林 青,邢 玉,劉艷霞,佟 慶,陳 雨,徐道立,祁 冰

(北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院,北京 100078)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種以內分泌紊亂為主、多種代謝異常導致的異質性臨床綜合征,我國育齡期婦女中PCOS發(fā)病率逐步攀升［1］。PCOS患者生理、心理承受雙重負擔,但關于PCOS的發(fā)病機制卻眾說紛紜,也無特效治療藥物。針對PCOS的病因、病理改變、發(fā)病機制以及治療方法、治療靶點的研究有著深遠的意義。大量研究證實,人體代謝水平與腸道菌群有著十分密切的關系［2］。腸道菌群通過與外界環(huán)境相互作用,促進新陳代謝、免疫反應和改善腸道結構,被認為是PCOS發(fā)病關鍵一環(huán)［3］,調節(jié)腸道內環(huán)境對PCOS有重要意義。糞菌移植實驗是研究腸道內環(huán)境對于各種疾病發(fā)生發(fā)展影響的重要途徑。本實驗旨在通過糞菌移植實驗,探討來曲唑誘導的PCOS大鼠模型腸道菌群是否可以引起PCOS的發(fā)生,為后續(xù)研究PCOS的發(fā)病機制提供基礎。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級6周齡雌性SD大鼠12只,體重(180±15)g;SPF級3周齡雌性SD大鼠20只,體重(100±10)g。大鼠均由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,動物許可證號:SCXK(京)2016-0006。常規(guī)飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學SPF級屏障環(huán)境,12 h光照/黑夜循環(huán),溫度25 ℃,濕度60%,自由攝食飲水。

1.2實驗藥物 來曲唑片(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批號:190316KG),卡那霉素(索萊寶生物科技有限公司,貨號:K8020),慶大霉素(索萊寶生物科技有限公司,貨號:G8170),多黏菌素B(索萊寶生物科技有限公司,貨號:P8350),萬古霉素(索萊寶生物科技有限公司,貨號:V8050),滅滴靈(索萊寶生物科技有限公司,貨號:M8060)。

1.3實驗儀器與試劑 離心機(恒諾儀器,AXTGL16M),切片機(Leica,RM2235),石蠟包埋機(Leica G1150H),電子天平(Sartorius公司,Cubis?MSA224S-000-DA),電熱恒溫水浴槽(上海一恒 恒溫設備廠,HWS-24),制冰機(SCOTSMAN,AF10),旋渦混勻器(海門麒麟醫(yī)用儀器廠,XW-80A型),ChemiDoc MP化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-rad,170-8280),γ放射免疫計數(shù)器(西安核儀器廠,XH-6080),全自動酶標儀(THERMO V.2.3),微量分光光度計(杭州佑寧儀器有限公司,NanoOne)。血清雄激素測定試劑盒(北京北方生物技術研究所,批號:20190602),血糖酶法試劑盒(北京百奧泰康生物技術有限公司,批號:DL201901),無水乙醇(國藥集團國瑞藥業(yè)有限公司,批號:10009218),異丙醇(國藥集團國瑞藥業(yè)有限公司,批號:40064360),DEPC水(MDL,批號:md911875)。

1.4實驗方法 6周齡大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后,按隨機數(shù)字表法隨機分為空白組、模型組各6只。3周齡大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后,按隨機數(shù)字表法隨機分為糞菌移植模型組、糞菌移植對照組,每組10只。將來曲唑1 mg/(kg·d)溶于1%羧甲基纖維素(CMC)中,模型組大鼠連續(xù)灌胃21 d復制PCOS大鼠模型,空白組大鼠同期灌胃等體積等濃度基質CMC。在6周齡大鼠灌胃的第17天起,3周齡大鼠開始喂食抗生素混合飲水(卡那霉素0.4 mg/mL、慶大霉素0.035 mg/mL、多黏菌素850 IU/mL、滅滴靈0.215 mg/mL 、萬古霉素0.045 mg/mL),連續(xù)5 d,建立偽無菌大鼠模型(腸道菌群DNA總量明顯降低)［4］。第22天開始,空白組每日灌胃等體積CMC,模型組每日灌胃等體積來曲唑藥液1 mg/(kg·d),糞菌移植對照組每日灌胃等體積空白組大鼠新鮮糞便混懸液2 g/(kg·d)(收集4 g空白組大鼠新鮮糞便,于20 mL生理鹽水中混勻,3 min后灌胃),糞菌移植模型組每日灌胃等體積模型組大鼠新鮮糞便混懸液2 g/(kg·d)(制備方法同糞菌移植對照組),均每日1次,連續(xù)21 d。

