閆松 劉玥 景麗偉 王婧涵 劉軍 張超

1華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 河北唐山 063000 ;2首都醫(yī)科大學(xué)護(hù)理學(xué)院;3華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院

幽門(mén)螺桿菌(helicobacter pylori,HP)是一種存在于胃幽門(mén)、依附定植于胃上皮細(xì)胞的革蘭氏陰性菌[1],按毒力與致病性主要分為兩型:Ⅰ型HP具有毒力基因,通過(guò)注射器樣結(jié)構(gòu)將產(chǎn)生的毒力蛋白注入宿主細(xì)胞,破壞宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu),易引起胃癌[2];Ⅱ型HP菌株由于不能產(chǎn)生細(xì)胞毒素,故毒力低,感染后一般僅引起慢性淺表性胃炎[3]。此外,HP感染呈現(xiàn)明顯的家庭聚集性,其主要通過(guò)口-口、糞-口傳播,也存在通過(guò)食物和水傳播的可能[4]。因此,選擇合理的檢測(cè)樣本與診斷方法以準(zhǔn)確診斷HP感染對(duì)預(yù)防交叉感染及胃癌發(fā)生有重要意義。檢測(cè)HP感染有多種方法:侵入性方法可直接在內(nèi)鏡下觀察胃黏膜情況,也可通過(guò)黏膜活檢進(jìn)行快速尿素酶試驗(yàn)、組織病理檢查和細(xì)菌培養(yǎng);非侵入性方法有尿素呼氣試驗(yàn)、糞便抗原和血清學(xué)抗體檢測(cè)等,但均受樣本種類、菌量、細(xì)菌活性限制。不同檢測(cè)方法間各具優(yōu)劣勢(shì),尤其是診斷效能良莠不齊。近年來(lái),隨著分子生物技術(shù)的大幅進(jìn)步,聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)等基于生物分子檢測(cè)HP感染方法已逐漸成為更為精準(zhǔn)可靠的檢測(cè)手段。

PCR是最主要和常用的分子生物學(xué)方法[5]。本文以其為檢測(cè)方法進(jìn)行綜述。PCR可以檢測(cè)樣本中的核酸,在區(qū)分菌株分型、藥敏試驗(yàn)等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì),明顯提高了HP診斷的敏感性和特異性[6]。同時(shí),PCR可檢測(cè)的感染樣本種類和范疇也不斷擴(kuò)增,目前已由人體樣本(主要包括侵入性的胃黏膜活檢組織、胃液;非侵入性的唾液、牙菌斑、糞便等)逐漸拓展至周圍環(huán)境樣本(飲用水、食物等),擴(kuò)大了PCR檢測(cè)樣本的多樣性[7]。PCR檢測(cè)在不同樣本中診斷效能參差不齊,取樣用途也有所不同。本文對(duì)PCR檢測(cè)不同樣本中HP的取樣方法、診斷效能及優(yōu)劣勢(shì)進(jìn)行綜述。

1 侵入性樣本

侵入性HP檢測(cè)的樣本主要包括:胃黏膜、胃液。因基于胃黏膜活檢的HP檢測(cè)具有更高的靈敏度、特異度,實(shí)驗(yàn)室研究通常將胃黏膜樣本視為診斷HP的參考標(biāo)準(zhǔn)。準(zhǔn)確診斷胃內(nèi)HP,對(duì)消化道疾病的發(fā)生及進(jìn)展具有重要意義。

1.1胃黏膜

1.1.1胃黏膜的樣本檢測(cè) 胃黏膜是HP侵入性檢測(cè)方法中最常用的標(biāo)本選擇[8]。HP依靠尿素酶系統(tǒng)降低胃酸,在胃內(nèi)極低的pH環(huán)境中定植[9]。取樣需在患者接受抗生素治療之前,通過(guò)內(nèi)鏡,于胃竇和胃體采集2～4塊樣本,固定后分離、提取DNA[10]。Saez等[11]通過(guò)研究158名消化系統(tǒng)疾病患者,得出PCR檢測(cè)消化道出血HP感染的靈敏度為68.4%,非消化道出血HP感染的靈敏度為91.5%?？梢?jiàn),消化道出血患者HP感染可能無(wú)法通過(guò)傳統(tǒng)方法如組織學(xué)或快速尿素酶試驗(yàn)正確診斷,這些患者可以從分子生物學(xué)診斷中獲益。

