楊丹 陳燕 郝洋 王艷敏 樊玥 李俊 李曉琦

華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 河北唐山 063000

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma,EC)是一組以上皮細(xì)胞為來(lái)源的子宮惡性腫瘤,是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤中的一種,其在發(fā)達(dá)國(guó)家最為常見(jiàn),在我國(guó)位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的第二位[1]。疾病發(fā)生轉(zhuǎn)移或者復(fù)發(fā)后的治療較為棘手,嚴(yán)重地影響了患者的預(yù)后。近年來(lái)部分學(xué)者開(kāi)始廣泛研究EC的分子分型,以期為臨床診療提供新的科學(xué)思路[2-3]。

p16、p53、磷酸酶和張力素同源物(PTEN)、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)作為腫瘤分子標(biāo)志物,在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中多見(jiàn)報(bào)道,但有關(guān)于其與EC分子分型及指導(dǎo)臨床治療方面的研究較少[4-6]。

本研究旨在探討上述5種指標(biāo)與EC的相關(guān)性,為EC患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)分層提供新思路,探求具有參考價(jià)值的潛在性預(yù)后指標(biāo)[7],從而為選擇后續(xù)提供思路[8]。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 以2016 年 1 月～ 2021 年 6 月就診于華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院婦科并接受手術(shù)治療的EC患者作為研究對(duì)象。收集其一般資料及臨床病理資料進(jìn)行回顧性分析。所有EC標(biāo)本的病理診斷均已經(jīng)術(shù)后病理石蠟切片復(fù)核證實(shí)。本研究符合華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的要求,并得以批準(zhǔn)。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn) (1)均經(jīng)術(shù)后病理檢測(cè)確診;(2)研究對(duì)象無(wú)全身性疾病或局部感染性、免疫性疾病;(3)所有患者術(shù)前均未接受任何治療并且為初次手術(shù)治療;(4)臨床資料相對(duì)完善者。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn) (1)起源于全身各組織器官除EC外的惡性腫瘤;(2)臨床資料及病理資料缺失者。

1.4方法

1.4.1資料收集 檢索華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院病案科電子病歷系統(tǒng)篩選符合條件的病例,并摘錄住院號(hào)、姓名、年齡、身高、體質(zhì)量、既往史、月經(jīng)史、生育史等一般資料以及病理資料。

1.4.2檢測(cè)方法

1.4.2.1蠟塊處理 (1)切片:將蠟塊組織固定在輪轉(zhuǎn)切片機(jī)上,用刀片修整蠟塊,將其修成方形且保證每一個(gè)切出的蠟片都含有一塊組織。然后調(diào)整切片機(jī),進(jìn)行完整均勻切片,每張厚度約4μm,將切片放入35～40°恒溫水浴中展平。1張用來(lái)HE染色,其余,將切出的呈卷狀的蠟片置于攤片機(jī)上將其展平。 (2)粘片和烤片:將切片用由多聚賴氨酸防脫處理后的磨沙玻片撈起,然后將載有組織的載玻片固定于烘片機(jī)上,調(diào)節(jié)烘片機(jī)溫度在60℃,烤片2h,置于干燥處備用,這樣可使切片粘附緊密。

