趙瑩，鄭秋含，張眾，潘志，王穎航 （.長春中醫(yī)藥大學，吉林 長春 307；.長春中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，吉林 長春 307）

類風濕關節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種病因未明的自身免疫性疾病[1]。RA 全球平均患病率為0.5%～1.0%，我國的發(fā)病率為0.42%[2-3]。RA 的發(fā)病機制復雜，涉及遺傳、環(huán)境、免疫紊亂、細胞因子等多方面，目前臨床尚無根治方法，多停留在抑制炎癥、緩解癥狀、延緩病情發(fā)展階段，且臨床治愈率較低[4]。探究RA 潛在的治療方法是近年來的研究熱點。

當歸補血湯始載于《內(nèi)外傷辨惑論》，由黃芪和當歸組成，用量比為5∶1，其中黃芪扶陽補氣、益氣補血，當歸活血補血，二者合用，氣血兩旺，對補氣生血有協(xié)同增效的作用[5]?，F(xiàn)代藥理學研究[6]表明，當歸補血湯具有抗炎、補氣生血、調(diào)節(jié)免疫等功能作用，在RA 的發(fā)生和發(fā)展中起關鍵作用。但目前當歸補血湯治療RA 的相關研究及報道較少，因此，本研究利用網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術(shù)結(jié)合實驗驗證，以揭示當歸補血湯治療RA 可能的作用機制，為后續(xù)的進一步研究及臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級健康雄性Wistar 大鼠42 只，體質(zhì)量（200±20）g，購自吉林省長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司，動物使用許可證號：SYXK（吉）2018-0014，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉）2011-0004，飼養(yǎng)于長春中醫(yī)藥大學動物實驗中心，溫度（23±2）℃，相對濕度（50±5）%。所有動物實驗按照長春中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會相關規(guī)定執(zhí)行，批準號：2021361。

1.2 藥物及試劑 當歸、黃芪，購自長春吉林大藥房，批號分別為：200407、28122068，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學蔡廣知副教授鑒定為正品；雷公藤多苷片，上海復旦復華藥業(yè)有限公司，國藥準字Z31020415，批號：20191204；氨基甲酸乙酯，天津百倫斯生物技術(shù)有限公司，批號：20190807；牛Ⅱ型膠原，美國Chondrex 公司，批號：220241；弗氏完全佐劑，美國Sigma 公司，批號：SLCJ4383；乙酸溶液，批號：20210309；基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrixmetalloproteinase-9，MMP9）抗體（批號：A0289）、HIF-1α 抗體（批號：A11945）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGFA）抗體（批號：A5708），美國ABclo nal 公司）；GAPDH抗體，美國Bioworld 公司，批號：AP0063；Goat anti-Rabbit IgG（H＆L）-HRP，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：AF12114126；BCA 蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)公司，批號：120219200821；ECL 發(fā)光液，美國Beyotime 公司，批號：P0018AS。

1.3 儀器 165-8000 型電泳儀、170-3930 型轉(zhuǎn)膜儀，美國Bio-Rad 公司；FL1000 型智能成像系統(tǒng)，美國Thermo Fisher Scientific 公司；3H16RI 高速冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.4 網(wǎng)絡藥理學分析

1.4.1 當歸補血湯的活性成分和潛在靶點的獲取和篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）檢索當歸、黃芪的活性成分和潛在靶點[7]。以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-Likeness，DL）≥0.18 為條件篩選，去重。通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫（http://www. Uniprot.org/）進行標準化處理，最終確定當歸補血湯的活性成分和潛在靶點[8]。

1.4.2 RA 疾病相關靶點及藥物-疾病共同靶點的獲取利用DisGeNET（http://www.Dis Ge NET.org/home/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca）和TTD（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd） 數(shù) 據(jù) 庫 以 “Rheumatoid Arthritis”為檢索詞條，獲取RA 疾病靶點[9-11]。將獲取的靶點進行合并、去重，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫將所得靶點進行標準化處理。將當歸補血湯潛在靶點與RA 疾病靶點導入Venny 2.1.0 平臺（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny），獲得兩者的交集靶點。

