任雅婷，劉丹，周東海，王新昌 （.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 005；.浙江時(shí)邁藥業(yè)有限公司，浙江 杭州 005；.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 0005）

干燥綜合征（Sjogren syndrome，SS）是一種由外分泌腺進(jìn)行性損傷導(dǎo)致其功能障礙，引起口、眼、鼻、咽、喉和陰道等主要黏膜表面干燥的慢性自身免疫性疾病[1]。目前干燥綜合征的病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確，西醫(yī)治療缺乏特異性靶向藥物[2-3]。本課題組王新昌教授認(rèn)為，干燥綜合征的中醫(yī)病因病機(jī)總屬氣虛、陰虧、血瘀為本，燥熱為標(biāo)，在治療上以益氣養(yǎng)陰祛瘀為總則，故選取生地黃、玄參、麥冬、石斛、白芍、黃芪、丹參、益母草8 味中藥組成益氣養(yǎng)陰祛瘀方。經(jīng)多年臨床觀察[4-9]顯示，其治療干燥綜合征的療效確切，能明顯改善患者口干、眼干等臨床癥狀，降低疾病活動(dòng)指數(shù)，減少糖皮質(zhì)激素使用量，調(diào)節(jié)性激素水平，改善患者唾液腺免疫微環(huán)境和分泌功能。但益氣養(yǎng)陰祛瘀方治療干燥綜合征的具體作用機(jī)制尚未得到明確闡釋，故本研究擬選取經(jīng)典的自發(fā)型干燥綜合征模型NOD 小鼠作為疾病模型來探討其作用機(jī)制，以期為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 8 周齡雌性NOD 小鼠30 只，SPF 級，體質(zhì)量（20±2）g，北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：110322220101356542，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008。動(dòng)物飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（浙）2021-0012。本實(shí)驗(yàn)已通過浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)審查，批準(zhǔn)號(hào)：20201109-07。

1.2 藥物及試劑 黃芪24 g（批號(hào)：210602）、石斛12 g（批號(hào)：190301）、生地黃24 g（批號(hào)：210601）、白芍12 g（批號(hào)：210601）、玄參15 g（批號(hào)：210601）、麥冬15 g（批號(hào)：200501）、丹參30 g（批號(hào)：200801）、益母草15 g（批號(hào)：201201），均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥劑科提供，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)王新昌教授鑒定均為正品。將上述藥材冷水浸泡1 h，常規(guī)煎煮2 次，每次1 h；2 次水煎液混合并過濾，經(jīng)水浴蒸發(fā)濃縮至生藥濃度1.11、2.22、4.44 g·mL-1。硫酸羥氯喹（陽性對照藥，批號(hào)：H19990263），上海上藥中西制藥有限公司，用單蒸水溶解為6 mg·mL-1。上述藥液均置于4 ℃冰箱保存。

PAGE 凝膠快速制備試劑盒（12.5%），上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，貨號(hào)：PG113 升級版；BCA 蛋白濃度測定試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：P0010；強(qiáng)效RIPA 裂解液、5×蛋白上樣緩沖液、 ECL 發(fā)光液，杭州弗德生物科技有限公司，批號(hào)分別為：FD009、FD002、FD8000；水通道蛋白5（AQP5）、毒蕈堿樣膽堿能受體3（M3R）、β-actin 上下游引物，由上海生工生物工程有限公司合成；Trizol 試劑，美國Thermo Fisher 公司，批號(hào)：15596018；cDNA 合成試劑盒、PCR 擴(kuò)增試劑盒，中國諾唯贊公司，批號(hào)分別為：FSQ-101、Q321-02；AQP5 兔多克隆抗體、β-actin 兔單克隆抗體、HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗，美國CST 公司，批號(hào)分別為：59558S、4970S、7074S；M3R 兔多克隆抗體，美國NOVUS 公司，批號(hào)：NBP2-19444；白細(xì)胞介素10（IL-10）檢測試劑盒、蘇木素、伊紅染液，杭州浩克生物科技有限公司，批號(hào)分別為：KE10008、HK2053、HK2051；干擾素γ（IFN-γ）檢測試劑盒，杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：70-EK280HS-96。