1.4.2.2免疫組織化學(xué)染色 (1)脫蠟和水化:將切片依次置入純二甲苯Ⅰ溶液15min、純二甲苯Ⅱ溶液15min、純二甲苯Ⅲ溶液15min,使石蠟完全溶解,然后依次放入100%、100%、95%、95%乙醇溶液中各5min、85%、80%乙醇溶液各3min、最后放入自來(lái)水、蒸餾水分別沖洗3次,時(shí)間各為3min。 (2)抗原修復(fù):向高壓鍋中加入配置好的pH 8.0EDTA修復(fù)液,經(jīng)高壓煮沸后,將切片完全浸入修復(fù)液中,繼續(xù)加熱2min,待修復(fù)液溫度降至室溫時(shí),取出切片,室溫冷卻15min后放入蒸餾水和PBS緩沖液中分別沖洗3遍。然后于切片上滴加3%H2O2去離子水,對(duì)切片進(jìn)行封閉,室溫下放置10min。(3)抗體雜交: 孵一抗:用濾紙吸干切片上多余的PBS緩沖液,用鉛筆劃線圈出標(biāo)本,并標(biāo)記內(nèi)容,將稀釋好的一抗溶液分別滴加于切片表面,陰性對(duì)照切片表面滴加PBS液,然后將切片置于濕化盒中,濕化盒置于4℃左右冰箱中,孵育過(guò)夜。次日,切片置于恒溫干燥箱中,維持溫度在37℃左右,孵育30min,然后在PBS緩沖液中左右輕輕擺動(dòng)清洗5min,倒掉PBS緩沖液,重復(fù)清洗3次。孵二抗:用濾紙吸干切片上多余的PBS緩沖液,將稀釋好的二抗溶液(濃度同一抗)滴加于切片表面,切片置于濕化盒內(nèi),將濕化盒置于恒溫干燥箱中,維持溫度在37℃左右,孵育40min,從恒溫干燥箱中取出切片,然后將切片在PBS緩沖液中左右輕輕擺動(dòng)清洗5min,倒掉PBS緩沖液,重復(fù)清洗3次。 (4)顯色:將適量配好的DAB顯色劑滴于組織上(根據(jù)組織塊大小調(diào)整用量,盡量覆蓋全部組織),靜置約5min,具體染色的時(shí)間根據(jù)顯色效果而定,當(dāng)反應(yīng)部位出現(xiàn)黃褐色時(shí)即可終止染色,將切片置于自來(lái)水下沖洗。 (5)復(fù)染:在蘇木素溶液中復(fù)染10min,自來(lái)水下沖洗。然后用1%鹽酸乙醇分化液洗去多余的染液,進(jìn)行分化,自來(lái)水再次沖洗,當(dāng)切片變?yōu)樗{(lán)色時(shí)停止沖洗。 (6)脫水和透明:切片依次放入60%、70%、80%、90%、95%乙醇溶液各2min、100%、100%乙醇溶液各5min完成脫水過(guò)程,然后再浸泡于純二甲苯Ⅰ溶液15min、純二甲苯Ⅱ溶液15min,至透明為止。 (7)封片:向組織中央滴中性樹(shù)膠,將組織全部覆蓋,加蓋蓋玻片。 (8)觀察:電子顯微鏡下觀察每個(gè)切片的染色情況,采集圖片,對(duì)每個(gè)切片的表達(dá)情況進(jìn)行評(píng)分,分析結(jié)果。

1.5分子標(biāo)志物的結(jié)果判定 p16、p53、PTEN、ER、PR陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞核。隨機(jī)選擇高倍視野10個(gè),在每單個(gè)高倍鏡視野中隨機(jī)選取100個(gè)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè),按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在每高倍視野中所占百分比進(jìn)行計(jì)數(shù),評(píng)估則應(yīng)用免疫反應(yīng)積分法(IRS):IRS=陽(yáng)性細(xì)胞的染色程度×陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比[9]。將陽(yáng)性細(xì)胞的染色程度分為4個(gè)不同的等級(jí): 無(wú)色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3 分。將全片陽(yáng)性細(xì)胞所占的總百分比分為5個(gè)等級(jí):陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分,5%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,>75%為4分。因此,IRS的值0～12,<1分即為陰性,1～12分為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1臨床資料特點(diǎn) 本研究共113例,年齡25～80歲,中位年齡57歲,其中74例(65.4%)為絕經(jīng)后女性。合并高血壓40例,合并糖尿病23例,合并冠心病8例。所有的患者在手術(shù)前均未接受放、化療。104例(92.0%)為Ⅰ型EC(均為內(nèi)膜樣癌),9例(8.0%)為Ⅱ型EC(高級(jí)別漿液性癌3例、透明細(xì)胞癌2例、低級(jí)別子宮內(nèi)膜間質(zhì)肉瘤2例、癌肉瘤1例、子宮內(nèi)膜黏液性腺癌1例)。I型患者平均發(fā)病年齡(57.05±10.05)歲,II型患者(59.33±9.38)歲,其發(fā)病年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.261);I型、II型EC患者BMI差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.007)。見(jiàn)表1。

