王廣玲,幸凡,周雪念,熊依寧

(1江西省人民醫(yī)院臨床營(yíng)養(yǎng)科,南昌 330006;2宜春市袁州區(qū)婦幼保健院保健科,江西 宜春 336000)

隨著我國(guó)老年人口的增加,與老年相關(guān)的疾病不斷攀升,嚴(yán)重危害著老年人的身心健康。隨著年齡增長(zhǎng),骨骼肌衰老,骨骼肌出現(xiàn)進(jìn)行性的質(zhì)量和力量丟失,導(dǎo)致肢體殘疾,生活質(zhì)量減低甚至死亡,給社會(huì)和家庭帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)壓力和精神壓力[1]。1998年Rosenberg[2]首次將骨骼肌隨年齡增長(zhǎng)進(jìn)行性衰老現(xiàn)象診斷為肌肉衰減綜合征。目前肌肉衰減綜合征的臨床治療以運(yùn)動(dòng)、營(yíng)養(yǎng)、藥物治療為主,實(shí)際上大部分患者并未獲益,且藥物(睪酮、雌激素、生長(zhǎng)激素)因其較大的副作用,在臨床上的應(yīng)用受到限制[3]。因此對(duì)于肌肉衰減綜合征的治療及干預(yù)亟需安全有效的措施。

多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是人體所必需的脂肪酸,其中omega-3多不飽和脂肪酸(omega-3 polyunsaturated fatty acids,n-3PUFAs)在海洋魚(yú)類及某些堅(jiān)果中含量較為豐富,能夠發(fā)揮抗腫瘤、抗炎、抗衰老等作用[4,5]。有流行病學(xué)研究證實(shí)人類通過(guò)攝入富含 n-3PUFAs的飲食方式能夠有效降低神經(jīng)系統(tǒng)、心血管疾病及免疫性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[6]。有研究報(bào)道老年脂肪酸氧化能力下降,可能是導(dǎo)致年齡相關(guān)的肌肉衰減、脂肪堆積的重要原因之一[7]。n-3PUFAs防治衰老相關(guān)慢性病的研究成果,提示n-3 PUFAs可能成為新型延緩衰老的功能因子[8]。但是現(xiàn)有研究大多基于流行病學(xué)層面,n-3PUFAs衰老過(guò)程中其抗骨骼肌減少的作用機(jī)制未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究探討n-3PUFAs對(duì)骨骼肌生物效應(yīng)的影響及其相關(guān)機(jī)制,旨在為骨骼肌的抗衰老策略提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30只22～24月齡老年雄性Wistar大鼠購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,所有大鼠在同樣環(huán)境下飼養(yǎng),自然照明周期,清潔級(jí)飼養(yǎng),動(dòng)物房溫度(22±1)℃,動(dòng)物飼料為無(wú)特定病原體級(jí)大鼠維持飼料。

1.2 主要試劑

D-半乳糖(D-galactose)購(gòu)自MedChemExpress(MCE)公司;蛋白質(zhì)裂解緩沖液(protein lysis buffer,RIPA)、蛋白酶抑制劑(protease inhibitor,PMSF)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;封閉用脫脂奶粉購(gòu)自賽默飛公司;增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒(enhanced chemiluminescent,ECL)、聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDE)購(gòu)自碧云天生物有限公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑盒(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)、抗體稀釋液、電轉(zhuǎn)及電泳緩沖液購(gòu)于博士德生物工程有限公司;鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶2(calcium/calmodulin-dependent protein kinase 2,CAMKK2)(ab96531)、腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)(ab80039)、磷酸化-腺甘酸活化蛋白激酶(p-adenosine monophosphate activated protein kinase,p-AMPK)(ab194920)、一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)購(gòu)自艾博抗公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物模型建立及分組 將大鼠隨機(jī)分為3組:空白組、模型組和n-3PUFAs組,每組10只。模型組和n-3PUFAs組行腹部皮下注射5% D-半乳糖(125mg/kg)建立骨骼肌衰老動(dòng)物模型[9];空白組腹部皮下注射0.9%生理鹽水,造模給藥連續(xù)進(jìn)行8周。在造模第7天開(kāi)始,n-3PUFAs組連續(xù)給予n-3PUFAs 2.0mg/(g·d)飼料喂養(yǎng)7周,空白組和模型組給予等體積的米湯干預(yù)。最后一次喂養(yǎng)24h后,腹腔麻醉,將所有大鼠脫頸處死,置于冰上迅速剝離大鼠股直肌和比目魚(yú)肌,并用分析天平稱取濕重,進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.3.2 大鼠肌力行為學(xué)檢測(cè) 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,運(yùn)用水平繩實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠肌力行為學(xué),首先將各組大鼠的前肢放置在水平繩讓其握住,正常情況下普通大鼠的后肢會(huì)迅速抓住水平繩并在繩上爬行。若大鼠存在肌力下降情況,則前、后肢無(wú)力抓繩,后肢抓繩上繩的時(shí)間將延長(zhǎng)。因此,通過(guò)觀察大鼠攀爬上繩的時(shí)間可間接判斷肌肉力量的改變情況。

