張耀海,張念,王成秋,李晶,趙希娟,焦必寧

1(西南大學/中國農業(yè)科學院柑桔研究所,重慶,400712)2(農業(yè)農村部柑桔及苗木質量監(jiān)督檢測測試中心,重慶,400712)3(農業(yè)農村部柑橘類果品質量安全控制重點實驗室,重慶,400712)4(農業(yè)農村部柑桔產品質量安全風險評估實驗室,重慶,400712)5(國家柑桔工程技術研究中心,重慶,400712)

我國柑橘生產長達4 000多年,歷史悠久、資源豐富,品種齊全,以寬皮柑橘、橙類、柚類、檸檬和金柑5大類為主。2019年我國柚類產量達598.28萬t,占總柑橘產量的13.05%,僅次于寬皮柑橘和甜橙類。根據(jù)地理、氣候和品種類型自然組合,我國的柚產區(qū)形成了東南沿海柚區(qū)、華南柚區(qū)、西南柚區(qū)3個主產區(qū)。其中,梁平柚、沙田柚、龍安柚和東風早等為西南柚區(qū)主要栽培品種。柚類主要用于果汁、糖果、果醬罐頭及精油等制備,但柚類加工量不到柚類產量的1%[1-2]。柚果實營養(yǎng)豐富,富含類黃酮[3-6]、酚酸[4-5, 7]、香豆素[5, 8]、類檸檬苦素[9]、類胡蘿卜素[10]、生物堿[11]、肌醇[12-13]和揮發(fā)性物質[14]等多種生物活性成分。這些功能性成分,在柚果不同部位、不同成熟期其組成也有很大的差異[15]。

目前,國內外對柚果實營養(yǎng)功能成分報道主要集中于單一品種和單一成分,而不同成熟期的研究較少。胡陽等[16]比較了不同生長期琯溪蜜柚囊衣和外皮層中柚皮苷含量變化,其含量隨成熟期呈下降趨勢。XU等[7]研究了不同成熟期胡柚果皮和果肉中酚酸的組成和分布,結果表明,肉桂型在酚酸中占主導地位,阿魏酸最為豐富,且果皮含量高于果肉;每個部位的酚酸含量隨著成熟度急劇降低。CANCALON等[17]利用HPLC-MS研究了成熟度、加工和貯藏對葡萄柚及其果汁中6′,7′-二羥基香檸檬亭、香檸檬素、香柑醇等呋喃香豆素的影響。SUN等[9]分析了不同成熟期胡柚、佛香柚、溫州密柑和椪柑等4個柑桔品種不同組織中檸檬素和諾米林的含量變化,結果表明,檸檬素和諾米林的含量從4月開始增加,9月初達到峰值,隨后下降,直到10月下旬達到一個穩(wěn)定的低水平。CHAUDHARY等[14]利用頂空固相微萃取氣質聯(lián)用(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometer,HS-SPME-GC-MS)技術鑒定了葡萄柚汁中的揮發(fā)性化合物,且成熟度對柚汁的揮發(fā)性成分有顯著影響。NIE等[18]利用主成分分析對不同采收期馬家柚的抗氧化能力綜合評價,結果表明,抗壞血酸、番茄紅素、類胡蘿卜素、總酚和總黃酮等成分與抗氧化能力呈顯著正相關,確定最佳采收期為11月初。但俊峰等[19]分析了浙江省一帶的4個柚品種不同組織部位、不同生長期主要功能性成分的含量差異。

本文基于超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-tandem mass spectrometry,UPLC-QqQ-MS/MS)快速確證分析多種次生代謝產物技術,選取了西南地區(qū)6種特色柚果(東風早柚、琯溪蜜柚、長壽沙田柚、梁平柚、龍安柚和豐都紅心柚),靶向篩查和定量分析不同成熟期柚果重要部位(外皮層、內皮層和果肉)中主要營養(yǎng)功能成分,旨在為柚果功能食品的開發(fā)、品種選育及深加工領域提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