1.3 主要儀器 NX50 型冷凍切片機(jī)，美國Thermo Fisher 公司；紫外分光光度儀，美國PE 公司；低溫離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；Odssey 掃膜儀，美國LI-COR 公司；LightCycler 480 型實(shí)時(shí)定量PCR 儀，瑞士Roche 公司；Mini-PROTEAN Tetra 電泳槽、轉(zhuǎn)膜槽，美國Bio-Rad 公司；DYY-6C 型電泳儀電源，北京六一生物科技有限公司；數(shù)字病理切片掃描系統(tǒng)，日本濱松公司。

1.4 分組、給藥及取材 將30 只NOD 小鼠隨機(jī)分為5 組：模型組、西藥組（硫酸羥氯喹60 mg·kg-1）及益氣養(yǎng)陰祛瘀方低、中、高劑量組（11.147、22.295、44.590 g·kg-1），每組6 只。采用人與動(dòng)物體表面積折算法計(jì)算給藥劑量，益氣養(yǎng)陰祛瘀方低、中、高劑量相當(dāng)于臨床等效劑量的1/2、1、2 倍。各組小鼠每日灌胃給藥1 次，每次0.2 mL，連續(xù)給藥8 周；模型組給予同等體積單蒸水灌胃。末次給藥后，小鼠禁食24 h，眼球取血后，室溫下靜置30 min，以3 000 r·min-1（離心半徑為8 cm）離心10 min，分離血清，于-80 ℃保存?zhèn)溆?；小鼠脫頸處死，取雙側(cè)頜下腺，稱定質(zhì)量并記錄；將每只小鼠的一側(cè)頜下腺用4%多聚甲醛溶液固定，供HE 染色及免疫組化實(shí)驗(yàn)使用；另一側(cè)頜下腺裝入凍存管，于-80 ℃保存，用于Western Blot 及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測。

1.5 小鼠飲水量測定 分別于給藥后第0、4、8 周連續(xù)測量小鼠每日飲水量，以評價(jià)小鼠口干情況。計(jì)算：小鼠每日飲水量=（前1 日水瓶質(zhì)量-當(dāng)日水瓶質(zhì)量）/小鼠只數(shù)，連續(xù)測量7 d。

1.6 頜下腺器官指數(shù)測定 處死前稱定小鼠體質(zhì)量，分離小鼠雙側(cè)頜下腺并稱定其總質(zhì)量，計(jì)算：小鼠頜下腺指數(shù)=小鼠雙側(cè)頜下腺質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）。

1.7 頜下腺組織病理學(xué)觀察 取石蠟包埋的小鼠頜下腺組織，切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色后脫水、封片。使用數(shù)字病理切片掃描系統(tǒng)閱片和采集圖像，觀察頜下腺組織病理學(xué)變化并進(jìn)行灶性指數(shù)評分。計(jì)算每4 mm2的病灶數(shù)量即為灶性指數(shù)評分（FS）。

1.8 RT-qPCR 法檢測小鼠頜下腺組織AQP5、M3R mRNA 表達(dá)水平 使用Trizol 法提取小鼠頜下腺組織樣本總RNA；測定RNA 純度（OD260/OD280在1.8～2.0 之間），獲得RNA 濃度后使用試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；得到樣本cDNA 后上機(jī)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃、3 s，變性95 ℃、10 s，退火60 ℃、30 s，共循環(huán)40 次。實(shí)驗(yàn)得到每個(gè)基因的Ct值，以β-actin 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.9 Western Blot 法檢測小鼠頜下腺組織AQP5、M3R 蛋白表達(dá)水平 取小鼠頜下腺組織，稱定質(zhì)量，加入含有1% PMSF 的RIPA 裂解液；剪碎，置于冰上充分裂解30 min，以12 000 r·min-1（離心半徑8 cm）離心10 min；收集上清后用BCA 試劑盒定量蛋白濃度。通過SDS-PAGE 分離提取蛋白并用PVDF膜轉(zhuǎn)膜；采用5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h；加入一抗AQP5（1∶1 000）、M3R（1∶1 000）后4 ℃下孵育過夜；洗膜后加入二抗（1∶5 000），室溫下孵育2 h；采用ECL 法顯色，掃描；使用Image Lab 軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.10 免疫組化法檢測頜下腺組織AQP5 蛋白表達(dá)水平 取頜下腺組織石蠟切片，依次經(jīng)過二甲苯脫蠟，乙醇水化，0.1 mol·L-1檸檬酸鈉溶液（pH=6）修復(fù)，3%過氧化氫室溫下孵育10 min；以山羊血清封閉30 min，加入一抗AQP5（1∶100）后4 ℃下孵育過夜；室溫下二抗孵育10 min 后，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染；封片，采用數(shù)字病理切片掃描系統(tǒng)閱片和采集圖像；根據(jù)說明書判讀陽性結(jié)果，使用Image Scope 軟件進(jìn)行圖像分析，計(jì)算：陽性面積比值（%）=（陽性面積+強(qiáng)陽性面積）/（陰性面積+弱陽性面積+陽性面積+強(qiáng)陽性面積）×100%。