1.5取材 末次灌胃后,大鼠饑餓12 h,腹腔注射0.4%戊巴比妥(1 mL/100 g)麻醉,打開腹腔,腹主動脈取血后摘取雙側卵巢,左側卵巢置于4%多聚甲醛固定,制作石蠟切片,HE染色,鏡下觀察,右側卵巢液氮保存。

1.6檢測指標及方法

1.6.1大鼠形態(tài) 記錄各組大鼠干預前1 d、干預21 d后和干預42 d后體重、身長(鼻尖至肛門的距離),計算干預前1 d和干預42 d后Lee’s指數(shù)［5］。Lee’s指數(shù)=3√體重(g)×103/體長(cm)。

1.6.2大鼠動情周期 監(jiān)測空白組和模型組(開始干預的第16～20天、第36～42天)、糞菌移植模型組和糞菌移植對照組(移植第1～7天)大鼠陰道脫落細胞涂片,觀察大鼠動情周期的變化,繪制動情周期曲線圖。動情間期:細胞總數(shù)較為稀少,以白細胞為主,偶見一些有核上皮細胞;動情前期:膨大呈橢圓形的有核上皮細胞占絕大多數(shù),偶見少量白細胞和角化上皮細胞;動情期:絕大多數(shù)為外形不規(guī)則的角化上皮細胞,聚集在一起形成堆狀,鏡下觀察如落葉狀,可見極少量白細胞和有核上皮細胞;動情后期:不規(guī)則角化上皮細胞、有核上皮細胞和白細胞均可見,且比例相當［6］。

1.6.3血清睪酮及空腹血糖水平 末次灌胃后,大鼠饑餓12 h,腹腔注射0.4%戊巴比妥(1 mL/100 g)麻醉,腹主動脈取血4 mL,1 500 r/min離心5 min,取血清,放射免疫法檢測4組大鼠血清睪酮水平,生化法檢測空白組和模型組大鼠空腹血糖水平。

1.6.4卵巢形態(tài)和病理形態(tài) 取血后摘取雙側卵巢,立即稱重,測量雙側卵巢長(A)、寬(B)和厚(C),計算卵巢體積(卵巢體積=0.52×A×B×C)。左側卵巢置于4%多聚甲醛固定,制作石蠟切片,HE染色,鏡下觀察病理形態(tài)。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊用ANOVA檢驗,若P<0.05采用LSD進行兩兩比較;如果數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊則采用非參數(shù)檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1空白組與模型組大鼠形態(tài)比較 干預前,2組大鼠體重和Lee’s指數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05);干預21 d后,模型組大鼠體重明顯高于空白組(P<0.05);干預42 d后,模型組大鼠體重和Lee’s指數(shù)均明顯高于空白組(P均<0.05)。見表1。

表1 空白組與多囊卵巢綜合征模型組大鼠干預前后體重和Lee’s指數(shù)比較

2.2空白組與模型組大鼠動情周期比較 干預第16～20天,空白組大鼠均觀察到完整動情周期,見圖1;模型組大鼠規(guī)律動情周期已經消失,發(fā)情期縮短或者未監(jiān)測到完整動情周期,見圖2。干預第36～42天,空白組大鼠仍然可觀察到完整動情周期,動情周期波動與干預5 d后基本保持一致,見圖3;模型組大鼠未見規(guī)律動情周期,動情周期紊亂或發(fā)情期縮短,動情周期波動與干預5 d后相吻合,見圖4。(圖1～4中,縱坐標E代表動情期,P代表動情前期,M/D代表動情后期/動情間期)

圖1 干預第16～20天空白組大鼠動情周期折線圖

圖2 干預第16～20天模型組大鼠動情周期折線圖

圖3 干預第36～42天空白組大鼠動情周期折線圖

圖4 干預第36～42天模型組大鼠動情周期折線圖

2.3空白組與模型組大鼠血清睪酮和空腹血糖水平比較 空白組與模型組大鼠血清睪酮水平分別為(0.75±0.14)ng/mL、(2.00±1.15)ng/mL,模型組明顯高于空白組(P<0.05);空白組與模型組大鼠空腹血糖水平分別為(8.17±1.19)mmol/L、(9.70±0.41)mmol/L,2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