東風早柚、琯溪蜜柚、長壽沙田柚、梁平柚、龍安柚均來自于中國農業(yè)科學院柑桔研究所國家果樹種質重慶柑桔圃,豐都紅心柚采集于重慶豐都縣。采集成熟度以時期[幼果期(簡稱M1)、膨大期(M2)、生長膨大期(M3)、成熟轉色期(M4)和商業(yè)成熟期(M5)]及果實大小為依據(jù),東風早柚屬于早熟柚,其他5個品種屬于中熟柚,具體采摘信息如表1所示,分別制取外皮層、內皮層和果肉3個部位樣品。

表1 柚果實信息

甲酸(色譜純),上海麥克林生化科技有限公司;86種標準物質包括42種類黃酮、27種香豆素、8種酚酸、6種生物堿和3種類檸檬苦素;半齒澤蘭素-5-甲醚、4′,5,6,7-四甲氧基黃酮和3′,4,7,8-四甲氧基黃酮,純度均≥95.0%;4′,5,7,8-四甲氧基黃酮、5-羥基-3′,4′,7-三甲氧基黃酮、異橙黃酮、4′,5,7,8-四甲氧基黃酮、水仙苷、芹菜素、櫟精-3,7,3′,4′-四甲醚、牡荊素、異牡荊素、異槲皮苷、槲皮素、佛手柑內酯、花椒毒素、異橙皮內酯、香柑醇、水合氧化前胡素、氧化前胡素、異紫花前胡內酯、珊瑚菜素、蛇床子素、8-氧甲基異歐前胡內酯、綠原酸和黃柏酮,純度均≥98.0%;檸檬內酯(純度≥98.2%)、異歐前胡素和歐前胡素(純度均≥99.0%),上海源葉生物技術有限公司;橙皮苷(純度≥97.1%)、甜橙黃酮和芥子酸(純度均≥98.0%)、牡荊素-2-O-鼠李糖苷和原兒茶酸(純度均≥98.1%)、枸橘苷(純度≥98.4%)、野漆樹苷和桔皮素(純度均≥98.5%)、柚皮苷和橙皮素(純度均≥98.6%)、新橙皮苷和香草酸(純度均≥98.8%),根皮素(純度≥98.9%)、蘆丁(純度≥99.1%)、香蜂草苷和咖啡酸(純度均≥99.3%)、金合歡素(純度≥99.4%)、川陳皮素(純度≥99.7%)、p-香豆酸(純度≥99.8%)、對羥基苯甲酸和阿魏酸(純度均≥99.9%),上海安譜實驗科技股份有限公司;3′,4′,5,7-四甲氧基黃酮、維采寧-2、5-羥基-4′,7,8-三甲氧基黃酮、斯皮諾素、5-降甲基蜜桔黃素、蔓荊子黃素、圣草次苷、梔子黃素B、地奧司明、新地奧司明、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、香蒲新苷、甲基橙皮苷、柚皮素、異補骨脂素、東莨菪亭、香葉木素、甜菜堿、諾米林和檸檬苦素,純度均≥98.0%,成都克洛瑪生物科技有限公司;橙皮內酯水合物、橙皮內酯(純度均≥90.0%)、6′,7′-二羥基香檸檬亭(純度≥95.1%)、大麥芽堿(純度≥97.5%)、6′,7′-環(huán)氧香檸檬亭(純度≥97.8%)、橙皮油素和酪胺(純度均≥98.5%)、辛弗林(純度≥98.8%)、甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純),美國Sigma-Aldrich公司;濱蒿內酯(純度≥95.0%)、香檸檬素(純度≥96.9%)、8-牻牛兒醇基補骨脂素(純度≥98.5%)、補骨脂素(純度≥99.1%)、N-甲基酪胺(純度≥99.5%)、5-牻牛兒醇基-7-甲氧基香豆素(純度≥99.9%),美國ChromaDex公司;傘形花內酯(純度≥99.0%)、章魚胺(純度≥99.3%),德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器與設備

Nexera X2 UPLC超高效液相色譜,日本島津公司;SCIEX 6500+三重四極桿串聯(lián)質譜,美國AB SCIEX公司;ACQUITY UPLC BEH T3色譜柱(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm),美國Waters公司;Milli-Q Advantage A10超純水器,美國Millpore公司;XS205電子天平(感量0.01 mg),PB3002-S/FACT分析天平(感量0.01 g),瑞士梅特勒-托利多公司;0.22 μm有機相針式濾器,上海安譜科學儀器有限公司;KQ5200DE超聲波清洗儀,昆山市超聲儀器有限公司;3K15高速冷凍離心機,Sigma-Aldrich (USA)。