1.11 ELISA 法檢測血清IFN-γ、IL-10 含量 采用雙抗夾心ELISA 法檢測小鼠血清IFN-γ、IL-10 含量，檢測步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。將50 μL 不同梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品及稀釋5 倍后的血清樣本分別加入預(yù)先包被IFN-γ、IL-10 抗體的酶標(biāo)板上；再向每孔中加入100 μL 經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體，37 ℃下育溫1 h 后洗板5 次；向每孔中分別加入50 μL 顯色底物A、B，并在37 ℃下避光顯色；待標(biāo)準(zhǔn)品孔出現(xiàn)較明顯的藍(lán)色梯度時(shí)即加入終止液，立即在450 nm 波長下測定光密度（OD）值；IFN-γ、IL-10 含量與OD 值呈正相關(guān)，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及稀釋倍數(shù)計(jì)算樣本中IFN-γ、IL-10 的含量。

1.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 25.0 及GraphPad Prism 9.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 益氣養(yǎng)陰祛瘀方對NOD 小鼠飲水量的影響 結(jié)果見表2。給藥前，與模型組比較，益氣養(yǎng)陰祛瘀方低、中、高劑量組及西藥組NOD 小鼠的日飲水量無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；給藥第4、8 周，與模型組比較，益氣養(yǎng)陰祛瘀方低、中、高劑量組及西藥組NOD 小鼠的日飲水量均顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果表明，益氣養(yǎng)陰祛瘀方能夠改善NOD 小鼠的口干癥狀。

表2 益氣養(yǎng)陰祛瘀方（YP）對NOD 小鼠飲水量的影響（±s，n=6）Table 2 Effect of Yiqi Yangyin Quyu Prescription（YP）on the water intake in NOD mice（±s，n=6）

表2 益氣養(yǎng)陰祛瘀方（YP）對NOD 小鼠飲水量的影響（±s，n=6）Table 2 Effect of Yiqi Yangyin Quyu Prescription（YP）on the water intake in NOD mice（±s，n=6）

注：與模型組比較，**P＜0.01

組別模型組YP 低劑量組YP 中劑量組YP 高劑量組西藥組劑量/（g·kg-1）-11.147 22.295 44.590 60 mg·kg-1日飲水量/g給藥前5.007±0.243 4.836±0.206 4.854±0.317 4.929±0.301 4.821±0.267第4 周6.121±0.231 4.954±0.221**5.000±0.079**5.025±0.060**5.082±0.051**第8 周6.929±0.086 5.032±0.095**5.003±0.144**5.043±0.134**5.064±0.085**

2.2 益氣養(yǎng)陰祛瘀方對NOD 小鼠頜下腺指數(shù)的影響 結(jié)果見表3。與模型組比較，益氣養(yǎng)陰祛瘀方高劑量組和西藥組NOD 小鼠的頜下腺指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 益氣養(yǎng)陰祛瘀方（YP）對NOD 小鼠頜下腺指數(shù)及灶性指數(shù)評分的影響（±s，n=6）Table 3 Effects of Yiqi Yangyin Quyu Prescription（YP）on the salivary gland index and focal index score in NOD mice（±s，n=6）

