唐源,于明光,王寶松,王瑩,宋煥祿

(北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院,北京,100048)

郫縣豆瓣醬源于四川,是中國著名的地理標(biāo)志性產(chǎn)品,作為一種調(diào)味品,其色澤紅亮,香氣獨(dú)特,被譽(yù)為“川菜之魂”[1]。豆瓣醬通常由辣椒和蠶豆兩大原料經(jīng)微生物發(fā)酵和曬缸工藝制成[2]。風(fēng)味是反應(yīng)豆瓣醬整體質(zhì)量的重要指標(biāo),明確豆瓣醬中的關(guān)鍵香氣化合物對其后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)的質(zhì)量把控有重要意義[3]。目前,國內(nèi)外對豆瓣醬香氣研究所用的萃取方法可以歸結(jié)為3類,以固相微萃取(solid phase micro-extraction, SPME)和攪拌棒吸附萃取(stir bar sorptive extraction, SBSE)為代表的非溶劑萃取的萃取方式,以溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)(solvent-assisted flavor evaporation, SAFE)為代表的有溶劑輔助的萃取方式,以同時(shí)蒸餾萃取(simultaneous distillation extraction, SDE)為代表的蒸餾萃取方式[4-5]。喬鑫等[6]采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(solid phase micro-extraction- gas chromatography-mass spectrometry,SPME-GC-MS)對工業(yè)化生產(chǎn)豆瓣醬和傳統(tǒng)釀造豆瓣醬的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,分別鑒定出39和38種揮發(fā)性化合物;ZHAO等[7]采用SBSE與GC-MS聯(lián)用,并結(jié)合氣相色譜-嗅聞(gas chromatography-olfactometry,GC-O)技術(shù),結(jié)果顯示,乙酸和苯乙醛等化合物對豆瓣醬香氣有重要貢獻(xiàn);ZHANG等[8]采用SDE-GC-O-MS與香氣化合物稀釋分析(aroma extraction dilution analysis, AEDA)結(jié)合,鑒定出22種香氣化合物,其中4-乙基愈創(chuàng)木酚、苯甲醛和2,5-二甲基吡嗪等化合物的風(fēng)味稀釋(flavor dilution, FD)因子較高,是豆醬中的關(guān)鍵香氣物質(zhì);LI等[9]使用SAFE與SPME兩種萃取方法與GC-O-MS聯(lián)用,結(jié)合AEDA在豆瓣醬中共鑒定出苯乙醇、3-甲基丁酸等13種FD≥2的香氣活性化合物。這些研究表明采用不同的萃取方法會(huì)導(dǎo)致鑒定出的關(guān)鍵香氣化合物的種類和數(shù)量存在差異,從而影響豆瓣醬的特征香氣表征的全面性和準(zhǔn)確性。同時(shí),關(guān)于豆瓣醬的特征香氣能否被上述方法最大程度萃取也鮮有報(bào)道,只有選擇合適的方法才能萃取出種類更為全面的香氣化合物,最大限度地反映樣品的真實(shí)香氣特征[10]。

本研究首先對比不同萃取方法對豆瓣醬香氣的提取效果,篩選出更適合豆瓣醬樣品香氣物質(zhì)的萃取方法;然后基于篩選出的萃取方法,結(jié)合AEDA解析各香氣化合物的貢獻(xiàn)程度,明確豆瓣醬中關(guān)鍵的香氣活性化合物;最后對關(guān)鍵香氣活性化合物進(jìn)行定量分析并計(jì)算氣味活性值(odor activity value, OAV),進(jìn)一步表征豆瓣醬的香氣特征。研究將為豆瓣醬風(fēng)味特征的全面解析提供理論支持與指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品Y1和Y2,鵑城牌郫縣豆瓣醬公司,樣品信息如下:

Y1:二荊條辣椒、曬瓣子等,曬缸制作,發(fā)酵3年;Y2:二荊條辣椒、美國紅辣椒、烘瓣子等,曬場條池制作,發(fā)酵1個(gè)月。在分析之前所有樣品均儲(chǔ)存在實(shí)驗(yàn)室冰箱內(nèi)(4 ℃)。