1.3 實驗方法

1.3.1 液相條件

色譜柱:ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm);柱溫度40 ℃;流速為0.3 mL/min;進樣量1.0 μL;流動相:體積分數(shù)0.1%的甲酸水溶液(A)和乙腈(B);梯度洗脫程序見表2。

表2 流動相梯度洗脫

1.3.2 質譜條件

Sciex QTrap?6500的質譜數(shù)據(jù)是采用多反應監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring,MRM),質譜條件、86種目標化合物及其MRM參數(shù)參考文獻[20]和[21]。

1.3.3 混合標準溶液配制

將86種目標化合物配制為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1、2、5、10、20、25、50和100 μg/L一系列質量濃度的混標。所有混標均置于棕色進樣小瓶中。

1.3.4 樣品前處理

分別稱取5.00 g鮮重樣品于50 mL離心管中,加入甲醇(外皮層、內皮層中加入10 mL,果肉中加入5 mL),25 ℃、200 W超聲波提取30 min;10 000 r/min離心5 min,保留取上清液。殘渣重復4次,將上清液合并,并用甲醇定容(外皮層、內皮層定容至50 mL,果肉定容至25 mL),0.22 μm微孔有機濾膜過濾,上機檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 2022軟件繪圖、處理數(shù)據(jù),所有樣品均為3次平行。

2 結果與分析

2.1 柚果實不同成熟期功能成分的靶向篩查

柚果實外皮層、內皮層和果肉3個重要部位提取物中篩查出功能成分的種類及數(shù)量見表3,同一品種、同一成熟期、不同部位篩查出的種類數(shù)量均呈以下規(guī)律:外皮層>內皮層>果肉;隨成熟期的延長,同一品種、同一部位篩查出的種類數(shù)量有明顯變化,變幅為2～9種,平均變幅為4.6種,最高為梁平柚外皮層由幼果期到膨大期的轉變;隨成熟期的延長,外皮層和內皮層篩查出的種類數(shù)量大致呈增加趨勢,而果肉則大致呈減少趨勢。3個部位累計篩查出72種物質,14種未篩查出的物質如下:3′,4′,5,7-四甲氧基黃酮、4′,5,7,8-四甲氧基黃酮、5-羥基-3′,4′,7-三甲氧基黃酮、甲基橙皮苷、蘆丁、蔓荊子黃素、新地奧司明、斯皮諾素等8種類黃酮,佛手柑內酯、異歐前胡素、香檸檬素、異補骨脂素、花椒毒素等5種香豆素和大麥芽堿1種生物堿。其中,梁平柚外皮層,最高可達70種,東風早最少(56種);豐都紅心柚內皮層,最高可達61種,琯溪蜜柚最少(50種);東風早果肉,最高可達56種,琯溪蜜柚最少(45種)。

表3 柚果實中篩查的功能成分的種類及數(shù)量

就類黃酮而言,同一品種、同一成熟期不同部位篩查出種類數(shù)量也呈以下規(guī)律:外皮層>內皮層>果肉。川陳皮素、牡荊素-2-O-鼠李糖苷、野漆樹苷、維采寧-2、桔皮素、甜橙黃酮、根皮素、5-降甲基蜜桔黃素、5-羥基-3′,4′,7-三甲氧基黃酮、圣草次苷、水仙苷、牡荊素、異牡荊素、柚皮苷、柚皮素、槲皮素16種類黃酮在不同品種、不同成熟期、不同部位均有檢出。柚果實的類黃酮主要以黃烷酮為主,包括柚皮苷和圣草次苷。有關柚果中多甲氧基黃酮的研究較少,如有文獻報道:在柚果中鑒定出川陳皮素、桔皮素和甜橙黃酮等多甲氧基黃酮[19];而在本論文中6個柚果樣品中均有桔皮素、甜橙黃酮、5-降甲基蜜桔黃素、5-羥基-3′,4′,7-三甲氧基黃酮等多甲氧基黃酮檢出。梁平柚外皮層,最高可達33種,東風早最少(24種);豐都紅心柚內皮層,最高可達30種,琯溪蜜柚和龍安柚最少(23種);東風早果肉,最高可達27種,豐都紅心柚最少(21種)。這與篩查出功能成分的總種類數(shù)量規(guī)律基本吻合。