1.1.2胃黏膜樣本的優(yōu)勢(shì)與劣勢(shì) 通過(guò)PCR法檢查胃黏膜樣本,具有如下優(yōu)點(diǎn):(1)不受HP細(xì)菌數(shù)量影響:PCR具有較高的靈敏度,少量的HP就可被檢測(cè),為判斷是否根除徹底提供依據(jù)[8];(2)不受HP形態(tài)學(xué)影響:PCR可基于分子生物學(xué)特征,特異性的將HP與其他形態(tài)相近菌種(如空腸彎曲菌、海曼氏螺桿菌)相區(qū)分,診斷能力優(yōu)于組織病理學(xué)等[12];(3)不受HP生存條件影響:當(dāng)出血、飲酒、藥物等對(duì)培養(yǎng)成功率有影響時(shí),PCR對(duì)胃黏膜的檢測(cè)取樣未明顯受生長(zhǎng)環(huán)境影響,診斷效率明顯優(yōu)于HP培養(yǎng)[13];(4)可同時(shí)明確細(xì)菌分型及耐藥情況:可定量測(cè)定及提供藥敏、毒力等信息,有助于制定合適的個(gè)體化治療方案[6]。

基于胃黏膜樣本的PCR檢測(cè),也可能受樣本組織獲取過(guò)程及樣本質(zhì)量的影響。主要體現(xiàn)在如下方面:(1)取樣過(guò)程受多方因素影響:組織樣本多是醫(yī)生通過(guò)內(nèi)鏡進(jìn)行獲取,樣本質(zhì)量受醫(yī)生內(nèi)鏡操作活檢技術(shù)水平、患者的內(nèi)鏡耐受性及依從性、內(nèi)鏡及活檢鉗器械質(zhì)量等的影響[12]。Bakhtiari等[14]通過(guò)77例研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),將PCR視為金標(biāo)準(zhǔn)時(shí),環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)到細(xì)菌而PCR未檢測(cè)到,此假陽(yáng)性結(jié)果系由于活檢中細(xì)菌數(shù)量極少所致;(2)樣本質(zhì)量亦受多維度限制:咬檢組織部位、大小、深度及是否擠壓、有效保存固定等[15]。因此,更精準(zhǔn)的無(wú)創(chuàng)性診斷方法有待開(kāi)發(fā),樣本固定試劑及新的分子生物學(xué)技術(shù)有待被研究。

1.2胃液

1.2.1胃液的樣本檢測(cè) 胃液也是侵入性樣本的一種。胃黏膜的不斷更新脫落,使得HP存在于胃液中[16]。在內(nèi)窺鏡下將胃液吸取收集到無(wú)菌容器后,儲(chǔ)存在4℃的冰箱中行PCR檢測(cè)[17]。Hsieh等[17]針對(duì)根除后復(fù)查患者,進(jìn)行了胃液PCR與細(xì)菌培養(yǎng)的對(duì)比研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃液PCR的診斷準(zhǔn)確性高于細(xì)菌培養(yǎng)(96.7% vs 91.3%,P<0.0001),可見(jiàn),對(duì)于根除后復(fù)查的患者采用PCR檢測(cè)可減少細(xì)菌培養(yǎng)假陰性造成的漏診。

1.2.2胃液樣本的優(yōu)勢(shì)與劣勢(shì) 胃液樣本的PCR檢測(cè),具有如下優(yōu)點(diǎn):(1)不受胃內(nèi)HP分布不均的影響,常規(guī)方法如組織病理學(xué)、快速尿素酶試驗(yàn)在體液中無(wú)法檢出HP,而PCR能夠在胃液中檢測(cè)出HP,彌補(bǔ)了胃黏膜活檢漏檢的可能[18];(2)不需要嚴(yán)苛的設(shè)備條件要求:取黏膜培養(yǎng)成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、條件苛刻[19],取胃液不需要活菌和培養(yǎng)的關(guān)鍵運(yùn)輸條件[17];(3)適合部分特殊人群:如ITP或存在其他有出血傾向而不適合胃黏膜活檢的患者[20],可選擇胃鏡檢查時(shí)留取胃液檢測(cè)HP。胃液樣本拓寬了HP的檢測(cè)范圍。

