(qiáng),不易成型。

3 結(jié)論

本研究以新疆鷹嘴豆作為發(fā)酵基質(zhì),篩選短乳桿菌CG發(fā)酵成富集EPS和GABA的酸面團(tuán)。鷹嘴豆酸面團(tuán)發(fā)酵工藝參數(shù)為:菌種接種時(shí)期為6 h,發(fā)酵溫度為30 ℃,發(fā)酵時(shí)間為24 h。此條件下,短乳桿菌CG在鷹嘴豆酸面團(tuán)中生長(zhǎng)良好,酸化能力強(qiáng)且GABA產(chǎn)量高。發(fā)酵后,鷹嘴豆蛋白降解效果最為明顯,能促進(jìn)大分子質(zhì)量蛋白降解為小分子蛋白和低聚肽,且游離氨基酸和必需氨基酸含量顯著增加。鷹嘴豆直接添加和化學(xué)酸化均不利于面團(tuán)的形成及穩(wěn)定,并且破壞面團(tuán)的黏性和彈性之間的平衡。而乳酸菌發(fā)酵能夠降低其產(chǎn)生的不利影響,賦予面團(tuán)良好的流變特性,使其更加穩(wěn)定。為開(kāi)發(fā)富集GABA功能性發(fā)酵食品的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ),此外,提高了鷹嘴豆在生產(chǎn)中的應(yīng)用潛力。