區(qū)展龍，陳玉珍，葉嘉麗，陳曉蘭，盧影雪，張悅，涂興明（. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 5005；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 5005；.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 5078；.茂名市人民醫(yī)院，廣東 茂名 55000）

支氣管哮喘是由多種細(xì)胞包括嗜酸性粒細(xì)胞（Eosinophil granulocyte basophil，EO）、淋巴細(xì)胞（Lymphocyte， LYMP）、 中性粒細(xì)胞（neutrophil，NEUT）、氣道上皮細(xì)胞以及細(xì)胞組分參與的慢性氣道炎癥性疾病，同時(shí)伴有氣道上皮損傷和脫落，氣道壁增厚變硬及黏膜分泌旺盛，隨著病程的發(fā)展，最終可導(dǎo)致氣道重塑[1]。

目前，控制哮喘氣道炎癥的推薦藥物為糖皮質(zhì)激素，長期使用會(huì)導(dǎo)致較多的不良反應(yīng)限制了它的臨床使用。參貝北瓜顆粒是廣州白云山潘高壽藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的中成藥，由1994 年經(jīng)國家衛(wèi)生部批準(zhǔn)為首批中藥保護(hù)品種的參貝北瓜膏經(jīng)制劑工藝改良而成[2]。因其顆粒劑更有利于運(yùn)輸、貯存，可克服久置易霉敗變及利于吸收等優(yōu)點(diǎn)在臨床廣泛使用。組方中，君藥北瓜，補(bǔ)中益氣、調(diào)理腸胃，作為治療哮喘的民間驗(yàn)方在上海地區(qū)使用歷史悠久，在《上海市中藥飲片炮制規(guī)范》各版本均有記載。臣藥黨參，補(bǔ)中益氣、健脾益肺、和胃生津，祛痰止咳；南沙參，養(yǎng)陰清肺、益胃生津、化痰益氣。佐藥浙貝母，清熱化痰，散結(jié)解毒。使藥干姜，溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲[3]。多用于肺脾氣虛之咳嗽、痰多、氣短或乏力，相當(dāng)于西醫(yī)的慢性支氣管炎、支氣管哮喘和肺氣腫，可作為支氣管哮喘的輔助用藥或緩解期的預(yù)防用藥。

本研究采用卵清蛋白誘導(dǎo)SD 大鼠哮喘模型，與控制哮喘氣道炎癥的常用藥布地奈德作療效對比，探究參貝北瓜顆粒對支氣管哮喘大鼠氣道炎癥及肺組織病理學(xué)變化的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康SD 雄性大鼠40 只，SPF 級，2～3 周齡，體質(zhì)量（150±20）g，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物質(zhì)量合格證號：44005800013747，生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2018-0034，使用許可證號：SYXK（粵）2018-0001，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級動(dòng)物房，溫度：21～24 ℃，相對濕度：55%～65%，溫差≤3 ℃，壓差25 Pa，潔凈度：10 000 級，照明12 h，黑暗12 h。本研究經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號：20221029001。

1.2 藥物及試劑 參貝北瓜顆粒，廣州白云山潘高壽藥業(yè)股份有限公司，批號：2106001；吸入用布地奈德混懸液，四川普銳特藥業(yè)有限公司，批號：SA22013；卵清蛋白，美國Sigma 公司，Grade V，CAS：9006-59-1，批號：SLCH2414；大鼠卵蛋白特異性IgE ELISA 試劑盒，江蘇晶美生物科技有限公司，CAS：JM-02200R1，批號：202203；氫氧化鋁粉末，上海麥克林公司，CAS：21645-51-2，批號：C12879205。

1.3 儀器 海爾YS-10 雙泵霧化器，海爾股份有限公司；自制霧化箱（47.5 cm×35 cm×23.5 cm）；TDL5M-II 低速冷凍離心機(jī)，上海本昂科學(xué)儀器有限公司；RT-2100 酶標(biāo)分析儀，雷杜生命科學(xué)股份有限公司；XN-1000 血細(xì)胞分析儀，日本SYSMEX公司。

