李亮，王珠強(qiáng)，胡瑩，戴衛(wèi)波，郭文賢，陳巧玲，王家賜（. 中山市中醫(yī)院老年病睡眠?？?，廣東 中山 5840；. 中山市中醫(yī)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，廣東 中山 5840）

失眠又稱入睡或維持睡眠障礙，表現(xiàn)為各種原因引起入睡困難、睡眠深度或頻度過(guò)短、早醒及睡眠時(shí)間不足或質(zhì)量差等[1]。長(zhǎng)期失眠會(huì)導(dǎo)致日間功能障礙（工作能力、認(rèn)知功能、精力下降），還可增加各種疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[2]。隨著社會(huì)發(fā)展，失眠人群呈逐年上升的趨勢(shì)，全球約有27%的人遭受睡眠病癥困擾[3]。許多化學(xué)合成的鎮(zhèn)靜催眠藥物如苯二氮?類受體激動(dòng)劑、褪黑素受體激動(dòng)劑等已被用于治療失眠，但其治標(biāo)不治本且副作用較大，尤其是長(zhǎng)效的鎮(zhèn)靜安眠藥，用后常有宿醉效應(yīng)，此外，化學(xué)合成藥物多具有耐受性和依賴性，突然停藥時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的失眠[3-4]。

失眠在中醫(yī)稱之為“不寐”，中醫(yī)藥治療失眠標(biāo)本兼顧，療效佳，不良反應(yīng)小，無(wú)耐受性和依賴性，故而近年來(lái)受到國(guó)人的青睞。中醫(yī)認(rèn)為失眠多因思慮憂郁、勞倦過(guò)度、心脾血虛、心腎不交或病邪干胃而胃不和等引發(fā)[5-6]。黃連溫膽湯出自清代的《六因條辨》，由黃連、法半夏、竹茹、枳實(shí)、陳皮、甘草、茯苓組成，功效清熱除煩，燥濕化痰，主治痰熱內(nèi)擾證，癥見(jiàn)失眠，眩暈虛煩，欲嘔，口苦，舌苔黃膩[7]。現(xiàn)代研究[8-12]發(fā)現(xiàn)黃連溫膽湯還可用于輔助治療慢性乙型肝炎、肝纖維化以及兒童多發(fā)性抽動(dòng)癥等。

有研究[13]表明5-HT1A/Gαi/o/cAMP 信號(hào)通路參與睡眠的調(diào)控，且該通路與改善中樞5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）障礙的機(jī)制有一定的相關(guān)性。本研究通過(guò)5-HT 合成抑制劑對(duì)氯苯丙氨酸（DL-4-Chlorophenylalanine，PCPA）誘導(dǎo)建立大鼠失眠模型，探討黃連溫膽湯治療失眠的作用及機(jī)制，為臨床推廣應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 雄性大鼠60 只，8 周齡，體質(zhì)量（200±10）g，購(gòu)于珠海百試通生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2020-0051，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：44822700001718。檢疫合格后飼養(yǎng)于中山市中醫(yī)院中藥藥理實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房（屏障環(huán)境），使用許可證號(hào)：SYXK（粵）2020-0109，飼養(yǎng)環(huán)境配備聚丙烯鼠籠，每籠飼養(yǎng)6 只，控制飼養(yǎng)溫度范圍22～24 ℃，濕度范圍45%～60%，12 h 明暗交替光照，換氣次數(shù)不少于每小時(shí)15 次全新風(fēng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中山市中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)：AEWC-2021020。