表1 113例EC患者基線和人口特征線 [例(%)]

2.2p16、p53、PTEN、ER、PR在EC中的表達(dá)

2.2.1p16表達(dá) p16在Ⅰ型、Ⅱ型EC中均有陽(yáng)性表達(dá),見(jiàn)圖1A,其在Ⅱ型中的表達(dá)高于Ⅰ型,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。p16在Ⅰ型EC中的表達(dá)多為部分表達(dá)、局灶表達(dá),而在漿液性癌、透明細(xì)胞癌、癌肉瘤中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。本研究中9例Ⅱ型EC中有8例呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)果表明,p16的表達(dá)在EC是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Ⅰ型EC中p16的表達(dá)在不同分化程度、不同浸潤(rùn)子宮肌層程度、是否浸潤(rùn)脈管、不同臨床-病理分期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

圖1 p16、p53、ER和PR蛋白在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)

表2 子宮內(nèi)膜疾病中五種標(biāo)志物的表達(dá) [例(%)]

2.2.2p53表達(dá) p53蛋白在Ⅱ型EC中的表達(dá)情況明顯多于Ⅰ型EC,見(jiàn)圖1B,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。p53在不同分化程度的Ⅰ型EC、不同浸潤(rùn)子宮肌層程度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否浸潤(rùn)脈管、不同的臨床-病理分期中的表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.2.3PTEN表達(dá) PTEN在Ⅰ型EC表達(dá)率高于Ⅱ型EC,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PTEN表達(dá)在不同浸潤(rùn)子宮肌層程度、是否脈管浸潤(rùn)、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),在Ⅰ型EC分級(jí)、不同臨床病理分期等組間分布未發(fā)現(xiàn)不同,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.2.4ER、PR表達(dá) ER、PR在Ⅰ型EC中的表達(dá)率高于Ⅱ型,見(jiàn)圖1C、D,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ER、PR在Ⅰ型EC的病理分級(jí)、不同臨床病理分期、是否浸潤(rùn)脈管及淋巴結(jié)有無(wú)轉(zhuǎn)移中的表達(dá)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ER在不同浸潤(rùn)子宮肌層程度中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05),而PR的表達(dá)則差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

3 討論

EC也叫子宮體癌,是女性生殖系統(tǒng)中常見(jiàn)的惡性腫瘤,從分子生物學(xué)的角度,EC的發(fā)病機(jī)制包括三方面:第一,基因失活的漸變;第二,抑癌基因突變;第三,癌基因的激活[10]。

p16作為宮頸病變的重要分子標(biāo)志物,在子宮頸的病變中通常呈彌漫性陽(yáng)性表達(dá),在宮頸癌與EC的鑒別中常應(yīng)用此標(biāo)志物進(jìn)行診斷。有研究表明,在EC中也可檢測(cè)到p16的表達(dá),但是不同類(lèi)型的EC中p16的表達(dá)率、表達(dá)強(qiáng)度以及表達(dá)范圍略有不同,其具體機(jī)制尚不清楚[11]。本研究中在Ⅱ型EC中p16的表達(dá)率為88.89%(8/9),且為彌漫強(qiáng)陽(yáng)性;在Ⅰ型EC中表達(dá)率為39.4%(41/104),且多為弱陽(yáng)性表達(dá),二者有一定區(qū)別。因此可推斷出p16在Ⅰ型EC與其他類(lèi)型EC之間的鑒別診斷中具有一定的指導(dǎo)意義。