1.4 劑量設(shè)計(jì) 參照魏偉等主編的《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》第4 版[4]，參考實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體之間等效劑量折算方法，確定參貝北瓜顆粒的劑量為10 g·kg-1和20 g·kg-1，分別相當(dāng)于成人劑量的4 倍和8 倍。布地奈德的劑量為0.03 mg·kg-1，相當(dāng)于成人的日用量。

1.5 分組、給藥及模型復(fù)制 40 只SD 雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)分為空白組、模型組、布地奈德組及參貝北瓜顆粒高、低劑量組（簡稱參貝北瓜高劑量組和參貝北瓜低劑量組），共5 組，每組8 只。大鼠哮喘模型復(fù)制參照有關(guān)文獻(xiàn)方法[5-6]并略作改動(dòng)：除空白組外，其余組于第1 天和第14 天在大鼠四肢內(nèi)側(cè)皮下和腹腔注射致敏液（每毫升生理鹽水含OVA 100 mg 和氫氧化鋁粉末100 mg），每點(diǎn)0.2 mL，共1 mL。第21 天起采用1 % OVA 溶液連續(xù)霧化激發(fā)7 d，每日1 次，每次30 min。每次霧化激發(fā)前，空白組與模型組以生理鹽水霧化吸入30 min，布地奈德組以布地奈德霧化吸入30 min，參貝北瓜高、低劑量組以生理鹽水配制10 g·kg-1和20 g·kg-1的參貝北瓜溶液灌胃給藥。

1.6 哮喘臨床癥狀觀察 于霧化激發(fā)階段，詳細(xì)觀察并記錄大鼠的生長狀態(tài)、行為狀態(tài)、哮喘發(fā)作狀態(tài)，并對臨床癥狀和體征進(jìn)行量化評分。具體評分標(biāo)準(zhǔn)如下[7]：0 分，活潑安靜、被毛光滑、呼吸平穩(wěn)；1 分，被毛稍枯燥、呼吸平穩(wěn)、安靜少動(dòng)；2 分，被毛稍枯燥、呼吸稍促、抓撓面部；3 分，煩躁不安、呼吸急促、抓撓面部；4 分，驚恐吱叫、呼吸急促、弓背收腹、腹肌痙攣；5 分，精神萎靡、蜷縮不動(dòng)、被毛枯槁、點(diǎn)頭呼吸；6 分，倒地抽搐甚至死亡。

1.7 血清卵清蛋白特異性免疫球蛋白（OVA-IgE）含量測定 于末次霧化激發(fā)后24 h 內(nèi)，各組大鼠用2.0 mL·kg-1的戊巴比妥鈉行靜脈注射麻醉。腹主動(dòng)脈采血后離心（離心半徑8 cm，2 000 r·min-1，離心15 min），取上清液，-20 ℃保存，ELISA 法測定血清OVA-IgE 濃度。

1.8 支氣管肺泡灌洗液（BALF）的白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)測定 大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上，打開胸腔。鈍性分離并充分暴露氣管、主支氣管，暴露雙肺。于主氣管開一小橫切口，用剪斷針尖的10 mL 注射器針頭插入左肺主支氣管中，結(jié)扎固定，用5 mL 預(yù)冷的生理鹽水分3 次灌洗左肺，收集BALF 灌洗液，回收率達(dá)90%以上，4 ℃離心5 min（離心半徑8 cm，2 000 r·min-1），沉淀物于-20 ℃保存，備用于白細(xì)胞（white blood cell，WBC）分類計(jì)數(shù)的測定。EO 比率（%）=EO/WBC×100%。