1.3.3 Western blot 使用RIPA裂解緩沖液提取3組大鼠股直肌中的總蛋白;采用蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)測(cè)定蛋白濃度,蛋白煮沸變性,以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,并將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上,5%脫脂牛奶封閉1h,用CaMKK2(ab96531)抗體(1∶5000)、AMPK(ab80039)抗體(1∶5000)、p-AMPK(ab194920)抗體(1∶2000)在4℃下過(guò)夜。次日TBS-吐溫20洗膜3次,每次10min,用二抗(1∶8000稀釋)在37℃下孵育2h。最后用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒顯示蛋白條帶;獲得條帶后使用Image J軟件分析蛋白信號(hào)強(qiáng)度,計(jì)算蛋白水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 D-半乳糖構(gòu)建衰老大鼠模型

通過(guò)計(jì)算衰老大鼠骨骼肌組織的質(zhì)量來(lái)評(píng)價(jià)D-半乳糖對(duì)構(gòu)建衰老大鼠模型是否建立成功。結(jié)果顯示,模型組比目魚(yú)肌質(zhì)量(0.334±0.015)g顯著低于空白組(0.412±0.021),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.015)。說(shuō)明D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠模型建模成功。

2.2 3組大鼠體質(zhì)量監(jiān)測(cè)結(jié)果

3組大鼠經(jīng)過(guò)不同處理后,每周測(cè)定體質(zhì)量并記錄。結(jié)果顯示,模型組大鼠脫毛明顯,伴有精神萎靡,活動(dòng)度明顯下降,飲食一般,體質(zhì)量增長(zhǎng)速度緩慢,而n-3PUFAs組大鼠上述情況有明顯改善。實(shí)驗(yàn)前,3組大鼠體質(zhì)量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,3組大鼠體質(zhì)量增加明顯;與空白組大鼠比較,模型組和n-3PUFAs組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)較緩,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組大鼠比較,n-3PUFAs組大鼠體質(zhì)量增加較大,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05;表1)。

表1 n-3PUFAs對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠體質(zhì)量的影響

2.3 n-3PUFAs對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠四肢肌力的影響

空白組各月末檢測(cè)開(kāi)始攀爬的所需時(shí)間接近,組內(nèi)各月末間的數(shù)據(jù)比較無(wú)顯著差異。與空白組比較,造模1個(gè)月后模型組大鼠開(kāi)始攀爬的時(shí)間明顯延長(zhǎng)[(2.40±0.50)和(1.07±0.15)s],造模2個(gè)月后更為顯著[(7.33±0.76)和(1.33±0.32)s] ,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),間接反映了D半乳糖可誘導(dǎo)大鼠骨骼肌肌力下降。與模型組比較,n-3PUFAs組大鼠同時(shí)期開(kāi)始攀爬的所需時(shí)間明顯縮短[1個(gè)月:(1.76±0.32)和(2.40±0.50)s; 2 個(gè)月:(4.07±0.61)和(7.33±0.76)s],提示n-3PUFAs干預(yù)處理后,大鼠的肌力逐漸得到恢復(fù)(圖1)。

圖1 n-3PUFAs對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠四肢肌力的影響

2.4 n-3PUFAs對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠骨骼肌形態(tài)學(xué)和衰老相關(guān)標(biāo)志物的影響

3組大鼠經(jīng)過(guò)不同的處理后,通過(guò)HE染色觀察各組大鼠骨骼肌的萎縮情況,結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組中大鼠骨骼肌細(xì)胞形狀大小不一、細(xì)胞間隙增大,骨骼肌萎縮最為嚴(yán)重,肌纖維直徑明顯縮小;而n-3PUFAs組大鼠骨骼肌細(xì)胞大小逐漸均一化、細(xì)胞間隙縮小、細(xì)胞間隙結(jié)締組織減少且排列緊密,肌纖維直徑增粗。采用Western blot 檢測(cè)衰老相關(guān)標(biāo)志物p21、p16的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組大鼠中p21、p16蛋白表達(dá)升高;與模型組比較,n-3PUFAs組大鼠中p21、p16蛋白表達(dá)降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01;圖2)。

圖2 n-3PUFAs對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠骨骼肌形態(tài)學(xué)和衰老相關(guān)標(biāo)志物的影響

2.5 n-3PUFAs對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠骨骼肌CaMKK2及AMPK蛋白表達(dá)的影響

3組大鼠經(jīng)過(guò)不同處理后,采用Western blot 檢測(cè)CaMKK2/AMPK信號(hào)通路蛋白CaMKK2、AMPK、p-AMPK表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組大鼠CaMKK2、p-AMPK的相對(duì)蛋白表達(dá)明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與模型組比較,n-3PUFAs組大鼠中CaMKK2、p-AMPK相對(duì)蛋白表達(dá)明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);而AMPK在3組中的表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05;圖3)。