表3 益氣養(yǎng)陰祛瘀方（YP）對NOD 小鼠頜下腺指數(shù)及灶性指數(shù)評分的影響（±s，n=6）Table 3 Effects of Yiqi Yangyin Quyu Prescription（YP）on the salivary gland index and focal index score in NOD mice（±s，n=6）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別模型組YP 低劑量組YP 中劑量組YP 高劑量組西藥組劑量/（g·kg-1）-11.147 22.295 44.590 60 mg·kg-1頜下腺指數(shù)/（mg·g-1）2.959±0.493 8 3.046±0.306 3 3.286±0.201 9 3.670±0.203 0*3.779±0.132 5*灶性指數(shù)評分/（個(gè)·mm-2）2.722±0.343 1.257±0.612**0.983±0.463**1.472±0.864**1.603±0.389**

2.3 益氣養(yǎng)陰祛瘀方對NOD 小鼠頜下腺組織病理變化的影響 結(jié)果見表3、圖1。模型組小鼠頜下腺淋巴細(xì)胞浸潤明顯并形成較多浸潤灶，腺管排列紊亂、周圍出現(xiàn)纖維化，腺泡萎縮、大小不一。與模型組比較，益氣養(yǎng)陰祛瘀方低、中、高劑量組及西藥組NOD 小鼠的頜下腺淋巴細(xì)胞浸潤情況得到明顯改善，浸潤灶數(shù)量明顯減少，灶性指數(shù)評分顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)果表明，益氣養(yǎng)陰祛瘀方能夠有效改善NOD 小鼠頜下腺的病理損傷。

圖1 益氣養(yǎng)陰祛瘀方對NOD 小鼠頜下腺組織病理變化的影響（HE 染色）Figure 1 Effects of Yiqi Yangyin Quyu Prescription on histopathological changes of salivary gland in NOD mice（HE staining）

2.4 益氣養(yǎng)陰祛瘀方對NOD 小鼠頜下腺組織AQP5、M3R mRNA 表達(dá)水平的影響 結(jié)果見表4。與模型組比較，益氣養(yǎng)陰祛瘀方中、高劑量組和西藥組NOD 小鼠頜下腺組織AQP5、M3R mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 益氣養(yǎng)陰祛瘀方（YP）對NOD 小鼠頜下腺組織AQP5、M3R mRNA 表達(dá)水平的影響（±s，n=6）Table 4 Effects of Yiqi Yangyin Quyu Prescription（YP）on the mRNA expressions of AQP5 and M3R in salivary gland of NOD mice（±s，n=6）

表4 益氣養(yǎng)陰祛瘀方（YP）對NOD 小鼠頜下腺組織AQP5、M3R mRNA 表達(dá)水平的影響（±s，n=6）Table 4 Effects of Yiqi Yangyin Quyu Prescription（YP）on the mRNA expressions of AQP5 and M3R in salivary gland of NOD mice（±s，n=6）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別模型組YP 低劑量組YP 中劑量組YP 高劑量組西藥組劑量/（g·kg-1）-11.147 22.295 44.590 60 mg·kg-1 mRNA 相對表達(dá)量AQP5 0.861±0.192 0.993±0.294 1.885±0.201**1.564±0.305*1.693±0.655*M3R 0.743±0.244 0.895±0.041 1.524±0.525*1.874±0.331**1.683±0.522*

2.5 益氣養(yǎng)陰祛瘀方對NOD 小鼠頜下腺組織AQP5、M3R 蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果見圖2。與模型組比較，益氣養(yǎng)陰祛瘀方低、中、高劑量組及西藥組NOD 小鼠頜下腺組織AQP5、M3R 蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，益氣養(yǎng)陰祛瘀方能夠有效上調(diào)NOD 小鼠頜下腺組織AQP5、M3R 蛋白表達(dá)水平。

圖2 益氣養(yǎng)陰祛瘀方（YP）對NOD 小鼠頜下腺組織AQP5、M3R 蛋白表達(dá)水平的影響（±s，n=6）Figure 2 Effects of Yiqi Yangyin Quyu Prescription（YP）on the protein expressions of AQP5 and M3R in salivary gland of NOD mice（±s，n=6）