無水乙醚、無水Na2SO4、NaCl(分析純),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;正己烷、正構(gòu)烷烴(C8～C25)、2-甲基-3-庚酮、己醛、庚醛、1-辛烯-3-酮、2,5-二甲基吡嗪、二甲基三硫醚、壬醛、1-辛烯-3-醇、苯甲醛、3-甲基丁酸、α-萜品醇和4-乙基愈創(chuàng)木酚(色譜純),美國Sigma公司;氦氣(99.999 0%)、氮?dú)?99.999 2%)和液氮(99.999 0%),北京氦普北分氣體工業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC-MS包括7890A型氣相色譜和7000型質(zhì)譜,美國Agilent公司;極性DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm,0.25 μm),美國J&W Scientific公司;ODP4型嗅聞儀,德國Gerstel公司;GC×GC-MS包括8890A型氣相色譜和5977型質(zhì)譜,美國Agilent公司;SSM1800固態(tài)調(diào)制器,中國上海J&X Technologies公司,使用2根色譜柱,DB-Wax色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),美國J&W Scientific公司和DB-17毛細(xì)管柱(1.85 m×0.18 mm,0.18 μm),美國J&W Scientific公司;Sniffer 9100型嗅聞儀,瑞士Brechbuhler公司;多功能自動(dòng)進(jìn)樣器(multi-purpose autosampler, MPS)、熱脫附系統(tǒng)(thermo-desorption unit, TDU)、PTV冷卻型進(jìn)樣口(cool injection system , CIS)和玻璃襯管,德國Gerstel公司;溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)裝置,德國Glasblaserei Bahr公司;Vigreux柱(10 cm×1 cm),北京半夏科技發(fā)展有限公司;HN200氮吹儀,濟(jì)南海能儀器股份有限公司。

1.3 香氣萃取方法

1.3.1 SPME

取2 g豆瓣醬、8 g超純水和1 g NaCl于20 mL頂空瓶中,加入1 μL 2-甲基-3-庚酮(0.816 μg/μL),55 ℃平衡20 min,然后插入75 μm CAR/PDMS/DVB萃取頭,吸附40 min。吸附結(jié)束后在GC進(jìn)樣口230 ℃下解析5 min。每種樣品重復(fù)3次。

1.3.2 SBSE

參考并根據(jù)實(shí)際情況優(yōu)化ZHAO等[7]的SBSE萃取法。取2 g豆瓣醬、8 g超純水和1 g NaCl于40 mL頂空瓶,加入1 μL 2-甲基-3-庚酮(0.816 μg/μL)。隨后加入攪拌棒萃取器(PDMS涂層,長10 mm,厚度0.5 mm),在55 ℃下設(shè)定轉(zhuǎn)速120 r/min,萃取90 min,萃取結(jié)束后用超純水清洗晾干,轉(zhuǎn)移到玻璃熱脫附管中進(jìn)行解析。每種樣品重復(fù)3次。

1.3.3 SAFE

取25 g豆瓣醬,加入10 μL 2-甲基-3-庚酮(0.816 μg/μL),使用100 mL乙醚進(jìn)行萃取,180 r/min攪拌2 h(4 ℃),重復(fù)2次,合并有機(jī)相,在40 ℃的真空環(huán)境下進(jìn)行SAFE蒸餾,將所得餾出物用Na2SO4(無水)干燥,使用Vigreux柱濃縮至10 mL,然后氮吹至500 μL,進(jìn)樣1 μL。每種樣品重復(fù)3次。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜參數(shù)

1.4.1 GC分析條件

色譜柱:DB-WAX(30 m×0.25 mm, 0.25 μm);不分流模式進(jìn)樣;載氣為99.999%氦氣,流量1 mL/min,壓力15.71 kPa;升溫程序:初始溫度50 ℃,然后以3 ℃/min的速率升溫至230 ℃。

1.4.2 GC×GC分析條件

SPME和SBSE進(jìn)樣,不分流模式;液體進(jìn)樣,采用分流模式,分流比9∶1;載氣為99.999%氦氣,流量1 mL/min,壓力15.71 kPa;進(jìn)樣口溫度230 ℃,兩根色譜柱分別為DB-Wax色譜柱(30 m×0.25 mm, 0.25 μm)和DB-17毛細(xì)管柱(1.85 m×0.18 mm, 0.18 μm);柱溫箱升溫程序:初始溫度50 ℃,然后以3 ℃/min的速率升溫至230 ℃;固態(tài)調(diào)制器測定的冷區(qū)溫度-50 ℃,加熱區(qū)的入口和出口溫度分別為70、160 ℃;調(diào)制周期4 s。

