黃 誠，陸碧玉，代元平，黃李霜，楊金鈴，黃麗華，陳大宇，蔡 稔，嚴提珍（柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科/柳州市出生缺陷預(yù)防與控制重點實驗室，柳州市生殖醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣西柳州 545001）

精子DNA 是男性將遺傳物質(zhì)傳遞給子代的載體，許多研究表明精子DNA 損傷會影響自然受精、胚胎發(fā)育以及輔助生殖的妊娠結(jié)局，并與男性不孕不育和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)密切相關(guān)。當(dāng)前業(yè)界廣泛認為精子DNA 碎片率（DNA fragmentation index，DFI）可以較好反映整體精子DNA 受損程度，現(xiàn)已列為衡量精子質(zhì)量的一項獨立指標[1-3]。相對于常規(guī)的活力和生化檢測，DFI 更側(cè)重于反映精子遺傳物質(zhì)的健康度。如今用于檢測精子DNA 完整性的方法有很多，其中應(yīng)用最普遍的是精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析法（sperm chromatin structure analysis，SCSA），并且該方法可以在流式細胞儀上運用。流式細胞術(shù)（flow cytomtry，F(xiàn)CM）是分析分類單個細胞組群最為高效準確的技術(shù)，用流式細胞儀檢測精子DFI可以在短時間內(nèi)檢測大量精子，將不同熒光信號的精子進行分類即可算出DFI，結(jié)果更為客觀準確[4]。但在整個實驗流程中依然存在可能會影響檢測結(jié)果的因素，當(dāng)精液樣本留存時間過長可能出現(xiàn)精子核物質(zhì)降解、微生物滋生、精子形態(tài)改變甚至破裂等情況[5-6]。所以在實際工作中精子DFI 檢測的樣本時效不容忽視，本實驗將研究樣本新鮮度對精子DFI 檢測結(jié)果的影響，探討在實際工作中該如何保存樣本。

1 材料與方法

1.1 研究對象 隨機選擇2020年12月期間柳州市婦幼保健院生殖中心男科門診日常送檢的精液樣本。納入標準：①通過精液常規(guī)結(jié)果排除無精少精癥患者；②排除樣本液化不全患者。最終選取38份樣本（樣本提供者年齡26～52 歲）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準（文件號：科研-2018-004），患者知情同意。

1.2 儀器與試劑 本實驗使用試劑為深圳華康生產(chǎn)的吖啶橙染色液，樣本檢測使用美國BD FACSVia流式細胞儀。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組：每個樣本充分液化后混勻分成4等份，分為A，B，C，D 共4 組：A 組當(dāng)即檢測，然后放置室溫保存，每2h 再測1 次，共測得A1，A2，A3 三組數(shù)據(jù)；B 組放置2～8℃冰箱保存，每24h 檢測1 次，連測3 天,共獲得B1，B2，B3三組數(shù)據(jù)；C 組放-20℃冰箱冷凍，每周解凍測1 次，測完放回冰箱復(fù)凍，連測4 周，共獲得C1，C2，C3，C4 四組數(shù)據(jù)；D 組放置-20℃冰箱冷凍，30天后解凍檢測1 次，獲得D1 組數(shù)據(jù)。

1.3.2 檢測方法：按SCSA 法對精子細胞進行染色，每個樣本采用中等流速計數(shù)10 000 個精子。正常精子由于DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)完整其熒光信號以530nm為主，而DNA 異常精子由于存在單鏈片段而攜帶640nm 熒光信號會偏離正常群體，最后統(tǒng)計異常精子占總精子的比例即為精子DFI。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件分析，將新鮮樣本當(dāng)即檢測組（A1 組）DFI 結(jié)果與其他組的檢測結(jié)果分別進行配對t檢驗，驗證樣本在不同條件保存后的結(jié)果變化，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢測組與不同保存方式組DFI 水平比較 結(jié)果見表1。將新鮮樣本當(dāng)即檢測組(A1 組)作為對照組，與其他組DFI 檢測結(jié)果進行兩兩比較，A1 組DFI 與A2 組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與A3 組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對比結(jié)果顯示新鮮樣本在室溫保存下2h 內(nèi)檢測結(jié)果比較穩(wěn)定，放置4h 后檢測結(jié)果升高，A1 組與B1，B2，B3 組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）；對比結(jié)果顯示2～8℃不能保持精子DNA 結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。A1 組與C1，C2，C3，C4 和D1 組的組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），對比結(jié)果顯示-20℃冰凍可使樣本穩(wěn)定長達一個月，且期間樣本經(jīng)過反復(fù)凍融檢測結(jié)果也無明顯波動。

3 討論

精子是以極小的體積將遺傳物質(zhì)和有限能量高度整合的生殖細胞。精核表面白的魚精蛋白（protamine，HP）可形成大量二硫鍵使精子染色體高度壓縮，從而在一定程度上保護DNA 免受傷害，使精子對各種外界環(huán)境因素有較強的抵抗力[7-8]。精子離體后隨著時間的推移，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)會由于表面蛋白的降解發(fā)生松散，對于本實驗的DNA 完整性檢測會造成一定干擾[9]。此外流式細胞儀主要用于檢測單細胞懸液，要求精子形態(tài)必須保持完好，若樣本不新鮮精子細胞可能發(fā)生腫脹、破裂或者微生物滋生等也會影響儀器的信號收集[10-11]。

在實際工作中，實驗室不一定能做到在收到精液樣本就當(dāng)即檢測?，F(xiàn)實情況往往是患者一次取精要做多種檢測項目，精液常規(guī)項目需要優(yōu)先檢測，其他的生化、DFI，病原體等檢測可能會留存一段時間后再集中檢測。而有些機構(gòu)甚至是外送檢測。如果不對精液樣本進行妥善保存會對檢測結(jié)果有很大影響。通常保存細胞樣本需要用到-80℃冰柜或者液氮，還要配合凍干保護劑，這對實驗室場地設(shè)備和人員操作有較高要求[12]。細胞經(jīng)過-20℃冰凍會形成冰晶對內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生機械損傷，反復(fù)凍融后容易發(fā)生破裂[13]。然而精液由于其精漿蛋白膠體成分影響，直接放置-20℃冰凍再復(fù)融未見精子細胞有明顯變化[14]。本研究中用流式細胞儀檢測-20℃保存后的樣本依然可以收集到精子細胞，且DFI 檢測值與新鮮原液相差無異，說明精子胞體和DNA結(jié)構(gòu)沒有因為凍融而明顯破壞。與一些類似研究情況相符[15]。所以如果只為保障精子DFI 檢測準確度，用一般冰箱-20℃冷凍即可有效保存精液樣本。同時也可考慮分裝個別樣本長期冰凍再分次檢測來作為該項目的日常質(zhì)控對照品。若條件允許，還可以進一步研究-80℃冰柜直接冷凍是否能更長時間保持樣本穩(wěn)定。

綜上所述，為保障精子DFI 檢測結(jié)果的可靠性，精液樣本應(yīng)在采集后2h 內(nèi)完成檢測，樣本在室溫或2～8℃放置時間過長會使檢測結(jié)果偏高，若需較長時間保存建議及時將新鮮樣本放-20℃冰凍保存，時長可達一個月。