2.6 益氣養(yǎng)陰祛瘀方對NOD 小鼠頜下腺組織中AQP5 蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果見圖3、表5。與模型組比較，益氣養(yǎng)陰祛瘀方低、中、高劑量組及西藥組NOD 小鼠頜下腺組織AQP5 蛋白表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖3 益氣養(yǎng)陰祛瘀方對NOD 小鼠頜下腺組織AQP5 蛋白表達(dá)水平的影響（免疫組化）Figure 3 Effect of Yiqi Yangyin Quyu Prescription on the protein expression of AQP5 in salivary gland of NOD mice（IHC）

表5 益氣養(yǎng)陰祛瘀方（YP）對NOD 小鼠頜下腺組織AQP5蛋白表達(dá)水平的影響（±s，n=6）Table 5 Effect of Yiqi Yangyin Quyu Prescription（YP）on the protein expression of AQP5 in salivary gland of NOD mice（±s，n=6）

表5 益氣養(yǎng)陰祛瘀方（YP）對NOD 小鼠頜下腺組織AQP5蛋白表達(dá)水平的影響（±s，n=6）Table 5 Effect of Yiqi Yangyin Quyu Prescription（YP）on the protein expression of AQP5 in salivary gland of NOD mice（±s，n=6）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別模型組YP 低劑量組YP 中劑量組YP 高劑量組西藥組劑量/（g·kg-1）-11.147 22.295 44.590 60 mg·kg-1 AQP5 陽性面積比/%42.604±3.398 56.776±2.707**55.240±4.538**54.467±6.473*55.079±7.676*

2.7 益氣養(yǎng)陰祛瘀方對NOD 小鼠血清IFN-γ、IL-10水平的影響 結(jié)果見表6。與模型組比較，益氣養(yǎng)陰祛瘀方中、高劑量組和西藥組NOD 小鼠的血清IFN-γ含量顯著降低（P＜0.01），益氣養(yǎng)陰祛瘀方低、中、高劑量組和西藥組NOD 小鼠的血清IL-10 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)果表明，益氣養(yǎng)陰祛瘀方能夠提高NOD 小鼠的免疫水平。

表6 益氣養(yǎng)陰祛瘀方（YP）對NOD 小鼠血清IFN-γ、IL-10水平的影響（±s，n=6）Figure 6 Effects of Yiqi Yangyin Quyu Prescription（YP）on the levels of IFN-γ and IL-10 in serum of NOD mice（±s，n=6）

表6 益氣養(yǎng)陰祛瘀方（YP）對NOD 小鼠血清IFN-γ、IL-10水平的影響（±s，n=6）Figure 6 Effects of Yiqi Yangyin Quyu Prescription（YP）on the levels of IFN-γ and IL-10 in serum of NOD mice（±s，n=6）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別模型組YP 低劑量組YP 中劑量組YP 高劑量組西藥組劑量/（g·kg-1）-11.147 22.295 44.590 60 mg·kg-1 IFN-γ/（pg·mL-1）98.325±15.432 85.579±11.810 64.995±5.439**59.827±9.403**65.109±7.571**IL-10/（pg·mL-1）31.705±9.028 39.792±2.572*40.914±7.827*50.612±5.546**50.177±6.723**

3 討論

根據(jù)干燥綜合征的臨床表現(xiàn)，中醫(yī)將其歸于“燥痹”范疇?！端貑枴ぶ琳嬉笳摗吩唬骸霸飫賱t干”，先天稟賦不足者傷于內(nèi)外燥邪，致使氣血津液受損，出現(xiàn)口干、眼干、低熱、乏力等癥狀；氣虛津虧者血行不暢，發(fā)為血瘀，故肌膚枯澀，肢節(jié)疼痛，血瘀又致氣津的生成與輸布異常，“氣虛”“陰虧”“血瘀”三者相互膠著，導(dǎo)致疾病更甚，纏綿難愈，久病則臟腑受損[10]。益氣養(yǎng)陰祛瘀方是本課題組基于中醫(yī)對干燥綜合征的認(rèn)識(shí)而擬定的經(jīng)驗(yàn)方，方中黃芪補(bǔ)氣升陽、生津養(yǎng)血，丹參、益母草、白芍活血養(yǎng)血、祛瘀通經(jīng)?！皻鉃檠畮?，血為氣之母”，氣能生血、行血、攝血，血能養(yǎng)氣、載氣，方中益氣祛瘀雙法并用，益氣則營血調(diào)達(dá)，祛瘀則血行氣行；且“水化于氣”，氣能生津、行津、攝津，益氣則精微得以化生，津液輸布全身；再配養(yǎng)陰之品生地黃、玄參、麥冬、石斛潤燥生津，諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)陰祛瘀之功，則燥證自愈。