TDU升溫程序:初始溫度50 ℃,維持1 min,后以100 ℃/min升至280 ℃,維持5 min。

CIS升溫程序:超低溫液氮先將CIS溫度迅速降到-80 ℃,待TDU解吸完成之后,再以10 ℃/min升到250 ℃,維持1 min。

1.4.3 MS條件

電子轟擊(electronic ignition,EI)離子源,電離能量70 eV;離子源溫度230 ℃,四桿溫度150 ℃,掃描模式為全掃模式,溶劑延遲4 min,質(zhì)量范圍m/z40～350。

1.4.4 嗅聞儀條件

傳輸線溫度280 ℃,嗅聞口溫度200 ℃,通入濕潤的N2氣保持實(shí)驗(yàn)員鼻腔濕潤。實(shí)驗(yàn)員準(zhǔn)確記錄嗅聞到的氣味特征和出現(xiàn)時(shí)間。

1.5 定性分析

通過質(zhì)譜圖(MS)、保留指數(shù)(retention index,RI)、嗅聞結(jié)果(olfactometry,O)和標(biāo)準(zhǔn)化合物(standard compound,STD)對比鑒定郫縣豆瓣醬中的香氣化合物。化合物的保留指數(shù)則通過正構(gòu)系列烷烴(C8～C25)的保留時(shí)間計(jì)算得到,RI值計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

式中:n,系列烷烴中碳原子個(gè)數(shù);Tn,正構(gòu)烷烴Cn的保留時(shí)間,min;Ta,樣品中化合物a的保留時(shí)間(化合物a的保留時(shí)間在Cn與Cn+1之間),min。

1.6 AEDA

通過調(diào)節(jié)分流比(0、1∶3、1∶9、1∶27、1∶81等)進(jìn)行AEDA分析,直到實(shí)驗(yàn)員在嗅聞口聞不到任何氣味時(shí)停止稀釋,得到相應(yīng)的FD定義為1、3、9、27、81等。香氣化合物的FD因子越高,該化合物對食品整體香氣貢獻(xiàn)就越大。

1.7 香氣活性化合物定量分析

根據(jù)AEDA的結(jié)果,使用GC-MS對豆瓣醬香氣活性化合物(FD≥9)進(jìn)行精確定量[11],將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋,根據(jù)加入標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度與其經(jīng)儀器分析得到的峰面積之間的關(guān)系,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,然后在相同實(shí)驗(yàn)條件下對豆瓣醬樣品進(jìn)行檢測,將測得的香氣化合物的峰面積帶入對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線,即可得到豆瓣醬樣品中對應(yīng)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù),以μg/kg為單位計(jì)算。所有分析重復(fù)3次。

1.8 OAV的計(jì)算

OAV定義為香氣化合物濃度與閾值之比,可驗(yàn)證香氣化合物對樣品特征香氣的貢獻(xiàn)程度。按公式(2)計(jì)算:

(2)

式中:ρa(bǔ),化合物a的質(zhì)量濃度,μg/kg;ρ(OTa),化合物a在水中的閾值,μg/kg。

1.9 數(shù)據(jù)處理

樣品中香氣化合物的含量均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Microsoft Excel 2016對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,柱狀圖由Origin 2018軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種萃取方法的效果對比

為避免使用單個(gè)樣品的實(shí)驗(yàn)偶然性和片面性,本研究選用2種發(fā)酵時(shí)長差異較大的豆瓣醬樣品。3種前處理方法結(jié)合GC×GC-O-MS在Y1和Y2中共鑒定出香氣化合物45種,如表1所示。其中,醇類11種、酸類9種、醛類7種、酯類6種、酮類4種、酚類3種、吡嗪類2種、吡咯類1種和含硫化合物2種。Y1中共檢測到香氣化合物45種,SPME、SBSE和SAFE分別提取到香氣化合物33、39和24種。其中,3-甲基丁醛、2/3-二甲基丁酸乙酯和二甲基三硫醚等9種香氣化合物僅通過SBSE富集后被感官人員所嗅聞到,明顯高于SPME(3種)和SAFE(1種)萃取方式中特有的香氣化合物。Y2中共檢測到香氣化合物36種,SPME、SBSE和SAFE分別提取到香氣化合物25、33和26種。與Y1相同,采用SBSE富集到的可被嗅聞到的香氣化合物的種類最為豐富,同時(shí)特有化合物的種類也最多。這說明,不同萃取方法對于豆瓣醬中的香氣化合物的萃取效果有較大差異[12]。因此,針對不同的樣品選擇適合的香氣萃取方法是必要的。從萃取的香氣化合物數(shù)量上來看,對于豆瓣醬樣品,萃取效果依次為:SBSE、SPME、SAFE,這可能是因?yàn)镾AFE制樣操作復(fù)雜、耗時(shí)長造成了香氣化合物的損失[13],SBSE的吸附劑涂層量比SPME大,因此SBSE具有更大的樣品容量和更好的重現(xiàn)性[14]。因此,相比于SPME和SAFE,SBSE是更適合豆瓣樣品香氣化合物富集的有效方法。