就香豆素而言,外皮層篩查出的種類數(shù)量略高于內皮層和果肉,其中梁平柚外皮層最高可達21種。隨著成熟期的延長,柚果肉中香豆素種類顯著性減少,而外皮層和內皮層香豆素種類變化不大。佛手柑內酯、異歐前胡素、香檸檬素、異補骨脂素、花椒毒素等5種香豆素在不同品種、不同成熟期、不同部位均未有檢出;異橙皮內酯、橙皮油素、6′,7′-環(huán)氧香檸檬亭、異紫花前胡內酯、珊瑚菜素、蛇床子素等6種香豆素在外皮層中未檢出,而在果肉和內皮層中部分檢出;歐前胡素、補骨脂素、濱蒿內酯、檸檬內酯、東莨菪亭、香葉木素等6種香豆素在果肉中未檢出,而在外皮層和內皮層中部分檢出。

就酚酸而言:隨成熟期的延長,同一品種、同一部位篩查出的酚酸種類數(shù)量沒有明顯變化;對羥基苯甲酸、芥子酸、對香豆酸、原兒茶酸、阿魏酸和綠原酸等6種酚酸在不同品種、不同成熟期、不同部位均有檢出;香草酸在商業(yè)成熟期的琯溪蜜柚外皮層中未檢出,咖啡酸在幼果期和生長期的長壽沙田柚外皮層中未檢出。

就類檸檬苦素而言:檸檬苦素在不同品種、不同成熟期、不同部位均有檢出;諾米林在幼果期的龍安柚內皮層中未檢出,黃柏酮在幼果期的長壽沙田柚內皮層中未檢出。

就生物堿而言:隨成熟期的延長,同一品種、同一部位篩查出的生物堿種類數(shù)量沒有明顯變化;辛弗林和酪胺在不同品種、不同成熟期、不同部位均有檢出,而大麥芽堿均未檢出;章魚胺和N-甲基酪胺在不同品種、不同成熟期的外皮層中均檢出,這2種生物堿在內皮層和果肉中均未檢出。

2.2 柚果實不同成熟期功能成分的定量分析

對篩查出的功能成分進行了定量分析,共計26種物質高于定量限,包括11種類黃酮、8種香豆素、4種酚酸和3種類檸檬苦素,分別是野漆樹苷、維采寧-2、根皮素、圣草次苷、水仙苷、牡荊素、異牡荊素、地奧司明、柚皮苷、香蒲新苷、柚皮素、香柑醇、橙皮油素、6′,7′-環(huán)氧香檸檬亭、6′,7′-二羥基香檸檬亭、傘形花內酯、橙皮內酯水合物、蛇床子素、橙皮內酯、香草酸、對羥基苯甲酸、對香豆酸、阿魏酸、諾米林、檸檬苦素、黃柏酮。對不同成熟期外皮層、內皮層和果肉功能成分的含量做了熱圖,其含量用不同顏色表示,紅色代表該物質在樣品中的含量高,藍色則代表該物質在樣品中的含量低,綠色代表其含量低于定量限,結果如圖1所示。就整體而言,類黃酮、香豆素和類檸檬苦素是6種柚果的3類主要生物活性成分,而酚酸和生物堿的含量相對較低。