1.4.3 構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡圖將藥物、藥物的活性成分、疾病以及藥物與疾病的交集靶點之間的相互對應關系導入Cytoscape 3.6.1 軟件中，構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡圖，并進行相關拓撲學分析。在此網(wǎng)絡圖中，節(jié)點（node）代表藥物、活性成分、疾病和交集靶點；邊（edge）代表藥物的活性成分、疾病與其作用靶點之間的關系；與節(jié)點直接相連的其他節(jié)點的數(shù)目稱為該節(jié)點的度值（degree），節(jié)點的度值越大，該節(jié)點所代表的活性成分或者靶點在交集網(wǎng)絡中越重要。通過該網(wǎng)絡圖可進一步明確當歸補血湯治療RA 的核心活性成分。

1.4.4 構(gòu)建當歸補血湯與RA 交集靶點的蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡圖 將當歸補血湯與RA 的交集靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org）[12]，物種設置為“Homo sapiens”，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡圖。通過Cytoscape 3.6.0 軟件中“CytoNCA”插件分析拓撲網(wǎng)絡的度值（Degree Centrality，DC）、介數(shù)中心性（Betweenness Centrality，BC）、接近中心性（Closeness Centrality，CC）、特征向量中心性（Eigenvector Centrality，EC），將高于各值中位數(shù)的靶點定義為當歸補血湯治療RA 的核心作用靶點。

1.4.5 GO 與KEGG 富集分析 將當歸補血湯與RA的交集靶點導入DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）[13]，進行基因功能注釋（Gene Ontology，GO）和京都基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，并使用微生信網(wǎng)站繪制氣泡圖和條形圖。

1.4.6 當歸補血湯核心活性成分與核心靶點的分子對接 將當歸補血湯主要活性成分與核心靶點進行分子對接，首先通過PubChem 數(shù)據(jù)庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得化合物的SDF 格式文件，使用Chem3D 軟件對結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化并獲得3D 結(jié)構(gòu)的mol2格式文件。通過PDB 數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/pdb）獲得核心靶點的受體蛋白VEGFA（PDB：1BJ1）、HIF-1α（PDB：1H2K）、MMP9（PDB：1GKC），使用PyMOL 2.5 軟件對受體蛋白進行去除水分子和小分子配體。使用Auto Dock Tools 1.5.6 軟件對靶點的受體蛋白與配體化合物進行PDBQT 格式轉(zhuǎn)換。最后利用AutoDock Vina 1.1.2 進行分子對接并用PyMOL 2.5 進行可視化分析。

1.5 當歸補血湯治療RA 的體內(nèi)實驗驗證

1.5.1 藥物的配制、實驗分組、造模及給藥 當歸補血湯按原方黃芪與當歸5∶1 稱取，煎煮濃縮至水煎液濃度為含生藥量1.5 g·mL-1，即當歸補血湯高劑量組；同法制備當歸補血湯中（7.5 g·kg-1）、低（3.75 g·kg-1）劑量水煎液。42 只Wistar 大鼠按照隨機數(shù)字表分為空白組、模型組、雷公藤多苷組及當歸補血湯低、中、高劑量組，每組7 只。適應性飼養(yǎng)1 周后，在大鼠右后足趾皮內(nèi)注射0.1 mL 膠原乳劑，進行初次免疫。第7 天進行二次免疫，免疫方法與初次免疫方法相同，建立類風濕關節(jié)炎常用的膠原誘導性（CIA）模型[14]。二次免疫1 周后，雷公藤多苷組（9.45 mg·kg-1）及當歸補血湯低、中、高劑量組進行灌胃治療，空白組與模型組給予等量生理鹽水，每周記錄關節(jié)腫脹程度，周期為6 周。

1.5.2 大鼠關節(jié)炎指數(shù)（AI）評分 采用關節(jié)炎指數(shù)積分評價其關節(jié)炎癥程度。于初次免疫前觀察1 次，之后每周觀察1 次足爪腫脹情況，同時對足爪炎癥進行評分，采用5 分制的評分標準[15]。0 分，無皮膚紅腫關節(jié)癥狀；1 分，腳踝或足部發(fā)紅輕度腫脹；2 分，腳踝和足部發(fā)紅輕度腫脹；3 分，腳踝和足部發(fā)紅，踝關節(jié)和跖關節(jié)中度腫脹；4 分，整個踝關節(jié)、足部和足底紅腫嚴重。此外，出現(xiàn)尾部紅斑或前肢腫脹分別計0.5 分。關節(jié)炎嚴重程度由三位獨立觀察者目測評估，觀察者不知道實驗分組。

