李陽，徐秉忠，王加玉，閆夢丹，葉耘峰（.江蘇護理職業(yè)學院，江蘇 淮安 3003；.淮安市第一人民醫(yī)院，江蘇 淮安 300）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種常見的消化道慢性炎癥性疾病。UC 的病變常由直腸開始，延伸至結(jié)腸末端，其特點為彌漫性黏膜炎癥，且極易復發(fā)，治療不當可造成腸道功能障礙，甚至引發(fā)結(jié)腸癌等嚴重后果[1]。近年來，UC 發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，臨床用于癥狀控制的藥物有糖皮質(zhì)激素、5-氨基水楊酸類藥物、免疫調(diào)節(jié)劑等，但治療效果仍不能令人滿意[1-2]。UC 的確切發(fā)病機制尚未闡明，但有證據(jù)[3]顯示腸黏膜屏障的破壞對UC 的進展至關(guān)重要，腸黏膜可以防止腸腔中的有害物質(zhì)滲出，其完整性破壞會增加結(jié)腸炎的易感性，進而加速炎癥的發(fā)生，而黏膜屏障的完整性與連接蛋白的表達密切相關(guān)。

積雪草酸是傳統(tǒng)中藥積雪草Centellaasiatica（L.）Urb.中主要的天然五環(huán)三萜類成分之一，因其具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激等多方面藥理作用，以及對多種疾病具有治療潛力而備受關(guān)注[4-5]。有研究[6]表明，積雪草酸可能通過抑制線粒體介導的NLRP3炎癥小體的激活進而緩解UC 小鼠的癥狀，即通過緩解炎癥反應(yīng)發(fā)揮對UC 的治療作用，但是否與腸黏膜屏障修復有關(guān)尚不清楚。因此，本研究擬基于腸上皮屏障修復角度探討積雪草酸對UC 小鼠的治療作用及機制，以期為UC 新藥的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物 4 周齡雄性C57BL/6 小鼠30 只，SPF 級，14～18 g，由杭州醫(yī)學院提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0002，動物質(zhì)量合格證號：20210407Abzz0100000502。本動物實驗經(jīng)淮安市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準，批文號：KY-2022-143-01。

1.2 藥物及試劑 積雪草酸，南京春秋生物工程有限公司，批號：JXCS20210312；柳氮磺胺吡啶腸溶片（SASP），上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號：02000052；4%多聚甲醛，合肥蘭杰柯科技有限公司，批號：BL539A；葡聚糖硫酸鈉（DSS），美國MP Biomedicals 生物醫(yī)學公司，批號：216011080；腫瘤壞死因子α（TNF-α，批號：SEKR-0009）、白細胞介素6（IL-6，批號：SEKR-0005）、IL-1β（批號：SEKR-0002）試劑盒，均購自北京索萊寶科技公司；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒，南京森貝伽生物公司，批號：BP-DL001；過碘酸-雪夫（PAS）染色試劑盒（批號：C0142M）、總RNA 抽提試劑（批號：R0011）、cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：D7166）、PCR Master Mix（批號：D7228），均購自上海碧云天生物公司；BCA 蛋白定量試劑盒，美國Thermo 公司，批號：23246；黏蛋白2（MUC2）抗體（批號：A4767）、claudin-1 抗體（批號：A2196）、occludin 抗體（批號：A2601）、閉鎖小帶蛋白1（ZO-1）抗體（批號：A0659），均購自武漢愛博泰克生物公司；β-actin 抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：bs-0061R。

1.3 主要儀器 Multiskan MK3 型酶標儀、iBright CL750 型凝膠成像系統(tǒng)、Applied Biosystems 實時定量PCR 儀，美國Thermo 公司；RM2235 型病理切片機，德國Leica 公司；BX53 型生物顯微鏡，日本Olympus 公司；1-14K 型高速低溫離心機，德國Merck Sigma 公司。