表1 不同萃取方法下豆瓣醬的香氣化合物萃取結(jié)果

2.2 豆瓣醬香氣化合物分析

不同萃取方法下2個(gè)豆瓣醬樣品中各類香氣化合物的數(shù)量如圖1-a、圖1-b所示。2個(gè)豆瓣醬樣品中,采用3種提取方法得到的醇類、醛類、酸類和酯類化合物數(shù)量較多,酮類、酚類、吡嗪類、吡咯類和含硫化合物數(shù)量較少。Y1中檢測到的各類化合物數(shù)量普遍多于Y2,這可能是因?yàn)閅1的發(fā)酵時(shí)間較長,而豆瓣醬的香氣主要在后熟發(fā)酵過程中產(chǎn)生[15]。原料中的蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪等大分子物質(zhì)分解生成各類小分子風(fēng)味前體物,繼而在多種微生物的共同作用下生成酚類、醛類、酮類、醇類等小分子風(fēng)味物質(zhì),從而形成了豆瓣醬的典型風(fēng)味特征。

a-Y1中香氣化合物數(shù)量;b-Y2中香氣化合物數(shù)量

醇類化合物是酯化反應(yīng)的重要前體物,主要由不飽和脂肪酸氧化降解產(chǎn)生,對郫縣豆瓣整體風(fēng)味有重要貢獻(xiàn),在食品中常呈甜香氣味[16]。在Y1和Y2中檢測到的醇類化合物數(shù)量最多。2,3-丁二醇、1-辛烯-3-醇和3-甲基丁醇等化合物在Y1和Y2中均被檢出。據(jù)報(bào)道,這些醇類香氣化合物不僅存在于中國豆瓣醬[17]中,也存在于日本味噌[18]和韓國大醬[19]中,是豆類發(fā)酵食品中常見的香氣化合物。

醛類化合物主要呈現(xiàn)青草、柑橘等氣味,通常由脂肪氧化和Strecker降解產(chǎn)生[20]。醛類化合物閾值較低,對豆瓣醬的整體香氣有較大貢獻(xiàn)。其中,3-甲基丁醛、壬醛和糠醛等醛類化合物在2種豆瓣醬樣品中均被檢出,這與前人報(bào)道豆瓣醬的香氣化合物結(jié)果相似[21]。

豆瓣醬中的酸類物質(zhì)有微生物降解、原料酶解、脂肪水解等多種來源[7]。在2種豆瓣醬樣品中共檢測出了乙酸、3-甲基丁酸等9種酸類香氣化合物,這些酸類物質(zhì)在豆制品發(fā)酵產(chǎn)品中較為常見[18],在食品中產(chǎn)生汗酸味、腐臭味等不愉快氣味。

2.3 香氣活性化合物分析

Y1中檢測到的香氣化合物總數(shù)高于Y2(表1),且2個(gè)樣品中SBSE法檢測到的香氣化合物數(shù)量高于SPME和SAFE。為較為全面地分析郫縣豆瓣醬中香氣活性化合物,故選用SBSE法對香氣特征更為豐富的Y1進(jìn)行AEDA,通過逐漸縮短提取時(shí)間達(dá)到稀釋效果。結(jié)果如表2所示,39種香氣活性化合物在Y1中被檢出,其中11種化合物被認(rèn)為是重要的香氣活性化合物(FD≥9)。

表2 SBSE法對Y1樣品香氣活性化合物的AEDA結(jié)果

Y1中各類化合物FD因子如圖2所示。Y1中醇類和酸類香氣活性化合物個(gè)數(shù)較多,然而香氣貢獻(xiàn)率不高,兩者不呈正相關(guān),可能是因?yàn)榇碱悺⑺犷惢衔镩撝灯毡楸容^大,故對豆瓣醬的整體香氣的貢獻(xiàn)度較低[22]。但1-辛烯-3-醇較為特殊(FD=81),表現(xiàn)出類似蘑菇香氣,這可能是由于其為不飽和醇,其閾值低于飽和醇,易被人感知[23],1-辛烯-3-醇在封閉式和開放式發(fā)酵的豆瓣醬中均被鑒定為關(guān)鍵香氣活性化合物[24],對豆瓣醬特征香氣有較大貢獻(xiàn)。含硫化合物為二甲基三硫醚(FD=243),能賦予豆瓣醬肉香、洋蔥等香氣,推測來源于豆瓣醬中添加的蒜等香辛料[25]。4-乙基愈創(chuàng)木酚(FD=81)呈煙熏味,在豆瓣醬中通常相對含量較高[26],是豆瓣醬后熟發(fā)酵的重要關(guān)鍵香氣成分。