1.5.3 Western Blot 法檢測滑膜組織中相關蛋白表達水平 配制20%的氨基甲酸乙酯，按照7 mL·kg-1的劑量腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈取血后截取大鼠膝關節(jié)，用剪刀去除關節(jié)表面的皮膚和肌肉組織，取各組大鼠的關節(jié)滑膜組織并剪碎，分別加入RIPA裂解液提取蛋白，采用BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。制備12% SDS-PAGE 凝膠，上樣后進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，TBST 洗滌，4 ℃過夜孵育HIF-1α（1∶1 000）、VEGFA（1∶1 000）、MMP9（1∶1 000）及GAPDH（1∶2 000）一抗；次日TBST 洗滌，室溫搖床上孵育二抗（1∶1 000）1 h；TBST 洗膜，滴加化學發(fā)光液（ECL）顯色，采用ImageJ 圖像分析軟件分析各條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，對目的蛋白進行半定量分析。

1.5.4 統(tǒng)計學處理方法 通過SPSS 19.0 軟件進行分析，結(jié)果以均數(shù)± 標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One way ANOVA），兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 當歸補血湯的活性成分和潛在靶點 見表1。共獲取當歸補血湯活性成分17 個。黃芪對應靶點376 個、當歸55 個，去除重復靶點，最終獲得193 個當歸補血湯治療RA 的潛在靶點。

表1 當歸補血湯活性成分基本信息Table 1 Basic information of active components of Danggui Buxue Decoction

2.2 RA 的疾病靶點及藥物-疾病共同靶點 見圖1。在DisGeNET、DrugBank 和TTD 數(shù)據(jù)庫分別獲得RA疾病靶點2 723 個、594 個和147 個，進行合并、去重，最終共獲得2 883 個RA 疾病靶點。通過Venny 2.1.0 平臺共獲得129 個當歸補血湯治療RA 的作用靶點，即與綠色相交部分，其中黃芪治療RA 的可能靶點128 個，當歸治療RA 的可能靶點20 個。

圖1 當歸補血湯與類風濕關節(jié)炎（RA）交集靶點的韋恩（Venny）圖Figure 1 Venny diagram of intersection target of Danggui Buxue Decoction and rheumatoid arthritis（RA）

2.3“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡圖分析 通過“1.4.3”項下方法構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡圖，見圖2，并進行相關拓撲學分析。在此網(wǎng)絡圖中，共有149 個節(jié)點，426 條邊。其中紅色圓形節(jié)點表示RA，藍色菱形節(jié)點表示當歸補血湯治療RA 潛在作用靶點，綠色和黃色正方形節(jié)點表示黃芪、當歸，綠色和黃色正六邊形節(jié)點表示黃芪、當歸的活性成分。節(jié)點面積越大代表連接度值越大，其中度值最高的活性成分是HQ15 槲皮素（quercetin）。

圖2 當歸補血湯治療類風濕關節(jié)炎的“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡圖Figure 2 Network diagram of“drugs-active components-disease-target”of Danggui Buxue Decoction in the treamtent of rheumatoid arthritis（RA）

2.4 PPI 網(wǎng)絡分析和核心靶點篩選 通過“1.4.4”項下方法構(gòu)建當歸補血湯治療RA 的PPI 網(wǎng)絡圖（圖3），共有129 個節(jié)點、2 566 條邊。利用Cytoscape 3.6.0軟件中的“CytoNCA”插件進一步拓撲分析，獲得當歸補血湯治療RA 的AKT1、VEGFA、IL-6、HIF-1α和MMP9 等27 個核心靶點，見圖4。選取影響關節(jié)滑膜環(huán)境的VEGFA、HIF-1α 和MMP9 作為關鍵靶點進行后續(xù)研究。

圖3 當歸補血湯治療類風濕關節(jié)炎（RA）的PPI 網(wǎng)絡圖Figure 3 PPI network diagram of Danggui Buxue Decoction in treating rheumatoid arthritis（RA）

2.5 GO 功能與KEGG 通路富集分析 按“1.4.5”項下方法對當歸補血湯治療RA 的交集靶點進行GO富集分析，獲得生物過程（Biological Processes，BP）714 條、細胞組成（Cellular Components，CC）65 條、分子功能（Molecular Functions，MF）139 條。根據(jù)富集基因數(shù)量降序排序，選取每個類別的前10 條繪制條形圖進行可視化分析，見圖5。

