蘇彬,任璐,張玉,宋佳佳,王晨,王洪偉*,索化夷*

1(西南大學 食品科學學院,重慶,400715)2(川渝共建特色食品重慶市重點實驗室,重慶,400715)

腐乳在中國有著悠久的歷史,早在魏朝(公元386—534年)就有了對腐乳制作的記錄[1]。傳統(tǒng)腐乳以自然發(fā)酵的方式進行生產,主要包括制作豆腐、壓塊、切割、自然接種、前發(fā)酵、加輔料、后發(fā)酵等過程[2]。傳統(tǒng)發(fā)酵制曲過程參與多種微生物,腐乳風味濃郁,但同時由于涉及到大量的環(huán)境微生物,導致產品的品質和安全性不可控[3]。由于人工接種發(fā)酵安全性更高[4],品質更好控制,近年來已應用于酸筍[5]、泡菜[4]、水豆豉[6]等發(fā)酵產品。但是人工接種發(fā)酵食品的風味不及傳統(tǒng)發(fā)酵食品,為腐乳的工業(yè)化生產帶來了難題。腐乳感官評價體系構建和優(yōu)良發(fā)酵菌株的篩選是關鍵解決途徑。

毛霉型腐乳發(fā)酵過程涉及多種微生物,其主要制曲菌種為雅致放射毛霉。細菌群落主要為不動桿菌(Acinetobacte)、腸球菌(Enterococcus)和鏈球菌(Streptococcus)。對于真菌群落,腐乳毛坯以絲孢酵母(Trichosporon)和放射菌(Radiomycetes)為主,腌坯過程曲霉(Aspergillus)和絲孢酵母占主要優(yōu)勢[7]。雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)能分泌多種酶,將大豆中的蛋白質、脂質和碳水化合物水解成氨基酸和小分子,對品質形成有重要貢獻,是主要的腐乳發(fā)酵菌種[8]。目前,根據蛋白酶活力等指標,已篩選出雅致放射毛霉 MGC317[9]、雅致放射毛霉WL3.006[10]作為腐乳的發(fā)酵菌株,但是與傳統(tǒng)發(fā)酵腐乳相比,這些腐乳的品質如何研究較少。

腐乳應具有潤滑細膩的口感、咸鮮的滋味和濃厚的香氣[11]。氨基酸是一類具有味感的物質,可經代謝轉化后變成揮發(fā)性風味成分,游離氨基酸含量對腐乳的滋味有著重要影響[12]。頂空固相微萃取(head space solid-phase micro-extraction,HS-SPME)結合GC-MS進行分析被廣泛用于檢測腐乳中的揮發(fā)性化合物[8]。但僅用儀器分析,則無法預測人類感知到的整體風味,感官評價作為一種可靠的方法,被用來表征腐乳的風味特征[13]。偏最小二乘回歸(partial least-squares regression,PLSR)是將自變量和因變量分別進行線性組合分析,再將求得的數據進行關聯分析的統(tǒng)計學方法,在篩選關鍵風味物質上具有廣泛的應用。目前結合感官評價與儀器分析,PLSR闡明了4-甲氧基苯酚、苯酚、愈創(chuàng)木酚等酚類化合物是臘肉產生煙熏風味的關鍵物質[14]。PLSR剖析了正丁醇、苯乙酸乙酯、戊酸、己酸、己酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯是白酒的關鍵風味物質[15]。將儀器分析和感官定量描述分析相結合使我們可以更好地比較產品風味品質。

本研究根據菌株生長量、蛋白酶和脂肪酶活力,篩選出具有良好發(fā)酵性能的雅致放射毛霉CJ-6。其次將人工接種CJ-6發(fā)酵的腐乳與傳統(tǒng)發(fā)酵腐乳的感官特征和揮發(fā)性物質進行比較,確定人工接種發(fā)酵腐乳與傳統(tǒng)發(fā)酵腐乳具有相似的風味特征。然后利用GC-MS檢測腐乳中的揮發(fā)性物質。并結合香氣活性值(odor activity value,OAV)和PLSR探討雅致放射毛霉CJ-6對腐乳風味特征的影響及其機制。最后探究人工接種CJ-6腐乳發(fā)酵過程中硬度、彈性和游離氨基酸含量的變化,評估其口感和滋味。旨在為現代腐乳工業(yè)中發(fā)酵菌株的選擇、生產工藝和風味的改進提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株:所用菌株皆為雅致放射毛霉,其中RY-1、RY-2和RY-3購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC),菌株編號分別為CICC 40701、CICC 41043、CICC 41355。CY-4、CY-5和CJ-6是從市售腐乳中分離所得。并且CJ-6中不存在與真菌毒素合成相關的PKS 及 PKS-NRPS 混合代謝合成的相關基因及代謝途徑。