干燥綜合征的唾液腺免疫微環(huán)境異常是導(dǎo)致其分泌功能下降而造成口干的最主要原因，調(diào)節(jié)唾液腺局部免疫、炎癥反應(yīng)可以改善其分泌功能[10]。研究[11-13]發(fā)現(xiàn)，AQP5、M3R 與唾液腺分泌功能密切相關(guān)。AQP5 是分布于唾液腺腺泡細(xì)胞的水通道蛋白，參與唾液的分泌、吸收及滲透[12]。M3R 是一種G 蛋白耦聯(lián)的乙酰膽堿受體，在乙酰膽堿刺激下，能增加唾液腺腺泡細(xì)胞內(nèi)的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)，激活氯離子通道，介導(dǎo)AQP5 從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞頂端質(zhì)膜，從而增加唾液的分泌[13-14]。唾液腺損傷導(dǎo)致的分泌功能減退是干燥綜合征疾病過程中的重要病理特征。研究[15-16]表明，IFN-γ 和IL-10 是導(dǎo)致干燥綜合征唾液腺組織炎癥損傷的重要因素。IFN-γ 主要由Th1 細(xì)胞產(chǎn)生，與IFN-γ 受體結(jié)合后IFN-γ 信號(hào)基因被誘導(dǎo)激活，促進(jìn)炎癥和組織損傷[17]，間接影響AQP5、M3R 蛋白的表達(dá)。Zhou J 等[18]通過對實(shí)驗(yàn)小鼠頜下腺局部施以外源性IFN-γ 干預(yù)，導(dǎo)致唾液分泌功能受損，并伴隨AQP5 表達(dá)下調(diào)和抗M3R 自身抗體增加，而IFN-γ 中和則可顯著調(diào)節(jié)AQP5 表達(dá)，改善小鼠的唾液分泌功能。IL-10 是一種多效性細(xì)胞因子，由Treg 細(xì)胞產(chǎn)生，通過抑制Th1 細(xì)胞的極化、下調(diào)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生等方式發(fā)揮抗炎作用[19]。Jing J 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，與健康人群相比，原發(fā)性干燥綜合征患者的IL-10 和CD4+IL-10+T 細(xì)胞水平明顯降低。本課題組前期臨床研究[4-9]表明，益氣養(yǎng)陰祛瘀方對干燥綜合征患者的干燥癥狀治療效果顯著，能夠下調(diào)IgG、IgA 水平，降低TLR9、IFN-α 等炎癥因子表達(dá)，有效改善唾液腺血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)。本研究在前期基礎(chǔ)上，以NOD 小鼠為研究對象，進(jìn)一步探究了益氣養(yǎng)陰祛瘀方改善干燥綜合征唾液腺分泌功能與糾正整體免疫炎癥失調(diào)的相關(guān)機(jī)制。結(jié)果表明，益氣養(yǎng)陰祛瘀方能有效減少NOD 小鼠頜下腺淋巴細(xì)胞浸潤，降低灶性指數(shù)評分，改善頜下腺組織病理損傷，上調(diào)小鼠頜下腺AQP5 和M3R 的表達(dá)水平，同時(shí)降低血清中炎癥因子IFN-γ 水平，升高抗炎因子IL-10 水平，調(diào)整機(jī)體免疫炎癥平衡。

綜上所述，益氣養(yǎng)陰祛瘀方對干燥綜合征唾液腺損傷具有較好的治療作用，可以顯著減少頜下腺淋巴細(xì)胞浸潤，上調(diào)AQP5 和M3R 表達(dá)，增加水分子轉(zhuǎn)運(yùn)來恢復(fù)唾液分泌功能，進(jìn)而改善口干癥狀，同時(shí)降低血清炎癥因子水平，并提升抗炎因子表達(dá)，糾正整體免疫炎癥失調(diào)狀態(tài)。但由于干燥綜合征免疫機(jī)制復(fù)雜，益氣養(yǎng)陰祛瘀方發(fā)揮作用的明確上下游機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。