圖5 當歸補血湯治療類風濕關節(jié)炎（RA）的GO 富集分析Figure 5 GO enrichment analysis of Danggui Buxue Decoction in treating rheumatoid arthritis（RA）

對當歸補血湯治療RA 的交集靶點進行KEGG 通路富集分析，獲得171 條通路，根據(jù)富集基因數(shù)量降序排序，選取富集基因數(shù)最多的前20 條，繪制氣泡圖，見圖6。結(jié)果主要涉及RA 中的PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、AGE-RAGE 信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）、白細胞介素17 信號通路（IL-17 signaling pathway）和腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）等。

圖6 當歸補血湯治療類風濕關節(jié)炎（RA）的KEGG 通路富集分析圖Figure 6 KEGG pathway enrichment analysis of Danggui Buxue Decoction in treating rheumatoid arthritis（RA）

2.6 當歸補血湯主要活性成分與核心靶點的分子對接結(jié)果 將當歸補血湯的關鍵活性成分槲皮素與核心靶點VEGFA、HIF-1α、MMP9 進行分子對接，結(jié)合能見表2。槲皮素與3 種核心靶點VEGFA、HIF-1α、MMP9 結(jié)合能值均＜-7.0 kcal·mol-1，說明具有強烈的結(jié)合活性，結(jié)合構(gòu)象穩(wěn)定。通過AutoDock Vina 1.1.2 和PyMOL 2.5 對槲皮素與核心靶點VEGFA、HIF-1α、MMP9 進行相互作用結(jié)合模式分析，見圖7。

圖7 槲皮素與核心靶點VEGFA、HIF-1α、MMP9 可視化分子對接模擬圖Figure 7 Visual simulation diagram for molecular docking of quercetin to core targets VEGFA，HIF-1 α，MMP9

表2 槲皮素與核心靶點VEGFA、HIF-1α、MMP9 的結(jié)合能Table 2 Binding energy of quercetin and core targets VEGFA，HIF-1 α，MMP9

2.7 當歸補血湯對CIA 大鼠關節(jié)炎評分的影響 結(jié)果如表3 所示，與空白組比較，自第2 周起，造模大鼠關節(jié)炎評分明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，自第3 周起，各給藥組大鼠關節(jié)炎評分開始呈逐漸降低趨勢，第3 周當歸補血湯高劑量組明顯降低（P＜0.05）；至第6 周，各給藥組的關節(jié)炎評分均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 當歸補血湯對膠原誘導性（CIA）大鼠關節(jié)炎評分的影響（±s，n=6）Table 3 Effect of Danggui Buxue Decoction on arthritis score of collagen-iduced arthritis（CIA） rats（±s，n=6）

表3 當歸補血湯對膠原誘導性（CIA）大鼠關節(jié)炎評分的影響（±s，n=6）Table 3 Effect of Danggui Buxue Decoction on arthritis score of collagen-iduced arthritis（CIA） rats（±s，n=6）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組雷公藤多苷組當歸補血湯低劑量組當歸補血湯中劑量組當歸補血湯高劑量組關節(jié)炎評分/分第2 周0 4.43±0.49**4.43±0.49**4.57±0.49**4.43±0.49**4.57±0.49**第3 周0 4.71±0.45**4.29±0.45 4.57±0.49 4.29±0.45 4.14±0.34#第4 周0 4.29±0.45**3.71±0.45##4.14±0.35 4.14±0.33 3.86±0.35#第5 周0 4.14±0.35**3.14±0.35##3.71±0.45 3.57±0.49#3.29±0.45##第6 周0 3.86±0.35**2.57±0.49##3.26±0.45#3.29±0.45##2.86±0.63##

2.8 當歸補血湯對CIA 大鼠滑膜組織中VEGFA、HIF-1α 和MMP9 蛋白表達水平的影響 結(jié)果見圖8，與空白組比較，模型組VEGFA、HIF-1α 和MMP9蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，雷公藤多苷組及當歸補血湯低、中、高劑量組VEGFA、HIF-1α 和MMP9 的蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.01）。

圖8 當歸補血湯對膠原誘導性（CIA）大鼠膝關節(jié)滑膜HIF-1α、VEGF、MMP-9 蛋白表達的影響（±s，n=6）Figure 8 The effect of Danggui Buxue Decoction on the protein expressions of HIF-1α，VEGF and MMP-9 in the knee synovium of CIA rats（±s，n=6）