4種傳統(tǒng)發(fā)酵腐乳S1、S2、S3、S4,市售;S5為人工接種CJ-6發(fā)酵腐乳。

試劑:鄰二氯苯標準品、福林酚,北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2F超凈工作臺,蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;GCMS-QP2010氣相色譜質譜聯用儀,日本島津公司;DB5-MS氣相毛細管柱,美國Agilent公司;50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭,美國Supelco公司;CT-3質構儀,美國Brookfield公司;L-8900011001全自動氨基酸分析儀,日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株生長量的測定

參考陳菽等[16]的方法,略作修改。取2 mL 5×106個/mL孢子懸浮液加入250 mL 錐形瓶中,180 r/min振蕩培養(yǎng),每隔12 h取發(fā)酵液,用已知重量的濾紙過濾,水洗2次后一起于105 ℃的烘箱烘至恒重,稱重,計算可得菌株生長量。

1.3.2 菌株酶活力的測定

粗酶液的制備:準備5 g樣品,加入15 mL緩沖液,高速勻漿機打碎后置于40 ℃水浴鍋中60 min,定容至100 mL,紗布過濾后濾液4 000 r/min離心10 min,上清液為待測酶液。

福林酚法[17]測定蛋白酶活力,將40 ℃下,1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸,定義為1個蛋白酶活力單位(U/g)。

PVA-橄欖油乳化液水解滴定法[17]測定脂肪酶活力,在40 ℃下,1 min水解底物產生1 μmol脂肪酸定義為1個脂肪酶活力單位(U/g)。

1.3.3 腐乳的制作

參考CHOU等[18]的方法,略作修改。豆腐切成2.5 cm×2 cm×2.5 cm大小,按10%(體積分數)的接種量接種雅致放射毛霉CJ-6孢子懸浮液(5×106個/mL),進行前發(fā)酵;搓毛后,加入10%(質量分數,下同)食鹽,在25 ℃下腌制2 d;然后加入10%的鹽水沒過樣品,在同樣的條件下腌制3 d;再用10%的鹽水沖洗腌制好的豆腐2～3次,瀝干水分;裝罐,加入輔料[10%的鹽和12%(體積分數)的白酒],封罐,25 ℃發(fā)酵。

1.3.4 感官評價

參考周柬等[19]的方法進行感官評價,略作修改。感官評價小組經過120 h感官培訓,參加過豆豉[19]、臘肉[14]、酸奶[20]等感官評價實驗。參考CHEN等[13]的方法確定感官描述詞,將腐乳感官描述詞、參比樣及3位隨機數字編碼的腐乳樣品呈遞給感官評價人員。感官評價人員以15點尺度對樣品進行評價,增量為0.5,其中0表示“無”,15表示“極高”。試驗數據使用云智能感官評價系統(tǒng)https://www.cloudsensorylab.com收集。

1.3.5 揮發(fā)性物質測定[11]

樣品準備:稱取腐乳樣品3 g加入20 mL頂空進樣瓶中,添加3 μL 內標(100 μg/mL的鄰二氯苯溶液)。用聚四氟乙烯隔墊密封。60 ℃下保溫平衡10 min后,插入DVB/CAR/PDMS萃取頭, 完全伸出萃取頭距液面上方0.5 cm處,在60 ℃下萃取40 min,萃取結束后在GC 進樣口(250 ℃)解析5 min。

色譜條件:DB5-MS毛細管柱(30.0 m×250 μm×0.25 μm);進樣口溫度為250 ℃;載氣為高純氦氣(≥99.999%);載氣流速為1.0 mL/min;不分流方式進樣;40 ℃保持5 min后以4 ℃/min升至130 ℃,保持1 min后以10 ℃/min升至220 ℃并保持5 min。

質譜條件:離子源230 ℃,接口250 ℃,電離方式為電子電離(EI)源;電子能量70 eV;質量掃描范圍30～500m/z。

根據NIST14數據庫檢索對化合物進行定性分析,根據內標法對化合物進行半定量分析的方法。含量按公式(1)計算:

(1)

式中:Ci,未知化合物含量,ng/g;Si,未知化合物峰面積;S,內標物峰面積;ρ,內標物濃度,μg/mL;V,內標物體積,μL;m,樣品質量,g。

1.3.6 OAV的計算

OAV按公式(2)計算:

(2)

式中:Ci,化合物的含量,ng/g;OTi,查詢所得的化合物的香氣閾值,ng/g。

1.3.7 質構特性測定

質構特性的測定參考蔣麗婷等[21]的方法,略作修改。取白坯、毛坯、鹽坯、發(fā)酵10 d、發(fā)酵20 d、發(fā)酵40 d和成品(發(fā)酵60 d)樣品,采用質地剖面分析(texture profile analysis,TPA)模式,利用質構儀檢測探頭二次下壓測定硬度和彈性。

測定參數:探頭型號TA4/1000,測前探頭下壓速度1.5 mm/s,測試速度1.0 mm/s,測厚探頭回程速度1.5 mm/s,壓縮比例30%,觸發(fā)力2 g。

1.3.8 游離氨基酸測定

參考索化夷等[22]的方法測定。準確取白坯、毛坯、鹽坯、發(fā)酵10 d、發(fā)酵20 d、發(fā)酵40 d和成品(發(fā)酵60 d)的樣品100 mg,加入9 mL 4 g/100 mL磺基水楊酸溶液振蕩搖勻,于4 ℃冰箱靜置 24 h,16 000 r/min 離心5 min。上清液過膜(0.45 μm),用全自動氨基酸分析儀測定。

1.3.9 數據分析

使用Origin 2018軟件繪制雷達圖,使用XLSTAT 2019.2.2進行主成分分析(principal component analysis,PCA)、層次聚類分析法(agglomerative hierarchical clustering, AHC)、PSLR分析。

2 結果與分析

2.1 六株菌發(fā)酵性能比較

2.1.1 菌株生長量

在工業(yè)生產中,使用生長能力強的菌株作為發(fā)酵劑可以縮短發(fā)酵周期、提高效率。菌株生長量如圖1-a所示。CJ-6和RY-1在0～36 h生長速度高于其他4株毛霉,且在36 h達到最大生長量,分別為(0.455±0.040)、(0.416±0.043) g,CJ-6生長速度最快。

a-菌株生長量;b-菌株蛋白酶活力;c-菌株脂肪酶活力

2.1.2 菌株蛋白酶活力

在腐乳發(fā)酵過程中,大豆中蛋白質的水解程度對腐乳風味、口感和質地有著重要影響[9]。菌株蛋白酶活力如圖1-b所示。酶合成在0～48 h迅速增加,在達到最大活性后逐漸減少。在CJ-6中觀察到蛋白酶活力增長最快且有最高的酶活力(310.564±5.383)U/g。童佳[23]認為蛋白酶是醬油風味形成的關鍵酶,能將大豆中的蛋白質降解為氨基酸、多肽等[24],對風味及滋味有著重要作用。陳怡等[25]將蛋白酶活力作為選擇瀏陽豆豉發(fā)酵菌株的重要指標。選擇蛋白酶活力高的菌株,對于提高發(fā)酵豆制品的風味質量具有重要意義。

2.1.3 菌株脂肪酶活力

在腐乳發(fā)酵過程中,脂肪酶將脂肪分解為甘油和脂肪酸,然后進一步轉化為有機酸,這些有機酸與醇反應形成的酯,對腐乳的風味形成起著重要作用[24]。菌株脂肪酶活力如圖1-c所示。大多數菌株的脂肪酶產量在0～60 h迅速增加,然后逐漸下降。CJ-6的脂肪酶活力最強,最高酶活力為(15.970±0.342)U/g。CJ-6在6株雅致放射毛霉中,生長旺盛,有最高的蛋白酶和脂肪酶活力,表明CJ-6具有作為腐乳發(fā)酵菌株的潛力。

2.2 人工接種CJ-6對腐乳風味的影響

2.2.1 感官評價

參考CHEN等[13]的方法,略作修改,增加了鮮香、辣椒香、甜香、酸香和刺激5個描述詞,如表1所示。對5種腐乳進行定量描述性分析(quantitative descriptive analysis, QDA),結果如圖2所示,5種腐乳在酒香、辣椒、霉味屬性上有顯著差異(P<0.05)。

表1 腐乳香氣特征、定義及參比樣

圖2 腐乳感官結果雷達圖

對QDA結果進行PCA,如圖3所示。PC1和PC2解釋了總體變異的79.32%(50.96% PC1;28.35% PC2)。S1和S5與發(fā)酵豆味、油香、霉味、咸香、刺激關聯緊密。通過AHC分析(圖4),腐乳分為3類,第一類包括S1和S5,它們具有最低的相似性指數,表明它們具有較高的相似性。第二類包含S3和S4。第三類僅包含S2,其總體差異指數最高。PCA和AHC結果一致,說明S1和S5具有相似性。