1.9 肺組織病理學(xué)檢查 剪取大鼠完整右肺組織，取10%中性福爾馬林溶液適量灌注入內(nèi)，使肺組織完全浸泡于固定液內(nèi)。4 %多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制備厚度為3～5 μm 的切片，行蘇木精-伊紅（HE）和過碘酸雪夫（PAS）染色。顯微鏡下直觀觀察HE 染色結(jié)果，以炎性細(xì)胞浸潤程度（嗜酸性粒細(xì)胞為主）和支氣管上皮細(xì)胞損傷程度為評價(jià)指標(biāo)。采用Motic Digitab 2.0 軟件測量平均光密度值，作為PAS 染色陽性評價(jià)指標(biāo)。對兩者染色結(jié)果作量化評分，具體評分標(biāo)準(zhǔn)分別見表1、表2[8-9]。

表1 炎性細(xì)胞浸潤程度和支氣管上皮細(xì)胞損傷程度評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring criteria for the degree of inflammatory cell infiltration and bronchial epithelial cell injury

表2 平均光密度評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Scoring criteria of the average optical density

1.10 支氣管壁厚度（Wat）和平滑肌厚度（Wam）的測量 在光鏡下挑選有完整橫斷面的支氣管，采用圖像采集系統(tǒng)獲取圖像，參照相關(guān)文獻(xiàn)研究[10]以區(qū)分氣道各層結(jié)構(gòu)定義，以Image-Pro Plus 6.0 測量支氣管各部位面積，使基底膜周經(jīng)（Pbm）標(biāo)準(zhǔn)化，即Wat（μm2/μm）=（支氣管總面積-管腔面積）/基底膜周徑、Wam（μm2/μm）=（平滑肌外緣內(nèi)氣管面積-平滑肌內(nèi)緣內(nèi)氣管面積）/基底膜周徑。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)，采用GraphPad Prism 8 作圖，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀評分 結(jié)果見圖1-A。本研究中未出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡或嚴(yán)重急性喘息發(fā)作。與空白組比較，模型組大鼠均表現(xiàn)出呼吸急促、抓撓面部、弓背收腹且遺留屎尿較多等急性哮喘發(fā)作的典型臨床癥狀，癥狀評分明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，布地奈德組及參貝北瓜高、低劑量組，均可使大鼠哮喘癥狀有所緩解，癥狀評分均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）；與布地奈德組比較，參貝北瓜高劑量組與布地奈德組評分的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 參貝北瓜顆粒對支氣管哮喘大鼠臨床癥狀和血清OVA-IgE 水平的影響（±s，n=8）Figure 1Effect of Shenbei Beigua Granules on clinical symptoms and serum OVA-IgE in rats with bronchial asthma（±s，n=8）

2.2 參貝北瓜顆粒對哮喘大鼠血清中OVA-IgE 的影響 結(jié)果見圖1-B。與空白組比較，模型組大鼠血清中OVA-IgE 濃度明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，布地奈德組及參貝北瓜高、低劑量組均可使大鼠血清中OVA-IgE 濃度明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。但參貝北瓜高劑量組和參貝北瓜低劑量組效果不如布地奈德組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 參貝北瓜顆粒對BALF 中炎性細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的影響 結(jié)果見表3。與空白組比較，模型組大鼠各類炎性細(xì)胞，包括WBC、NEUT、LYMP、EO 及EO 比率均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，布地奈德組及參貝北瓜高、低劑量組均可使各類炎癥細(xì)胞數(shù)及EO 比率降低（P＜0.01），但參貝北瓜高劑量組和參貝北瓜低劑量組效果不如布地奈德組（P＜0.01）。

表3 參貝北瓜顆粒對支氣管肺泡灌洗液（BALF）中炎性細(xì)胞數(shù)的影響（±s，n=8）Table 3 Effect of Shenbei Beigua Granules on inflammatory cells in BALF（±s，n=8）

表3 參貝北瓜顆粒對支氣管肺泡灌洗液（BALF）中炎性細(xì)胞數(shù)的影響（±s，n=8）Table 3 Effect of Shenbei Beigua Granules on inflammatory cells in BALF（±s，n=8）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與布地奈德組比較，△△P＜0.01