胃液檢測(cè)同樣存在劣勢(shì):經(jīng)胃液樣本檢測(cè)HP,受其含菌量水平影響較大,有一定的局限性。同時(shí),因樣本中混有脫落的胃黏膜上皮、外泌體及其他分子,可能對(duì)其檢測(cè)的準(zhǔn)確性造成干擾[15]。李東丹等[21]對(duì)兒童胃液進(jìn)行PCR檢測(cè)HP,結(jié)果顯示胃液檢測(cè)的靈敏度為100%,特異度為0,表明其存在一部分假陽(yáng)性結(jié)果。因此,胃液檢測(cè)仍不屬于主流檢測(cè)方法,僅作為一種輔助手段,更好的技術(shù)有待被開(kāi)發(fā)。

2 非侵入性樣本

分子生物學(xué)HP檢測(cè)的非侵入性樣本主要包括:唾液、牙菌斑及糞便等。因其具有易于收集、無(wú)創(chuàng)性特點(diǎn),患者接受度高,更適用于兒童和老人[22]。有研究表明口腔感染HP可引起干槽癥、口腔癌等,糞便HP雖不會(huì)引起嚴(yán)重的消化道內(nèi)外疾病,但是是糞-口傳播的重要緣由[23]。因此,有效檢測(cè)并根除具有重要意義。

2.1唾液

2.1.1唾液的樣本檢測(cè) 口腔感染者的HP帶菌唾液可能是造成上消化道感染及細(xì)菌糞-口傳播的重要媒介之一[23]。食管反流或嘔吐可造成HP隨胃液到達(dá)口腔,故提取這類患者唾液樣本可能檢測(cè)出HP[24]。取樣方法為在采集唾液樣本前1h不允許清潔牙齒或進(jìn)食,用無(wú)菌棉卷收集大約2～3mL未受刺激的唾液于試管中[24]。Sayed等[25]研究表明唾液PCR檢測(cè)的敏感性為85%,特異性為70%,高于傳統(tǒng)方法,該方法在檢測(cè)HP口腔感染及傳播風(fēng)險(xiǎn)方面具有重要價(jià)值。

2.1.2唾液樣本的優(yōu)勢(shì)及劣勢(shì) 通過(guò)PCR法檢查唾液樣本,具有如下優(yōu)勢(shì):(1)患者接受度高:唾液取樣簡(jiǎn)便、無(wú)痛、無(wú)損傷,為無(wú)法行胃鏡取樣的老人、兒童及孕婦等提供了一種新方式[26];(2)藥物應(yīng)用影響較小:基因檢測(cè)不受臨床治療用藥的干擾,檢測(cè)結(jié)果不受近期是否服用過(guò)抗生素、質(zhì)子泵抑制劑等藥物的影響[25]。

其劣勢(shì)也較為明顯,因口腔環(huán)境復(fù)雜,大量的微生物可代謝產(chǎn)生多種物質(zhì),當(dāng)唾液與口腔接觸時(shí),唾液中的成分可能會(huì)發(fā)生改變[27],因此大量的混雜物質(zhì)可能影響唾液HP檢測(cè)。Bonamico等[22]研究表明,基于唾液樣本中尋找細(xì)菌DNA,特異性高(99.1%),但是敏感性差(22.2%)。因此,廣泛使用唾液作為檢測(cè)樣本,尚有許多技術(shù)上的障礙需要克服。

2.2牙菌斑

2.2.1牙菌斑的樣本檢測(cè) 牙菌斑樣本的獲取是一種常見(jiàn)的非侵入手段。牙菌斑內(nèi)細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)酸使牙周袋內(nèi)pH較低且乏氧,適宜HP的生長(zhǎng),因此被認(rèn)為是口腔內(nèi)HP最可能生存的地方[28]?？谇粰z查時(shí),通過(guò)無(wú)菌刮匙在牙周袋附近收集菌斑[29]。Ismail等[30]通過(guò)49例患者研究發(fā)現(xiàn)PCR在牙菌斑中HP檢出率為40.8%,高于胃黏膜組織病理學(xué)(36.7%),證實(shí)了牙菌斑檢測(cè)的可行性。