1.4 分組、模型復制及給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機分成5 組：空白組、模型組、柳氮磺胺吡啶組及積雪草酸低劑量組、積雪草酸高劑量組，每組6 只。將2.5% DSS 溶解在飲用水中供小鼠自由飲用10 d 以建立UC 模型[6]。造模同時灌胃給藥，其中柳氮磺胺吡啶組給予450 mg·kg-1柳氮磺胺吡啶腸溶片；根據(jù)課題組前期預實驗結(jié)果及相關(guān)研究[7]，積雪草酸低劑量組給予3 mg·kg-1積雪草酸，積雪草酸高劑量組給予30 mg·kg-1積雪草酸；空白組及模型組給予等量生理鹽水，每天灌胃1 次，連續(xù)10 d。每日記錄小鼠體質(zhì)量、大便性狀及便血情況，并參照相關(guān)研究[6-7]進行疾病活動指數(shù)（DAI）評分。小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量明顯下降，DAI 顯著升高，小鼠糞便松散或稀便，同時出現(xiàn)糞便隱血或肉眼血便，則表示模型建立成功。

1.5 標本采集及處理 末次給藥后，小鼠禁食不禁水12 h，以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，眼眶取血于抗凝EP 管中，室溫下以4 000×g離心10 min，分離血漿，保存于-80 ℃冰箱待檢。取血結(jié)束后，采用二氧化碳過量吸入處死小鼠，打開腹腔，分離結(jié)腸組織并測量長度。剪取結(jié)腸近端組織，固定于4%多聚甲醛溶液中，其余組織保存于-80 ℃冰箱。

1.6 結(jié)腸組織病理形態(tài)學觀察 取固定后的小鼠結(jié)腸組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制作切片并脫蠟；根據(jù)試劑盒說明書步驟進行HE、PAS 染色，在顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理情況并拍照。

1.7 ELISA 法檢測小鼠血漿中炎癥細胞因子水平將“1.5”項下保存的血漿解凍后，嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟操作，檢測炎癥細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β 水平。

1.8 RT-qPCR 法檢測小鼠結(jié)腸組織中MUC2、claudin-1、occludin、ZO-1 mRNA 表達 采用碧云天總RNA 試劑盒提取各組小鼠結(jié)腸組織總RNA并檢測其純度，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；PCR 反應(yīng)條件：預變性94 ℃、3 min，變性94 ℃、30 s，退火55 ℃、30 s，延伸72 ℃、1 min，共30 個循環(huán)。分析擴增曲線并計算Ct 值，以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量，實驗重復6 次。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.9 Western Blot 法檢測小鼠結(jié)腸組織中MUC2蛋白表達 取小鼠結(jié)腸組織稱定質(zhì)量，加入RIPA 裂解液（1% PMSF），冰上裂解30 min；以12 000×g離心10 min 后取上清，利用BCA 試劑盒定量蛋白濃度；每孔30 μg 蛋白量，加入5×SDS Loading buffer調(diào)整蛋白濃度；進行SDS-PAGE 電泳，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h；加入MUC2 一抗（1∶1 000），4 ℃下孵育過夜；TBST 洗膜4 次后，加入IgG-HRP 二抗（1∶10 000），室溫下孵育2 h；TBST 洗膜4 次后，進行ECL 顯影并采集圖像；使用ImageJ 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計算目的蛋白相對表達水平。

1.10 免疫組化法檢測小鼠結(jié)腸組織中claudin-1、occludin、ZO-1 表達 取小鼠結(jié)腸組織切片，脫蠟、修復，滴加3%過氧化氫后孵育10 min；PBS洗滌3 次后，用5% BSA 封閉；滴加claudin-1、occludin、ZO-1 一抗（1∶200），過夜孵育后PBS 洗滌3 次，加入二抗孵育1 h；加入DAB 液及蘇木素復染，脫水、封片，干燥后置于顯微鏡下觀察并拍照；使用Image-Pro Plus 6.0 圖像數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對結(jié)果進行積分光密度值（IOD/Area）分析。

1.11 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析；計量資料以均數(shù)± 標準差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 積雪草酸對UC 小鼠體質(zhì)量及DAI 評分的影響結(jié)果見圖1。與空白組比較，模型組小鼠的體質(zhì)量顯著下降（P＜0.01），DAI 評分顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，柳氮磺胺吡啶組及積雪草酸低、高劑量組小鼠的體質(zhì)量顯著增長（P＜0.01），DAI 評分顯著下降（P＜0.01）。結(jié)果表明，積雪草酸對DSS 誘導的UC 小鼠癥狀具有明顯改善作用。