p53是一種腫瘤抑癌基因,p53蛋白作為細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子,通過(guò)抑制細(xì)胞復(fù)制、啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序從而保持基因組的相對(duì)穩(wěn)定,使細(xì)胞能夠保持正常生長(zhǎng),從而抑制細(xì)胞往惡性方向增殖[11]。p53蛋白分為兩種不同的亞型:野生型、突變型。野生型p53蛋白因半衰期稍短而不易被檢測(cè)出;突變型的p53蛋白半衰期相對(duì)較長(zhǎng),免疫組化方法便于檢出,可提示p53蛋白處于基因突變狀態(tài),而p53是誘發(fā)Ⅱ型EC的重要因素之一[12]。本研究中基因突變型p53蛋白在Ⅰ型和Ⅱ型EC中表達(dá)比例不同。研究表明Ⅰ型EC中p53蛋白的表達(dá)呈節(jié)段式弱陽(yáng)性,而在Ⅱ型EC中的表達(dá)則呈彌漫強(qiáng)陽(yáng)性[13],此現(xiàn)象可能與野生型p53的聚集相關(guān),從而證明了p53在EC的分子分型中具有不可忽視的重要應(yīng)用價(jià)值。本研究中在不同分化程度的Ⅰ型EC中、脈管浸潤(rùn)與否、子宮肌層浸潤(rùn)程度、不同的臨床分期中p53的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),從而證明了p53在促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用,且進(jìn)一步證實(shí)了在眾多反映EC生物學(xué)行為的輔助指標(biāo)中,p53尤為重要,進(jìn)而可評(píng)估腫瘤的不同分化程度及EC患者的預(yù)后情況,對(duì)指導(dǎo)臨床診療具有重要參考意義。

PTEN也是一種重要的腫瘤抑制基因,維持正常細(xì)胞功能。近年來(lái)有研究表明,其在EC、黑色素瘤、前列腺癌等腫瘤中具有重要作用[13]。采用免疫組化方法檢測(cè)PTEN蛋白,能將由不同機(jī)制導(dǎo)致的PTEN失活體現(xiàn)出來(lái)[14]。本研究中PTEN在子宮內(nèi)膜癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為 42.4%(48/113),其中Ⅰ型EC的陽(yáng)性表達(dá)率為44.2%(46/104),Ⅱ型EC的陽(yáng)性表達(dá)率為22.2%(2/9),Ⅰ型明顯高于Ⅱ型。從而證明在EC的發(fā)生發(fā)展中PTEN失活起了一定的激化作用,而其在Ⅰ型EC中尤為明顯。進(jìn)一步推測(cè)PTEN的表達(dá)情況對(duì)于EC分型有一定的輔助意義。

有研究表明,ER和PR的陽(yáng)性表達(dá)在降低細(xì)胞惡性程度、降低腫瘤侵襲性及抑制EC轉(zhuǎn)化向非激素依賴型腫瘤方面等有不同程度的作用,伴隨著病理分級(jí)從低級(jí)別到高級(jí)別、手術(shù)分期從Ⅰ期到Ⅱ期以及腫瘤肌層浸潤(rùn)深度從淺入深[15-16],ER、PR在EC中的表達(dá)量分別有不同程度的下降(P<0.05)。有研究表明ER、PR在EC中的陽(yáng)性表達(dá)程度越高,EC患者的有效生存期越長(zhǎng),預(yù)后則越好[17]。因此,檢測(cè)ER、PR在EC中的表達(dá)對(duì)預(yù)后及臨床診療等具有重要參考意義。

關(guān)于EC相關(guān)分子標(biāo)志物在EC中的表達(dá)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)很普遍[18],但對(duì)于上述5種分子標(biāo)志物各自表達(dá)的研究并不多。本研究認(rèn)為p16、p53、PTEN、ER和PR蛋白的表達(dá)在臨床判斷EC的分子分型方面提供了新思路,實(shí)際工作中可聯(lián)合使用指導(dǎo)臨床診療,為分子分型提供科學(xué)依據(jù)[19-20]。許多疾病的發(fā)生發(fā)展,特別是腫瘤多與基因突變有關(guān);在日常工作中正確合理的檢測(cè)腫瘤組織中此類(lèi)基因蛋白的表達(dá),可以為臨床醫(yī)生關(guān)于子宮內(nèi)膜癌的診治思路提供指導(dǎo),從而提高醫(yī)療質(zhì)量[21-23]。