2.2.2牙菌斑樣本的優(yōu)勢(shì)與劣勢(shì) 檢測(cè)牙菌斑樣本,具有如下優(yōu)點(diǎn):(1)證實(shí)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn):通過(guò)抗HP治療后胃黏膜中細(xì)菌被根除,但可在牙菌斑中檢出,很大程度上證實(shí)口腔中的HP與消化道疾病的復(fù)發(fā)存在密切關(guān)系[31]。根治胃內(nèi)HP的同時(shí),治療口腔內(nèi)HP有利于減少胃內(nèi)HP相關(guān)疾病復(fù)發(fā);(2)受唾液及藥物等化學(xué)影響小:Verónica等[32]研究171名兒童的唾液和牙菌斑樣本表明,同時(shí)留取唾液和牙菌斑樣本,唾液HP陰性者牙菌斑樣本可能陽(yáng)性,且HP可在牙菌斑中長(zhǎng)期生存,陽(yáng)性率較高。

其劣勢(shì)與唾液樣本類似,同時(shí)處于口腔復(fù)雜的微生物環(huán)境中,口腔中的成分發(fā)生改變,同樣會(huì)影響牙菌斑的檢測(cè)結(jié)果,造成漏診[29]。廣泛使用牙菌斑作為診斷樣本,同樣有許多技術(shù)上的障礙需要克服。舌背、牙齒表面生物膜也應(yīng)作為樣本選擇?？谇籋P感染者應(yīng)密切注意刷牙方式及牙膏選擇,定期清潔牙結(jié)石十分必要[33]。

2.3糞便

2.3.1糞便的樣本檢測(cè) 糞便樣本可用于檢測(cè)HP感染已達(dá)成共識(shí)[34]。有證據(jù)表明胃黏膜上皮約3d完全更新一次,感染者會(huì)在糞便中排出HP[35]。取新鮮糞便無(wú)需停藥,收集的糞便樣本在使用前儲(chǔ)存在-20℃環(huán)境中[34]。Fatemeh等[37]研究顯示糞便23SrRNA基因的PCR檢測(cè)是檢測(cè)HP感染最有效的方法,糞便樣本PCR檢測(cè)HP的靈敏度為71%,特異度為96%,診斷優(yōu)勢(shì)比為65.6?？梢?jiàn),PCR檢測(cè)糞便中的HP基因是一種很有前途的檢測(cè)方法[38]。

2.3.2糞便樣本的優(yōu)勢(shì)與劣勢(shì) 基于糞便樣本的分子生物學(xué)檢測(cè)有以下優(yōu)勢(shì):(1)取材安全無(wú)創(chuàng):糞便取樣不需要行胃鏡或抽血等侵入性操作,對(duì)于配合欠佳人員如兒童具有明顯優(yōu)勢(shì)[36];(2)優(yōu)于糞便培養(yǎng):因糞便中含大量微生物,培養(yǎng)并分離HP難度較大,陽(yáng)性率較低[39];(3)優(yōu)于糞便抗原檢測(cè):因糞便中HP抗原受HP根除藥物及消化道出血影響而發(fā)生分解,PCR檢測(cè)避免了抗原不穩(wěn)定,診斷效能優(yōu)于糞便抗原檢測(cè)[40]。

糞便樣本同樣存在如下不足:(1)受細(xì)菌濃度影響:徐華等[40]研究表明,當(dāng)HP相對(duì)豐度極低時(shí),會(huì)抑制PCR反應(yīng),影響糞便HP基因檢測(cè);(2)受取樣位置影響:糞便內(nèi)HP呈現(xiàn)斑片狀分布,因此隨機(jī)分布可能造成取樣部位假陰性結(jié)果[41];(3)受儲(chǔ)存條件影響:對(duì)于門(mén)診患者,不能及時(shí)將樣本送往醫(yī)院檢測(cè),樣本中HP可能在體外有氧環(huán)境中降解,會(huì)使診斷產(chǎn)生假性結(jié)果[42];(4)可檢測(cè)到基因碎片:PCR檢測(cè)出的HP的DNA可能為死亡細(xì)菌的基因碎片,此類死亡細(xì)胞沒(méi)有致病性,可出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果[14]。