圖3 Western blot檢測(cè)CaMKK2、AMPK及p-AMPK蛋白表達(dá)水平

3 討 論

衰老是一個(gè)與時(shí)間有關(guān)的多方面過(guò)程,其中生理完整性的逐漸喪失會(huì)導(dǎo)致功能障礙和生活質(zhì)量下降[10]。隨著世界老齡化人口的日益加劇,如何安全有效地延緩衰老成為關(guān)注的焦點(diǎn)[11]。衰老的自由基學(xué)說(shuō)認(rèn)為自由基引起的氧化損傷是引起機(jī)體老化及多種老年病的主要因素[12]。存在于細(xì)胞膜的不飽和脂肪酸受到自由基的啟動(dòng)產(chǎn)生過(guò)氧化脂質(zhì),過(guò)氧化脂質(zhì)經(jīng)過(guò)分解產(chǎn)生丙二醛,通過(guò)與蛋白質(zhì)、肽類或脂類聚合、交聯(lián),形成老年色素或脂褐質(zhì)積累在細(xì)胞組織中,導(dǎo)致機(jī)體衰老[13]。已有研究報(bào)道n-3PUFAs對(duì)于心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、糖尿病和癌癥等增齡性慢性病具有防治作用,提示了n-3PUFAs對(duì)健康老齡化的潛在促進(jìn)作用[14]。

目前,在進(jìn)行衰老和抗衰老的研究方面,動(dòng)物模型的建立非常重要。D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老模型因其時(shí)間短、耗時(shí)短、副作用最少及在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期中存活率較高而最受歡迎[15]。已有研究結(jié)果報(bào)道體質(zhì)量、肌肉力量及器官系數(shù)可間接反映機(jī)體的衰老程度[16]。本研究應(yīng)用D-半乳糖誘導(dǎo)制成Wistar大鼠骨骼肌衰老模型,結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組脫毛明顯、活動(dòng)度下降、體質(zhì)量減輕,開(kāi)始攀爬的時(shí)間明顯延長(zhǎng);而與模型組比較,大鼠的體質(zhì)量、肌肉力量有明顯改善。并且HE染色提示,經(jīng)過(guò)n-3PUFAs處理后大鼠骨骼肌的萎縮情況明顯改善,衰老相關(guān)標(biāo)志物p21、p16蛋白表達(dá)下調(diào),提示n-3PUFAs可降低骨骼肌衰老過(guò)程中骨骼肌損傷,能夠改善D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠骨骼肌的衰老。

關(guān)于n-3PUFAs對(duì)于骨骼肌衰老的保護(hù)作用可能涉及多種機(jī)制,但目前尚未完全闡明。多項(xiàng)研究證實(shí),AMPK通路不僅處于能量代謝的樞紐,同時(shí)也參與對(duì)老化過(guò)程的調(diào)節(jié),在多種器官和組織的脂代謝中發(fā)揮非常重要的作用[17]。AMPK是一個(gè)異源三聚體蛋白,由一個(gè)催化亞基Q和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基8和7組成,是重要的細(xì)胞內(nèi)能量狀態(tài)的傳感器之一,依賴于體內(nèi)單磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)/三磷酸腺苷(adenosine triphosphqte,ATP)比例的升高發(fā)揮作用[18]。AMPK參與糖、脂、蛋白質(zhì)代謝、細(xì)胞生長(zhǎng)與凋亡、骨骼肌等多個(gè)方面的調(diào)控[19]。CaMKK2/AMPK途徑是AMPK數(shù)條通路途徑中重要的通路分支,有研究證實(shí)通過(guò)干預(yù)這條通路能夠明顯改善肝臟脂肪變性和肝損傷[20]。CaMKK2受細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度調(diào)控,通過(guò)磷酸化激活A(yù)MPK,而AMPK的磷酸化則進(jìn)一步抑制脂肪合成相關(guān)蛋白的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)物質(zhì)代謝和脂肪酸氧化[21]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中CaMKK2超表達(dá)能夠提高AMPK的活性;反之,藥物抑制CaMKK2或用反義RNA干擾抑制CaMKK2表達(dá),則使AMPK的活性幾乎完全喪失[22]。研究n-3PUFAs是否通過(guò)CaMKK2/AMPK通路影響骨骼肌衰老,結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組大鼠中CaMKK2、p-AMPK的蛋白表達(dá)明顯下調(diào);給予n-3PUFAs處理后,CaMKK2、p-AMPK蛋白表達(dá)逐步恢復(fù)。說(shuō)明在衰老過(guò)程中,大鼠骨骼肌發(fā)生了CaMKK2/AMPK信號(hào)通路的活化,引起了CaMKK2與p-AMPK表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮了延緩骨骼肌衰老的作用。

綜上,D-半乳糖可誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生衰老模型,n-3PUFAs干預(yù)可緩解D-半乳糖誘導(dǎo)的大鼠骨骼肌衰老,其作用機(jī)制可能與CaMKK2/AMPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的激活有關(guān)。