(2)對圈員定期進行培訓,培訓穿刺針的拔除方法以及拔出后對穿刺點的壓迫方法,并加強訓練。在拔出穿刺針后,叮囑患者等幾分鐘后再離開病床,避免用力過大崩開膠帶,導致出血。還要告知患者透析間期居家發(fā)生滲血的處理方法。

2.4空白組與模型組大鼠卵巢形態(tài)比較 模型組大鼠右側卵巢重量及雙側卵巢體積均明顯高于空白組(P均<0.05),左側卵巢重量與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 空白組與多囊卵巢綜合征模型組大鼠卵巢重量和卵巢體積比較

2.5空白組與模型組大鼠卵巢組織HE染色表現(xiàn)空白組大鼠卵巢可見優(yōu)勢卵泡和黃體;模型組大鼠可見數(shù)個囊狀卵泡,未成熟卵泡數(shù)量一個切面內大于12個,未見優(yōu)勢卵泡及黃體,卵泡明顯減小,可見閉鎖卵泡,囊泡顆粒細胞層較空白組明顯變薄。見圖5。

圖5 空白組與多囊卵巢綜合征模型組大鼠卵巢組織HE染色表現(xiàn)(×40)

2.6糞菌移植對照組與糞菌移植模型組大鼠形態(tài)比較 2組大鼠糞菌移植前后體重、Lee’s指數(shù)組間及組內比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表3。

表3 糞菌移植對照組與糞菌移植模型組大鼠體重、Lee’s指數(shù)比較

2.7糞菌移植對照組與糞菌移植模型組大鼠動情周期比較 糞菌移植對照組大鼠均觀察到完整動情周期,動情周期波動規(guī)律,見圖6;部分糞菌移植模型組大鼠未見規(guī)律動情周期,出現(xiàn)動情周期紊亂、發(fā)情期縮短或未觀察到完整動情周期,少部分觀察到規(guī)律波動的完整動情周期,見圖7。

圖6 移植后第15～21天糞菌移植對照組大鼠動情周期折線圖

圖7 移植后第15～21天糞菌移植模型組大鼠動情周期折線圖

2.8糞菌移植對照組與糞菌移植模型組大鼠血清睪酮水平比較 糞菌移植對照組與糞菌移植模型組大鼠血清睪酮水平分別為(1.00±0.35)ng/mL、(1.51±0.75)ng/mL,2組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),但糞菌移植模型組大鼠血清睪酮水平較糞菌移植對照組有明顯上升趨勢。

2.9糞菌移植對照組與糞菌移植模型組大鼠卵巢形態(tài)比較 糞菌移植后,糞菌移植模型組大鼠雙側卵巢重量、卵巢體積均較糞菌移植對照組不同程度增高,但2組只有右側卵巢重量比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 糞菌移植對照組與糞菌移植模型組大鼠卵巢重量和卵巢體積比較

2.10糞菌移植對照組與糞菌移植模型組大鼠卵巢組織HE染色表現(xiàn) 2組大鼠卵巢形態(tài)未見明顯病理學差異,均可見優(yōu)勢卵泡與黃體,糞菌移植模型組大鼠卵巢卵泡數(shù)稍多于糞菌移植對照組。見圖8。

圖8 糞菌移植對照組與糞菌移植模型組大鼠卵巢組織HE染色表現(xiàn)(×40)

3 討 論

目前PCOS大鼠模型的建立主要有雄激素聯(lián)合胰島素造模法、胰島素聯(lián)合HCG造模法、芳香化酶抑制劑造模法、雄激素造模法、胰島素類造模法、孕激素聯(lián)合HCG造模法、雄激素聯(lián)合HCG造模法等［7］,其中外源性雄激素法造模使用較多的雄激素有脫氫表雄酮(DHEA)、雙氫睪酮(DHT)和丙酸睪酮(TP)［8］,芳香化酶抑制劑造模法主要應用的藥物是來曲唑。本實驗選取來曲唑作為PCOS大鼠模型建立的藥物,原因如下:①來曲唑建立的PCOS大鼠模型生育功能降低,卵巢卵泡增多,出現(xiàn)排卵障礙,體重明顯升高,出現(xiàn)雄激素升高、胰島素抵抗、血脂異常等,此造模方法經濟實惠、操作簡單,可以長期操作,模型穩(wěn)定。②在后期糞菌移植的過程中,提供移植糞便樣本的模型組大鼠仍需每日灌服造模藥物。來曲唑血清終末消除相半衰期約2 d,其清除主要通過代謝成無藥理作用的羥基代謝產物,而且?guī)缀跛写x產物和約5%原藥通過腎臟排泄。此種代謝方式可以排除糞菌移植過程中模型組大鼠腸道代謝造模藥物的干擾,保證移植的模型組糞便樣本中基本不存在具有藥理作用的造模藥物。因此,本研究選用來曲唑進行造模。