3 環(huán)境樣本

現(xiàn)有已知HP的傳播途徑有口-口、糞-口傳播,其中糞-口傳播即是通過(guò)HP污染的環(huán)境媒介傳播。已有研究表明環(huán)境中存在HP分布,識(shí)別出被HP污染的水源或食物,對(duì)切斷傳播途徑尤為重要。

3.1環(huán)境樣本中HP分布情況 環(huán)境樣本的分子生物學(xué)檢測(cè)主要用于HP傳染源及傳染途徑的流行病學(xué)篩查[43]。有文獻(xiàn)報(bào)道,HP可在各種水生環(huán)境中被檢測(cè)出,包括飲用水、地表水、海水及廢水[44]。Monno等[45]研究表明,食用生的軟體動(dòng)物和貽貝與HP感染顯著相關(guān)(P=0.0108、0.0067)。可見(jiàn),HP可能存在于即食食品中,食用這類食品可能造成人類感染HP[46]。因此,水源和食物既是HP的存活場(chǎng)所,也是HP感染糞口傳播的媒介[47]。

3.2環(huán)境樣本檢測(cè)的意義 環(huán)境樣本檢測(cè)HP有以下好處:(1)切斷傳播途徑,通過(guò)環(huán)境檢測(cè),可以找到HP傳播鏈,以從源頭上預(yù)防HP感染[13]。(2)優(yōu)于細(xì)菌培養(yǎng),相較于水源的細(xì)菌培養(yǎng),PCR所需的條件要求更低[44]。(3)較高的靈敏度,低密度的細(xì)菌也可檢測(cè)出HP[48]。(4)可檢測(cè)環(huán)境中非可培養(yǎng)(viable but non-culturable,VBNC)狀態(tài)HP,目前這種變形后的球形HP已通過(guò)PCR技術(shù)于水體環(huán)境及生物媒介中檢測(cè)出來(lái);同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)HP可在生的食品中進(jìn)入VBNC狀態(tài)[4,49]。

及時(shí)發(fā)現(xiàn)HP污染源,對(duì)細(xì)菌傳播及HP感染的預(yù)防起到重要作用。通過(guò)對(duì)具有抗生素耐藥性的環(huán)境HP菌株進(jìn)行基因分型,并將其與臨床樣本進(jìn)行比對(duì),有助于明確傳播途徑并進(jìn)行環(huán)境凈化[43]。

4 總結(jié)與展望

HP感染是全球衛(wèi)生問(wèn)題,目前我國(guó)HP感染人口呈逐年上升趨勢(shì)。綜合多種樣本準(zhǔn)確、快速地檢出HP對(duì)相關(guān)疾病的早期預(yù)防、正確治療和復(fù)發(fā)預(yù)防具有重要的意義。通常認(rèn)為新鮮胃黏膜組織標(biāo)本為檢測(cè)HP的最佳樣本;唾液和牙菌斑是常用的口腔PCR檢測(cè)標(biāo)本;感染者體內(nèi)的HP會(huì)隨糞便排出,檢測(cè)糞便同樣可獲得細(xì)菌感染信息;環(huán)境樣本中HP的檢測(cè)是明確并切斷HP傳播途徑的有效手段。在陽(yáng)性率方面,侵入性樣本雖高于非侵入性樣本,但取材有創(chuàng),患者接受度較低;在用途方面,環(huán)境樣本有切斷傳播途徑的意義,更適用于環(huán)境樣本的基因特異性引物有待研究。因此,研究者應(yīng)基于不同檢測(cè)目的及各種樣本的優(yōu)劣勢(shì),進(jìn)行人體及環(huán)境HP檢測(cè)樣本的合理選擇,以保證HP的合理檢測(cè)。