組別空白組模型組布地奈德組參貝北瓜高劑量組參貝北瓜低劑量組劑量/（g·kg-1）--0.03 mg·kg-1 10 20 WBC/（×105·mL-1）4.93±0.35 18.10±1.04**7.60±0.39##11.83±0.66##△△14.32±0.56##△△NEUT/（×105·mL-1）1.48±0.10 6.73±0.36**2.43±0.14##4.23±0.26##△△5.24±0.18##△△LYMP/（×105·mL-1）0.99±0.05 6.02±0.07**1.82±0.05##3.23±0.06##△△4.23±0.07##△△EO/（×105·mL-1）0.48±0.05 3.83±0.10**0.90±0.10##1.78±0.12##△△2.52±0.11##△△EO 比率/%9.92±1.00 21.22±1.08**12.62±0.81##15.06±1.07##△△17.64±1.09##△△

2.4 參貝北瓜顆粒對大鼠肺組織病理學(xué)的影響 結(jié)果見圖2、圖3 和表4。光鏡下可見，空白組大鼠組織間未見炎性細(xì)胞浸潤，支氣管纖毛排列整齊，未見黏膜組織結(jié)構(gòu)紊亂、脫落或其他壞死跡象，單層柱狀上皮細(xì)胞呈完整的花環(huán)狀。支氣管內(nèi)無發(fā)現(xiàn)黏液過度分泌現(xiàn)象。與空白組比較，模型組大鼠支氣管上皮纖毛呈靜止、倒伏、粘連，大部分脫落甚至壞死，支氣管與伴行動(dòng)脈間的炎性細(xì)胞浸潤增多（P＜0.01），PAS 染色可見杯狀細(xì)胞增生明顯，黏液分泌旺盛，平均光密度評分明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，布地奈德組、參貝北瓜高劑量組、參貝北瓜低劑量組均可減輕炎性細(xì)胞浸潤和上皮細(xì)胞損傷，杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌有不同程度減少（P＜0.01）。參貝北瓜低劑量組與布地奈德組比較，其炎性細(xì)胞浸潤與上皮損傷程度的評分明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 參貝北瓜顆粒對支氣管哮喘大鼠氣道炎癥及肺組織病理變化的影響（HE 染色，×400）Figure 2 Effects of Shenbei Beigua Granules on airway inflammation and lung pathology in rats with bronchial asthma（HE staining，×400）

圖3 參貝北瓜顆粒對支氣管哮喘大鼠支氣管上皮杯狀細(xì)胞增生及其分泌的影響（PAS 染色，×400）Figure 3 Effects of Shenbei Beigua Granules on proliferation and secretion of rat bronchial epithelial goblet cells（PAS staining，×400）

表4 各組大鼠炎性細(xì)胞浸潤與上皮損傷程度評分及平均光密度比較（±s，n=8）Table 4 Comparison of inflammatory cell infiltration， the degree of epithelial injury and average optical density in rats of each group（±s，n=8）

表4 各組大鼠炎性細(xì)胞浸潤與上皮損傷程度評分及平均光密度比較（±s，n=8）Table 4 Comparison of inflammatory cell infiltration， the degree of epithelial injury and average optical density in rats of each group（±s，n=8）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與布地奈德組比較，△△P＜0.01

組別空白組模型組布地奈德組參貝北瓜高劑量組參貝北瓜低劑量組炎性細(xì)胞浸潤與上皮損傷程度評分/分0.50±0.54 6.00±1.07**2.38±0.92##2.88±0.99##4.50±1.31##△△平均光密度0.38±0.52 3.50±0.76**1.63±0.74##2.00±0.76##2.13±0.84##