圖3 腐乳感官屬性的PCA圖

圖4 腐乳樣品的AHC圖

2.2.2 揮發(fā)性物質分析

2.2.2.1 揮發(fā)性物質含量差異

使用HS-SPME-GC-MS在5種腐乳中檢測到了70種化合物,如電子增強出版附表1所示(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033651)。主要包括10種醇類,28種酯類,6種醛類,5種吡嗪,5種萜烯類和 5種酮類。在S1、S2、S3、S4和S5中分別鑒定出了42、32、34、25和29種化合物。OAV>1的化合物被認為對整體風味有貢獻[8],且揮發(fā)性物質的OAV值越大說明該化合物對整體香氣的貢獻越大。在70個化合物中,OAV>1的揮發(fā)性化合物有1-辛烯-3-醇、苯酚、苯乙醛、2-乙基-3,6-二甲基吡嗪、苯乙醇、辛酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、2-正戊基呋喃、己酸乙酯、丁酸乙酯、丁香酚、芳樟醇和2-甲基丁酸乙酯共13種,如附表1所示。S1、S2、S3、S4、S5分別占6、6、8、5、7種。

辛酸乙酯和己酸乙酯是4種傳統(tǒng)腐乳中OAV>1的揮發(fā)性物質,分別具有類似白蘭地的香氣和水果香氣[26],同時辛酸乙酯也在S5中檢出。丁香酚和2-甲基丁酸乙酯分別是S3獨有的揮發(fā)性物質,芳樟醇是S1獨有的揮發(fā)性物質。不同腐乳揮發(fā)性物質的不同可能與發(fā)酵菌株、生產環(huán)境有關。除此之外,1-辛烯-3-醇和苯乙醛是S1和S5的OAV>1的揮發(fā)性物質。1-辛烯-3-醇是豆?jié){的關鍵風味物質,呈蘑菇味和霉味,或許是S1和S5霉味突出的重要因素。苯乙醛是一種脂肪醛,具有花香、甜味和生青味,廣泛存在于發(fā)酵大豆產品中[27],對S1和S5的風味有重要貢獻。3-苯丙酸乙酯、苯酚和苯乙醇是腐乳中常見的風味物質[26],對S2、S3和S5的風味形成有著較大影響。同時,2-乙基-6-甲基吡嗪具有堅果味[28],在S5中含量最高。丁酸乙酯和2-正戊基呋喃分別具有強烈的蘋果香味[8]和綠豆、黃油味,在與其他風味物質的共同作用下對腐乳的香氣帶來積極影響。

2.2.2.2 PLSR分析

以5種腐乳中OAV>1的13種揮發(fā)性物質為自變量,以QDA法得到感官強度為因變量,進行PLSR分析,如圖5所示,前兩個主成分解釋了70.56%的交叉驗證方程。S1和S5相距較近,與發(fā)酵豆味、刺激、油香、咸香等感官屬性聯系密切,并與苯乙醇、辛酸乙酯、苯酚、3-苯丙酸乙酯、苯乙醛等揮發(fā)性物質相關。S3具有甜香、酸香和酒香屬性,與2-甲基丁酸乙酯和丁香酚高度相關。

圖5 腐乳的感官屬性、揮發(fā)性物質的PLSR圖

2.3 人工接種CJ-6腐乳發(fā)酵過程中質構特性和游離氨基酸含量的變化

2.3.1 人工接種CJ-6腐乳發(fā)酵過程中質構特性

腐乳發(fā)酵過程中硬度的變化,見電子增強出版附圖1-a(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033651)?？傮w來說,隨著發(fā)酵時間的延長,硬度逐漸下降至(142±13.65)g。在毛坯階段的硬度略有升高,這可能是由于在毛坯階段,菌絲大量生長,形成致密的菌絲包裹住豆腐。隨著發(fā)酵時間的延長,湯汁逐漸滲透到坯體中,同時微生物產生的酶將豆腐中的蛋白質分解,蛋白質空間結構被破壞,使得坯體變軟,硬度逐漸下降[11]。

腐乳發(fā)酵過程中彈性的變化,見電子增強出版附圖1-b(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033651)。隨著發(fā)酵時間的增加,S5的彈性逐漸降低至(3.56±0.17)mm。發(fā)酵40 d后,樣品的彈性逐漸趨于穩(wěn)定。這可能是因為在多種酶的作用下,蛋白質的凝膠結構被破壞,使得坯體的彈性逐漸下降,當酶解反應基本完成,坯體的彈性趨于穩(wěn)定[11]。