圖2 Y1中各類化合物的FD

2.4 豆瓣醬中關(guān)鍵化合物的定量分析與OAV分析

采用外標(biāo)法對AEDA得到的11個(gè)關(guān)鍵香氣活性化合物進(jìn)行定量分析,結(jié)果如表3所示,所有香氣物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性系數(shù)R2均介于0.992 2～0.998 1,線性良好,Y1中3-甲基丁酸和2,5-二甲基吡嗪含量較高。3-甲基丁酸通常被認(rèn)為由亮氨酸分解產(chǎn)生,是發(fā)酵制品中常見的揮發(fā)性化合物[27]。吡嗪類化合物主要來源于原料中蛋白質(zhì)和氨基酸的熱分解和美拉德反應(yīng),2,5-二甲基吡嗪是美拉德反應(yīng)的重要產(chǎn)物,能賦予食品濃郁的堅(jiān)果香氣[28]。然而,Y1中3-甲基丁酸和2,5-二甲基吡嗪的FD因子和OAV較低,其原因是這2種化合物的氣味閾值較高,難以被人們感知,因此,單獨(dú)分析香氣化合物含量的多少并不能說明該物質(zhì)對食品整體香氣的貢獻(xiàn)。

表3 豆瓣醬關(guān)鍵香氣活性化合物定量結(jié)果和OAV

OAV是評(píng)價(jià)香氣化合物香氣強(qiáng)弱以及樣品香氣貢獻(xiàn)度大小的重要指標(biāo)之一,OAV≥1,表明該化合物對豆瓣醬整體風(fēng)味具有貢獻(xiàn),數(shù)值越大表示貢獻(xiàn)越大[29]。Y1中己醛(FD=729,OAV=68)和1-辛烯-3-酮(FD=729,OAV=67)對豆瓣醬的整體香氣貢獻(xiàn)較大,分別為豆瓣醬提供了青草味和蘑菇味。己醛是豆制品中常見的化合物,是豆?jié){、豆腐等豆制品中豆腥味的主要來源[30],也是評(píng)估油脂氧化程度的重要指標(biāo),在肉制品、乳制品等食品原料中均有應(yīng)用[31]。己醛和1-辛烯-3-酮主要來自于花生四烯酸和亞油酸等不飽和脂肪酸的氧化[32],豆瓣醬中的脂肪主要來源于蠶豆、辣椒等植物性原料,含量約為12.25%,脂質(zhì)經(jīng)微生物代謝分解成脂肪酸等小分子物質(zhì),為豆瓣醬中己醛和1-辛烯-3-酮等香氣活性化合物形成提供了原料[33]。

3 結(jié)論

本研究使用GC×GC-O-MS結(jié)合SPME、SBSE和SAFE三種萃取方法對豆瓣醬的香氣進(jìn)行全面的解析,并比較了不同萃取方法富集豆瓣醬樣品的香氣化合物的適宜程度。結(jié)果表明,使用SBSE法對豆瓣醬香氣化合物的萃取更全面,采用SBSE-GC×GC-O-MS,在Y1中共檢測出39種香氣活性化合物,經(jīng)過計(jì)算FD因子和OAV,篩選出其中11種關(guān)鍵香氣化合物,分別為己醛、庚醛、1-辛烯-3-酮、2,5-二甲基吡嗪、二甲基三硫醚、壬醛、1-辛烯-3-醇、苯甲醛、3-甲基丁酸、α-萜品醇和4-乙基愈創(chuàng)木酚,對豆瓣醬的青草味、煙熏味和蘑菇味等香氣有較大貢獻(xiàn)。本研究篩選出了一種適合豆瓣醬的香氣化合物萃取方法,明確了豆瓣醬中的關(guān)鍵香氣化合物,可以作為改進(jìn)豆瓣醬生產(chǎn)工藝的理論依據(jù)。