2.5 支氣管壁各層厚度變化 結(jié)果見表5。與空白組比較，模型組Pbm、Wat、Wam 均有明顯增厚（P＜0.01，P＜0.05）。與模型組比較，布地奈德組、參貝北瓜高劑量組、參貝北瓜低劑量組的Wat 和Wam 厚度均明顯減少（P＜0.01）。與布地奈德組比較，僅發(fā)現(xiàn)參貝北瓜低劑量組Wat、Wam 的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表5 各組大鼠支氣管壁厚度（Wat）與平滑肌厚度（Wam）比較（±s，n=8）Table 5 Comparison of the thickness of bronchus wall（Wat）and smooth muscle（Wam）in rats of each group（±s，n=8）

表5 各組大鼠支氣管壁厚度（Wat）與平滑肌厚度（Wam）比較（±s，n=8）Table 5 Comparison of the thickness of bronchus wall（Wat）and smooth muscle（Wam）in rats of each group（±s，n=8）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與布地奈德組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別空白組模型組布地奈德組參貝北瓜高劑量組參貝北瓜低劑量組Pbm/μm 1 831.94±55.57 1 928.08±88.65*1 940.39±123.43 1 995.22±75.62 1 955.63±74.32 Wat/（μm2·μm-1）59.79±2.27 77.87±2.99**67.38±3.15##69.45±1.49##72.61±2.08##△△Wam/（μm2·μm-1）15.23±1.00 22.65±1.85**18.46±1.41##18.11±1.41##20.46±1.50##△△

3 討論

氣道炎癥作為哮喘的病理基礎(chǔ)，由于反復(fù)發(fā)作，支氣管黏膜上皮細(xì)胞表面纖毛出現(xiàn)倒伏、粘連、靜止、壞死和脫落，造成支氣管上皮細(xì)胞變性。受損的上皮細(xì)胞可釋放各種趨化因子、肽類和脂性介質(zhì)與其下的間質(zhì)細(xì)胞相互作用，導(dǎo)致上皮細(xì)胞病理性修復(fù)和再生，基底膜內(nèi)膠原組織沉積，支氣管壁和平滑肌變硬和增厚。上皮再生時(shí)，黏液性導(dǎo)管擴(kuò)張、杯狀細(xì)胞及黏液腺增生肥大、黏液化生，使黏液分泌亢進(jìn)，甚至在小支氣管內(nèi)形成黏液栓。本研究的病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物模型支氣管與伴行小動(dòng)脈間出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤，杯狀細(xì)胞增生明顯，黏液分泌過度，支氣管平滑肌和支氣管壁厚度增加。模型動(dòng)物在霧化激發(fā)過程中均出現(xiàn)呼吸加促、煩躁不安、抓撓面部、弓背收腹進(jìn)而逐漸俯伏在一起，取出動(dòng)物后可見遺留屎尿較多等急性哮喘發(fā)作的臨床癥狀，癥狀評分升高明顯，提示大鼠哮喘模型建立成功。

本研究中，參貝北瓜顆粒能緩解大鼠哮喘癥狀，減輕上皮細(xì)胞損傷及炎性細(xì)胞浸潤，抑制支氣管平滑肌及管壁厚度增加，杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌有所減少。作為評價(jià)哮喘氣道炎癥的特征物質(zhì)，OVAIgE 在機(jī)體多次受OVA 刺激時(shí)產(chǎn)生，并可活化多種炎性細(xì)胞，加重哮喘反應(yīng)[8]。本研究顯示，參貝北瓜顆粒能降低哮喘大鼠模型血清OVA-IgE 濃度，BALF中各類炎性細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞比例也有所下降，表明參貝北瓜顆?？梢杂行б种茪獾姥装Y。

綜上所述，參貝北瓜顆粒能有效抑制大鼠哮喘氣道炎癥，改善肺組織病理損傷，雖然總體療效不如布地奈德霧化治療，但相對于模型組，其治療效果依然具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.05）。本研究的不足在于，未對參貝北瓜顆粒的劑量依賴性作探究，因而未能得出療效最佳的有效劑量，有待今后作進(jìn)一步的研究。