圖1 積雪草酸對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量和疾病活動指數(shù)（DAI）評分的影響（±s，n=6）Figure 1 Effects of asiatic acid on the body mass and disease activity index（DAI） score in ulcerative colitis mice（±s，n=6）

2.2 積雪草酸對UC 小鼠結(jié)腸組織病理變化的影響結(jié)果見圖2。與空白組比較，模型組小鼠的結(jié)腸隱窩結(jié)構(gòu)嚴重喪失，黏膜下層水腫明顯，并伴有大量炎性浸潤（如圖2 黃色箭頭所示），杯狀細胞結(jié)構(gòu)破壞嚴重，數(shù)量大量減少。與模型組比較，柳氮磺胺吡啶組和積雪草酸高劑量組小鼠的結(jié)腸隱窩結(jié)構(gòu)恢復，黏膜水腫和炎性浸潤減輕，杯狀細胞結(jié)構(gòu)和數(shù)量均有明顯恢復；積雪草酸低劑量組小鼠的結(jié)腸隱窩結(jié)構(gòu)、炎性浸潤及杯狀細胞結(jié)構(gòu)和數(shù)量有一定程度改善。結(jié)果表明，積雪草酸對DSS 誘導的UC 小鼠結(jié)腸組織病理損傷具有明顯改善作用。

圖2 積雪草酸對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織病理變化的影響（×200）Figure 2 Effect of asiatic acid on pathological changes of colonic tissue in ulcerative colitis mice（×200）

2.3 積雪草酸對小鼠血漿炎癥細胞因子水平的影響結(jié)果見圖3。與空白組比較，模型組小鼠的血漿TNF-α、IL-6、IL-1β 水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，柳氮磺胺吡啶組和積雪草酸低、高劑量組小鼠的血漿TNF-α、IL-6、IL-1β 水平明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，積雪草酸可降低DSS 誘導的UC 小鼠炎癥因子水平。

圖3 積雪草酸對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠血漿炎癥細胞因子水平的影響（±s，n=6）Figure 3 Effect of asiatic acid on plasma inflammatory cytokines in ulcerative colitis mice（±s，n=6）

2.4 積雪草酸對UC 小鼠結(jié)腸組織MUC2、claudin-1、occludin、ZO-1 mRNA 表達的影響 結(jié)果見圖4。與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織MUC2、claudin-1、occludin、ZO-1 mRNA 表達顯著下調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，積雪草酸低、高劑量組小鼠結(jié)腸組織MUC2、claudin-1、occludin、ZO-1 mRNA 表達明顯上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 積雪草酸對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織MUC2、claudin-1、occludin、ZO-1 mRNA 表達水平的影響（±s，n=6）Figure 4 Effects of asiatic acid on the mRNA expression levels of MUC2，claudin-1，occludin and ZO-1 in colon tissue of ulcerative colitis mice（±s，n=6）

2.5 積雪草酸對UC 小鼠結(jié)腸組織MUC2 蛋白表達的影響 結(jié)果見圖5。與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織MUC2 蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，積雪草酸低、高劑量組小鼠結(jié)腸組織MUC2蛋白表達明顯上調(diào)（P＜0.05，P＜0.01）。

圖5 積雪草酸對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織MUC2 蛋白表達水平的影響（±s，n=6）Figure 5 Effect of asiatic acid on MUC2 protein expression level of colon tissue in ulcerative colitis mice（±s，n=6）

2.6 積雪草酸對UC 小鼠結(jié)腸組織claudin-1、occludin、ZO-1 表達的影響 結(jié)果見圖6。與空白組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織中claudin-1、occludin、ZO-1 陽性細胞表達顯著減少（P＜0.01）。與模型組比較，積雪草酸低、高劑量組小鼠結(jié)腸組織中claudin-1、occludin、ZO-1 陽性細胞表達明顯增加（P＜0.05，P＜0.01）。