1.2 藥物及試劑 黃連溫膽湯由黃連10 g，法半夏10 g，竹茹10 g，枳實(shí)10 g，陳皮10 g，甘草5 g，茯苓10 g 組成，所有中藥飲片均由中山市中醫(yī)院中藥房提供，并由何鑒洪副主任中藥師鑒定為質(zhì)量合格的正品，以上中藥飲片用10 倍速量水煎2 遍，過(guò)濾合并2 次煎液，再濃縮成含生藥量1.17 g·mL-1的水煎劑，于4 ℃冷藏備用。PCPA，美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)：SHBL0057，用時(shí)取適量羧甲基纖維素鈉（Sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）與少量無(wú)水乙醇研磨至乙醇揮發(fā)干，再加適量PCPA 共研磨，最后加一定體積pH=7～8 的弱堿性生理鹽水（生理鹽水中滴入5%碳酸氫鈉水溶液，直至pH=7～8）研磨均勻，得到含0.1% CMC-Na 的35 mg·mL-1的PCPA 混懸液；地西泮片，天津力生制藥股份有限公司，批號(hào)：1810003，規(guī)格：2.5 mg/片，用時(shí)用超純水配成0.2 mg·mL-1的地西泮混懸液[14]；BCA 蛋白定量試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：122120210323；大鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glial fibrillary acidic protein，GFAP）、去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）、多巴胺（Dopamine，DA）、γ 氨基丁酸（Gamma aminobutyric acid，GABA）、谷氨酸（Glutamate，Glu）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、5-羥基吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid，5-HIAA）、環(huán)一磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）酶聯(lián)免疫試劑盒，上海撫生實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)分別為：20210801、20210802、20210803、 20210804、 20210805、 20210806、20210807、20210808、20210809；Gα（i）多克隆抗體，CST（上海）生物試劑有限公司，貨號(hào)：5290S，批號(hào)：3；Anti-5-HT1AReceptor 多克隆抗體，Abcam（上海）貿(mào)易有限公司，貨號(hào)：ab85615，批號(hào)：GR3396561；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）二抗Anti-rabbit IgG，CST（上海）生物試劑有限公司，貨號(hào)：7074P2，批號(hào)：1；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體，Affinity 抗體公司，貨號(hào)：AF7021，批號(hào)：857357W；異氟烷，友誠(chéng)生物科技有限公司，批號(hào)：445727。

1.3 儀器 YLS-1C 小動(dòng)物活動(dòng)記錄儀，濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司；JA-1203 電子天平，上海天平儀器廠； LUKYM-1 樣品冷凍研磨儀，廣州露卡測(cè)序儀器有限公司；臺(tái)式H1850R 高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司； MULTISKAN FC 酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo 公司； HGPN-50 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；2-16R 醫(yī)用離心機(jī)，湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司； Mini-Protean Tetra 小型垂直蛋白電泳系統(tǒng)、ChemiDocMP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，美國(guó)伯樂(lè)公司； TU-100 恒溫金屬浴，上海一恒科技有限公司； TS-1 脫色搖床，上海達(dá)姆實(shí)業(yè)有限公司； HYC-650 醫(yī)用冷藏箱、DW-40L508 電冰箱，海爾生物醫(yī)療股份有限公司；MDF-382E（N）醫(yī)用電冰箱，日本SANYO 公司。

1.4 分組、給藥及模型復(fù)制 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，第4 天將60 只大鼠隨機(jī)均分成5 組，即正常組、模型組、地西泮組及黃連溫膽湯低、高劑量組，每組各12 只。自第4 天開(kāi)始記錄各組大鼠體質(zhì)量變化情況。

黃連溫膽湯低、高劑量組大鼠第4 天至第19 天，連續(xù)16 d，于每日9∶00～10∶00 分別開(kāi)始灌胃給予5.85 g·kg-1、11.70 g·kg-1的黃連溫膽湯；正常組和模型組大鼠同步灌胃給予相應(yīng)體積蒸餾水；地西泮組大鼠第4 天至第19 天中前8 d 每日9∶00～10∶00 同步灌胃給予相應(yīng)體積蒸餾水，后8 d 則同步灌胃給予2 mg·kg-1的地西泮混懸液。上述黃連溫膽湯及地西泮的給藥劑量均參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》中60 kg成人常用臨床劑量與動(dòng)物等效劑量的換算方法而確定[15]。