3 討論

類風濕關節(jié)炎（RA）的主要病理特征為滑膜炎性細胞及炎性因子浸潤、滑膜細胞過度增殖、新生血管形成及軟骨和骨質(zhì)不可逆破壞[16-17]。VEGFA 是一種重要的促血管生成因子，可與滑膜血管內(nèi)皮上的受體結(jié)合，通過信號轉(zhuǎn)導，最終導致大量新生血管的產(chǎn)生，在RA 的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[18]。HIF-1α 是組織參與缺氧調(diào)控的重要核轉(zhuǎn)錄因子，在低氧條件下，胞內(nèi)HIF-1α 蛋白大量積聚，并從胞漿進入細胞核內(nèi)參與調(diào)控下游靶基因VEGFA 的轉(zhuǎn)錄過程，使VEGFA 表達上調(diào)，進而促進炎性細胞因子分泌、增加血管通透性、加速血管內(nèi)皮細胞增殖，導致血管翳形成，影響RA 的發(fā)病和病情進展[19-20]?；|(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metallopmteinases，MMPs）是降解細胞外基質(zhì)的一種鋅蛋白酶，可加重關節(jié)疼痛、腫脹、骨侵蝕和軟骨破壞等，其中MMP9 主要參與骨侵蝕[21]。最新研究[22]表明，VEGFA 能影夠響MMPs的表達，且VEGFA 在RA 關節(jié)液中的表達與MMP9的表達密切相關。因此，通過影響HIF-1α 及其下游靶基因VEGFA、MMP9 的表達，對控制RA 病情的發(fā)展和調(diào)節(jié)RA 病理過程起著重要作用。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學、分子對接技術(shù)和體內(nèi)動物實驗，對當歸補血湯防治RA 的潛在作用機制進行了初步探討，共篩選出當歸補血湯活性成分17 個、潛在靶點193 個，共涉及171 條主要的通路以及918 個生物過程。根據(jù)構(gòu)建“藥物-活性成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡圖推測出當歸補血湯治療RA 的主要活性成分包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等，其中槲皮素的連接度值最高。根據(jù)PPI 網(wǎng)絡與KEGG 通路富集分析得出當歸補血治療RA 涉及AKT1、VEGFA、IL-6、HIF-1α、MMP9 等多個核心靶點以及PI3KAkt、AGE-RAGE、TNF、MAPK 等多條信號通路。利用分子對接技術(shù)進行初步驗證，結(jié)果顯示當歸補血湯主要活性成分槲皮素與3 種核心靶點VEGFA、HIF-1α、MMP9 都有強烈的結(jié)合活性。初步表明當歸補血湯可通過調(diào)節(jié)VEGFA、HIF-1α、MMP9 的表達干預RA 的疾病進程，發(fā)揮抗RA 作用。

為進一步驗證上述觀點，本研究建立了類風濕關節(jié)炎常用的膠原誘導性（CIA）模型進行體內(nèi)實驗。研究結(jié)果顯示，當歸補血湯干預后的大鼠關節(jié)炎評分明顯降低，其關節(jié)腫脹度明顯改善。此外， Western Blot 結(jié)果顯示，CIA 大鼠關節(jié)滑膜組織中HIF-1α、VEGFA 和MMP9 蛋白表達明顯升高，給予當歸補血湯干預后，大鼠滑膜組織中HIF-1α 蛋白表達下降，對下游靶基因VEGF 的激活效應減弱，使VEGFA 表達降低，抑制新生血管的生成，減少血管內(nèi)皮細胞釋放NO，從而降低MMP9 蛋白表達，緩解關節(jié)炎大鼠的骨破壞，減輕關節(jié)的損傷，對RA 起到治療作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡藥理學分析當歸補血湯治療RA 的可能作用機制，并通過分子對接技術(shù)預測結(jié)合體內(nèi)實驗進行驗證。結(jié)果表明，當歸補血湯通過影響HIF-1α 及其下游靶基因VEGFA、MMP9的表達，抑制RA 血管翳的形成，防止骨破壞，從而對RA 起到治療作用。本研究僅對RA 發(fā)病過程中的核心靶點進行研究，與其相互交聯(lián)的信號通路有待進一步探索，可為后續(xù)研究方向提供參考依據(jù)。