a-外皮層;b-內皮層;c-果肉

26種功能成分在外皮層中變化趨勢,如圖1-a所示。外皮層的類黃酮主要以柚皮苷、維采寧-2和野漆樹苷為主,6個品種在同一成熟期基本呈現(xiàn)柚皮苷>維采寧-2>野漆樹苷的規(guī)律;柚皮苷含量隨著成熟期呈現(xiàn)先升高后降低趨勢,6個品種柚皮苷含量均在生長膨大期達到最大值(圖2-a),這與文獻報道基本吻合[16];而維采寧-2和野漆樹苷含量基本呈現(xiàn)下降趨勢(圖2-b和圖2-c)。生長膨大期龍安柚的柚皮苷可達最高(3 772.20 mg/kg FW),豐都紅心柚最低(813.13 mg/kg FW);幼果期琯溪蜜柚的維采寧-2可達最高(832.30 mg/kg FW),長壽沙田柚最低(126.23 mg/kg FW);幼果期琯溪蜜柚的野漆樹苷可達最高(681.97 mg/kg FW),豐都紅心柚最低(8.87 mg/kg FW)。較于內皮層和果肉,外皮層中的香豆素更豐富,其中以橙皮內酯、6′,7′-環(huán)氧香檸檬亭和橙皮內酯水合物為主,橙皮油素和蛇床子素次之,大多數(shù)品種其含量隨著成熟期均呈現(xiàn)下降趨勢(圖3-a～圖3-e):膨大期梁平柚的橙皮內酯可達2 416.18 mg/kg FW,豐都紅心柚的僅為4.32 mg/kg FW;幼果期琯溪蜜柚的6′,7′-環(huán)氧香檸檬亭高達1 449.22 mg/kg FW,龍安柚的僅為69.47 mg/kg FW;幼果期東風早的橙皮內酯水合物高達886.58 mg/kg FW,龍安柚的僅為6.11 mg/kg FW。龍安柚、豐都紅心柚外皮層中酚酸以香草酸最為豐富,其他品種酚酸含量不高,組成和分布也不盡相同。類檸檬苦素以檸檬苦素和諾米林為主,還有少量的黃柏酮,其含量隨著成熟期均呈現(xiàn)降低的趨勢,這與文獻報道基本吻合[19]:膨大期豐都紅心柚的檸檬苦素可達178.41 mg/kg FW,東風早的僅為24.69 mg/kg FW;膨大期長壽沙田柚的諾米林可達224.17 mg/kg FW,龍安柚的僅為0.013 mg/kg FW(圖4-a、圖4-b)。

a～c-外皮層;d～f-內皮層;g～i-果肉

a～e-外皮層;f-內皮層;g～i-果肉

a～b-外皮層;c～d-內皮層;e～f-果肉

26種功能成分在內皮層中變化趨勢,如圖1-b所示。內皮層的類黃酮也是以柚皮苷、野漆樹苷和維采寧-2為主,6個品種在同一成熟期均呈現(xiàn)柚皮苷>野漆樹苷>維采寧-2的規(guī)律;與外皮層相似,柚皮苷含量隨著成熟期呈現(xiàn)先升高后降低趨勢,柚皮苷含量均在生長膨大期達到峰值(圖2-d),而野漆樹苷和維采寧-2含量大致呈現(xiàn)下降趨勢(圖2-f和圖2-e)。較于外皮層和果肉,內皮層中的柚皮苷普遍更為豐富。生長膨大期龍安柚的柚皮苷可達最高(9 537.83 mg/kg FW),豐都紅心柚最低(2 784.68 mg/kg FW),這與外皮層柚皮苷分布規(guī)律吻合;幼果期琯溪蜜柚的野漆樹苷可達最高(180.72 mg/kg FW),梁平柚最低(14.33 mg/kg FW);膨大期琯溪蜜柚的維采寧-2可達最高(56.21 mg/kg FW),梁平柚最低(5.31 mg/kg FW),這與內皮層野漆樹苷分布規(guī)律吻合。內皮層的香豆素以橙皮內酯水合物為主,還有少量的6′,7′-環(huán)氧香檸檬亭和6′,7′-二羥基香檸檬亭,其含量隨著成熟期呈現(xiàn)下降的趨勢(圖3-f):幼果期東風早的橙皮內酯水合物可達最高(172.89 mg/kg FW),豐都紅心柚的僅為3.54 mg/kg FW。較外皮層,內皮層中酚酸的含量偏低,其變化趨勢也不盡相同。類檸檬苦素以檸檬苦素和諾米林為主,黃柏酮次之,其含量隨著成熟期均呈現(xiàn)降低趨勢,這與文獻報道基本吻合[19]:幼果期琯溪蜜柚的檸檬苦素可達75.86 mg/kg FW,東風早的僅為23.59 mg/kg FW;幼果期長壽沙田柚的諾米林可達228.34 mg/kg FW,梁平柚的僅為44.00 mg/kg FW(圖4-c、圖4-d)。