本研究中,空白組和模型組大鼠干預前體重、Lee’s指數(shù)均無明顯差異,經過連續(xù)21 d來曲唑給藥,模型組大鼠體重較空白組大鼠顯著增加,動情周期紊亂,初步判斷PCOS大鼠模型建立成功,可以進行后續(xù)糞菌移植操作。連續(xù)42 d來曲唑給藥后,模型組大鼠體重、Lee’s指數(shù)繼續(xù)上升,未監(jiān)測到完整動情周期或發(fā)情期明顯縮短,部分大鼠動情周期消失,血清睪酮水平顯著高于空白組,結合模型組雙側卵巢體積、重量變化,HE染色卵巢也接近PCOS病理變化,按照PCOS臨床診斷標準［9］,可以判斷PCOS大鼠模型建立成功。

在糞菌移植實驗前,多對實驗動物進行抗生素預處理,以排除實驗動物自帶腸道菌群對于糞菌移植結果的干擾。Qi等［10］對21日齡小鼠糞菌移植實驗前先給予抗生素治療4 d,后成功糞菌移植出類PCOS癥狀大鼠。Uchiyama等［11］和Bhowmik等［12］的實驗采取的抗生素預處理方案為萬古霉素200 mg/kg、甲硝唑200 mg/kg、新霉素200 mg/kg,卞恒娟等［13］復制了該方案,對8周齡雄性大鼠每3 d喂食1次抗生素混合飲水,聯(lián)合高脂飼料成功建立肥胖大鼠模型。本研究為了后期觀察大鼠動情周期和卵巢變化,實驗動物采用尚未性成熟的3周齡大鼠,同時參考本院抗生素預處理成功經驗［4］,選擇抗生素方案為卡那霉素0.4 mg/mL、慶大霉素0.035 mg/mL、多黏菌素850 IU/mL、滅滴靈0.215 mg/mL以及萬古霉素0.045 mg/mL,上述抗生素按比例混入大鼠日常飲水中,連續(xù)喂食5 d后,大鼠腸道菌群DNA總量明顯低于抗生素處理前,提示偽無菌大鼠模型的建立成功。

糞菌移植后,雖然糞菌移植模型組大鼠體重、Lee’s指數(shù)與糞菌移植對照組比較差異不明顯,少部分大鼠仍存在規(guī)律動情周期,卵巢HE染色未出現(xiàn)明顯多卵泡樣改變,但部分大鼠已出現(xiàn)動情周期紊亂,雄激素水平升高,雙側卵巢重量、體積不同程度增加的情況,出現(xiàn)部分類似PCOS癥狀,不排除延長移植時間實驗結果陽性可能及移植失敗可能。但尚不可將此結果評價為已成功移植出PCOS大鼠,僅能認為來曲唑介導的PCOS大鼠模型腸道菌群可能導致PCOS的發(fā)生。

本實驗為今后研究腸道菌群在PCOS發(fā)生發(fā)展中起到的作用提供了基礎和經驗。由于時間、經費、人力等各種影響,本研究只能局限于大鼠實驗,且大鼠樣本量不足,實驗結果存在誤差;本次糞菌移植實驗結果未能完全滿意,考慮可能是移植時間過短,或者糞便移植標本處理方法需要改良,比如研磨不夠或加以離心后灌服糞液。由于經費問題,本實驗未繼續(xù)研究各組大鼠腸道菌群的細致變化。大量文獻表明,PCOS患者腸道微生物中柔膜菌ML615J-28、類桿菌S247、擬桿菌豐度降低［14-16］,厚壁菌豐度提高,腸道菌群α多樣性降低［17］。今后實驗可以著重針對上述菌種,展開菌種定向移植實驗,明確腸道菌群在PCOS發(fā)病中的變化,為臨床提供治療方向和靶點。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。