3 討論

目前，潰瘍性結(jié)腸炎（UC）被認為是一種自身免疫性疾病，其治療策略以癥狀為中心，西醫(yī)常規(guī)用藥包括抗炎藥、免疫抑制劑和生物制劑等，但療效尚不能令人滿意，且存在藥物依賴、嚴重感染等潛在副作用[8]。因此，尋找有效的UC 治療藥物具有重要意義。中醫(yī)根據(jù)UC 特征將其歸屬為“痢疾”“腸澼”等范疇，認為濕熱蘊結(jié)于腸道為其主要病機，中醫(yī)藥在治療UC 方面具有獨特優(yōu)勢[9-10]。中藥積雪草具有清熱利濕、解毒消腫的功效[11]，積雪草酸是其主要有效成分之一[12]。多項研究[13-14]表明，積雪草酸能夠促進創(chuàng)面愈合，具有抗腫瘤、 降糖、 抗炎、抗菌等藥理作用，對多種炎癥性疾病具有治療作用。本研究發(fā)現(xiàn)，積雪草酸對DSS 誘導的UC 小鼠結(jié)腸組織損傷具有明顯改善作用，并能降低炎癥因子水平，改善UC 癥狀，可能成為潛在的UC 治療藥物。

腸道既是營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，也是人體主要的免疫器官，為抵抗病原微生物和保障機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)提供了先天性屏障[15]。腸黏膜屏障由腸上皮層及黏液層組成，是構(gòu)成腸屏障的物理基礎(chǔ)[16]。腸上皮層由腸上皮細胞、能夠合成及釋放黏蛋白的杯狀細胞、合成抗菌肽的Paneth 細胞、產(chǎn)生激素的腸嗜鉻細胞以及腸干細胞組成。黏液層位于腸上皮層的上方，主要由杯狀細胞分泌的黏蛋白和黏多糖組成，其中黏蛋白占主體部分，而黏蛋白主要由杯狀細胞分泌的MUC2 蛋白組成。腸黏膜屏障對于保持腸道完整性具有重要意義，同時也是防止過度免疫反應(yīng)引起腸道炎癥的關(guān)鍵[17]。腸黏膜屏障的破壞會造成腸道中細菌和毒素的易位，從而增加宿主細胞與腸道中細菌、毒素的接觸，而細菌的病理性侵襲和定植會進一步刺激機體的免疫反應(yīng)和多種細胞因子的分泌，促進炎癥的發(fā)展。上述過程與UC 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而黏液層的減少也是UC 患者最常見的病理特征之一[18]。本研究結(jié)果顯示，DSS 誘導的UC小鼠結(jié)腸組織中杯狀細胞結(jié)構(gòu)破壞且數(shù)量減少，MUC2 蛋白表達明顯下調(diào)；而給予積雪草酸干預后，小鼠結(jié)腸組織中的杯狀細胞結(jié)構(gòu)和數(shù)量明顯恢復，MUC2 mRNA 及蛋白表達明顯上調(diào)；提示積雪草酸可能通過保護腸黏膜層對UC 小鼠產(chǎn)生保護作用。

腸上皮細胞通過緊密連接蛋白連接，可防止離子、小分子和細菌等自由穿過[18]。細胞間緊密連接蛋白對維持腸上皮層的通透性至關(guān)重要，并且對腸黏膜屏障功能起著決定性作用。緊密連接蛋白主要有跨膜蛋白和胞質(zhì)支架蛋白2 類，claudin-1 和occludin為2 種跨膜蛋白，具有調(diào)節(jié)細胞間通透性的作用[19]。ZO-1 是一種胞質(zhì)支架蛋白，主要調(diào)節(jié)細胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)運及上皮細胞的極性[20]。臨床研究[21]顯示，在UC 患者中觀察到claudin-1、occludin 和ZO-1 表達下調(diào)，并與疾病程度呈負相關(guān)。上調(diào)緊密連接蛋白的表達有助于保持腸道黏膜屏障的結(jié)構(gòu)完整性，從而預防UC 發(fā)生[22]。本研究結(jié)果顯示，DSS 誘導的UC 小鼠結(jié)腸組織claudin-1、occludin 和ZO-1 表達明顯下調(diào)；而給予積雪草酸干預后，UC 小鼠結(jié)腸組織claudin-1、occludin 和ZO-1 表達明顯上調(diào)；提示積雪草酸可能通過保護腸上皮細胞間緊密連接，進而維持上皮屏障完整性。

綜上所述，積雪草酸對DSS 誘導的UC 小鼠結(jié)腸組織病理損傷具有明顯改善作用，可能與其上調(diào)MUC2 及緊密連接蛋白的表達，保護腸道黏膜屏障的完整性有關(guān)。