26種功能成分在果肉中變化趨勢,如圖1-c所示。果肉的類黃酮以柚皮苷、野漆樹苷和維采寧-2為主,其含量隨著成熟期而下降,這與文獻報道的結果相似[19]:隨著成熟度的上升,四季柚、文旦(授粉和未授粉)和早香柚4種柚果實果肉中的黃酮類物質含量多數(shù)在下降,并且初期急劇下降。在本論文中,幼果期琯溪蜜柚的柚皮苷可達最高(906.01 mg/kg FW),長壽沙田柚最低(49.77 mg/kg FW);幼果期梁平柚的野漆樹苷可達最高(572.40 mg/kg FW),琯溪蜜柚最低(低于定量限);幼果期長壽沙田柚的維采寧-2可達最高(302.50 mg/kg FW),龍安柚最低(52.32 mg/kg FW)(圖2-g～圖2-i)。果肉中香豆素以6′,7′-二羥基香檸檬亭、6′,7′-環(huán)氧香檸檬亭和橙皮油素為主,其含量隨著成熟期整體呈現(xiàn)下降的趨勢,這與文獻報道較吻合[17]:白馬敘葡萄柚汁中6′,7′-二羥基香檸檬亭和香檸檬素含量會隨著成熟度延長而顯著降低,而香柑醇含量隨著成熟度延長先升高后降低。在本論文中,幼果期琯溪蜜柚的6′,7′-二羥基香檸檬亭可達354.32 mg/kg FW,龍安柚的僅為0.003 mg/kg FW;膨大期東風早的6′,7′-環(huán)氧香檸檬亭高達212.07 mg/kg FW,梁平柚的僅為0.019 mg/kg FW;幼果期東風早的橙皮油素高達139.11 mg/kg FW,梁平柚僅為0.069 mg/kg FW(圖3-g～圖3-i)。與外皮層和內皮層相似,果肉中酚酸的含量均偏低,此結果與提取方式有直接關系[22];酚酸含量大多隨成熟期而降低,這與文獻報道吻合[7]。類檸檬苦素以檸檬苦素和諾米林為主,其含量也隨著成熟期先上升再下降,大多在膨大期附近達到最高值,這與文獻報道一致[9]:膨大期長壽沙田柚的檸檬苦素可達88.17 mg/kg FW,梁平柚的僅為4.06 mg/kg FW;成熟轉色期琯溪蜜柚的諾米林可達126.73 mg/kg FW,豐都紅心柚的僅為16.86 mg/kg FW(圖4-e、圖4-f)。

3 結論

本文選取了西南地區(qū)6種特色柚果(東風早柚、琯溪蜜柚、長壽沙田柚、梁平柚、龍安柚和豐都紅心柚),利用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜技術,靶向篩查和定量分析了5個成熟期、3個重要部位(外皮層、內皮層和果肉)中主要生物活性成分。結果表明,5個成熟期,累計篩查出72種活性成分;對篩查出的活性成分進行了定量分析,共計26種,包括11種類黃酮、8種香豆素、4種酚酸和3種類檸檬苦素。就整體而言,類黃酮、香豆素和類檸檬苦素是6種柚果的3類主要生物活性成分,而酚酸和生物堿的含量相對較低。隨著成熟度的延長,外皮層和內皮層的柚皮苷均呈現(xiàn)先升高后降低趨勢,且在生長膨大期達到最大值,果肉的柚皮苷和3個部位的維采寧-2和野漆樹苷整體呈現(xiàn)下降趨勢。3個部位的香豆素和類檸檬苦素含量隨著成熟度大多呈現(xiàn)下降趨勢。此研究結果明確了柚果實生長過程中生物活性成分的動態(tài)變化規(guī)律,為柚果功能食品的開發(fā)、品種選育及深加工領域提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。