隨著發(fā)酵的進行,各種微生物分解蛋白質、淀粉等物質,越到后期,硬度和彈性越小,但這也使腐乳的質地更加潤滑,口感更佳細膩。

2.3.2 人工接種CJ-6腐乳發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的變化

游離氨基酸對腐乳滋味的形成具有重要作用[22]。在腐乳發(fā)酵過程中,共檢測出17種氨基酸,見電子增強出版附表2(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.033651)。經過發(fā)酵后,白坯中的氨基酸總量明顯提高,由最初的2.551 mg/g增加到15.141 mg/g,增加了約5.94倍;同時增加了賴氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸和亮氨酸4種必需氨基酸,這表明CJ-6發(fā)酵可以改善豆腐滋味和營養(yǎng)。根據張建萍等[29]對滋味的描述,將氨基酸分為甜味氨基酸(蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸)、苦味氨基酸(纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸)、鮮味氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)和無味氨基酸(半胱氨酸、賴氨酸、脯氨酸)。在腐乳成品中,谷氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸含量占主導,占總量的51.16%。其中谷氨酸和亮氨酸的含量最大,是大豆發(fā)酵食品中主要游離氨基酸[22]。S5成品中甜味、苦味和鮮味氨基酸分別占游離氨基酸總量的17.36%、38.21%、22.37%,但在腐乳中,并沒有感覺到明顯的苦味,腐乳主要表現為鮮味和咸味。咸味可能與食鹽較高的添加量有關。S5游離氨基酸中谷氨酸含量高達2.907 mg/g,同時谷氨酸在酸性條件下可以與鈉離子結合形成鮮味濃郁的谷氨酸鈉,鮮味特征得到加強,從而掩蓋了苦味特征[22]。各種游離氨基酸相互作用,賦予腐乳獨特的滋味。

3 結論

雅致放射毛霉CJ-6有作為腐乳發(fā)酵菌株的潛力。在6株雅致放射毛霉中,CJ-6具有最快的生長速度,在36 h達到最大生長量(0.455±0.040)g,比CY-5的最大生長量高(0.153±0.029)g;CJ-6的蛋白酶活力在60 h達到最強,為(310.564±5.383)U/g,比RY-1、RY-2、RY-3、CY-4和CY-5的最大蛋白酶活力分別高出(14.864±0.971)、(32.154±3.403)、(109.214±2.385)、(53.385±6.753)、(108.3±1.329)U/g;CJ-6的脂肪酶活力在72 h達到最強,為(15.970±0.342) U/g,比RY-1、RY-2、RY-3、CY-4和CY-5的最大脂肪酶活力分別高出(8.800±0.130)、(3.390±0.130)、(2.340±0.116)、(2.300±0.003)、(2.370±0.102)U/g。人工接種CJ-6可以縮短發(fā)酵周期、提高效率并保證腐乳的風味。

人工接種發(fā)酵腐乳達到與傳統(tǒng)發(fā)酵腐乳相似感官特征,13種化合物對腐乳風味產生重要影響。對感官評價結果進行PCA和AHC分析,發(fā)現S5與傳統(tǒng)發(fā)酵腐乳S1的感官特征相似,發(fā)酵豆味、油香、霉味、咸香、刺激等感官屬性突出。利用GC-MS在5種腐乳中共檢測出了70種化合物,其中1-辛烯-3-醇、苯酚、苯乙醛、2-乙基-3,6-二甲基吡嗪、苯乙醇、辛酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、2-正戊基呋喃、己酸乙酯、丁酸乙酯、丁香酚、芳樟醇和2-甲基丁酸乙酯共13種化合物的OAV>1,對腐乳風味的形成起著重要作用。PLSR分析表明苯乙醇、辛酸乙酯、苯酚、3-苯丙酸乙酯、苯乙醛是CJ-6產生的關鍵風味物質。

綜上所述,雅致放射毛霉CJ-6具有良好的生產特性,制得的人工接種發(fā)酵腐乳與傳統(tǒng)發(fā)酵腐乳風味相似,表明雅致放射毛霉CJ-6發(fā)酵腐乳有較好的風味。同時人工接種CJ-6可以增加豆腐白坯的營養(yǎng),并保證腐乳潤滑和細膩的口感以及良好的滋味,該菌株可作為腐乳發(fā)酵劑,應用于腐乳工業(yè)化生產。