第11 天至第13 天，除正常組外，各組大鼠連續(xù)3 d 于每天14∶30～15∶30 腹腔注射堿性生理鹽水配制的PCPA 混懸液（350 mg·kg-1）進(jìn)行模型復(fù)制，正常組則腹腔注射對(duì)應(yīng)體積含0.1% CMC-Na 的堿性生理鹽水[16-17]。第1 天模型復(fù)制24 h 后開(kāi)始觀察各組大鼠行為及狀態(tài)，并通過(guò)小動(dòng)物活動(dòng)記錄儀監(jiān)測(cè)各組大鼠活動(dòng)時(shí)間及總睡眠量。與正常組大鼠比較，其余組大鼠出現(xiàn)行為及狀態(tài)異常（即出現(xiàn)異常興奮、焦躁易怒、跳動(dòng)不安、來(lái)回疾走、攻擊性增強(qiáng)、彼此互相撕咬、體質(zhì)量減輕等異常行為及狀態(tài)），且出現(xiàn)晝夜節(jié)律消失，相比于模型復(fù)制前的白天活動(dòng)量增加、總睡眠量減少，提示模型復(fù)制成功[18-19]。

1.5 行為學(xué)評(píng)價(jià)（曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)） 第18 天，各組灌胃給藥后，采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)監(jiān)測(cè)，考察大鼠在陌生空曠環(huán)境中的焦慮度以及探索行為。將大鼠依次由同一角度置于50 cm×50 cm×50 cm的敞口空間中央?yún)^(qū)域（敞口空間被均分為4×4 的16 個(gè)方格，中央4 格為中央?yún)^(qū)域），敞口空間中央?yún)^(qū)域正上方為監(jiān)控拍攝設(shè)備，拍攝記錄每只大鼠5 min的活動(dòng)總時(shí)間、總距離以及在中心區(qū)活動(dòng)的總時(shí)長(zhǎng)，并用系統(tǒng)自帶軟件繪制相應(yīng)的熱感圖及軌跡圖[19]。整個(gè)監(jiān)測(cè)過(guò)程須保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境安靜，不可人為干預(yù)大鼠活動(dòng)。每完成1 只大鼠的監(jiān)測(cè)須清潔曠場(chǎng)區(qū)域，避免留下排泄物和氣味從而干擾下1 只大鼠的監(jiān)測(cè)結(jié)果。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 取材 第19 天記錄各組大鼠體質(zhì)量，末次給藥1 h 后，吸入異氟烷5 min 麻醉大鼠；再用5 mL采血管（非抗凝管）進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血；將含有血液的采血管置于冰上，靜置1 h 后，4 ℃、離心半徑8 cm、3 500 r·min-1低溫離心15 min，分離出血清，-80 ℃冰箱冷凍保存待測(cè)。大鼠脊椎脫臼法處死，取下全腦，稱質(zhì)量，并迅速剝離大鼠腦干和下丘腦，冰PBS沖洗，濾紙吸干后暫存于液氮中，最后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱冷凍保存待測(cè)。計(jì)算大鼠全腦系數(shù)（即全腦質(zhì)量與取材當(dāng)天大鼠體質(zhì)量的比值）。

1.6.2 ELISA 法檢測(cè)血清BDNF 和GFAP 水平 取出冰箱中的血清冰上解凍，用酶聯(lián)免疫試劑盒按照說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作，檢測(cè)血清中BDNF 和GFAP 的含量。

1.6.3 ELISA 法檢測(cè)腦干NE、DA、GABA 及Glu 水平 取出冰箱中的腦干冰上解凍，腦干按1 g∶10 mL加入PBS，加入鋼珠后于樣品冷凍研磨儀中。設(shè)置60 Hz、4 ℃、研磨60 s，將得到的勻漿液置于低溫離心機(jī)進(jìn)行離心。設(shè)置參數(shù)為4 ℃、離心半徑8 cm、4 000 r·min-1離心10 min，離心后收集上清液。嚴(yán)格按照BCA 蛋白定量試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)各個(gè)樣品上清液進(jìn)行蛋白定量。取適量蛋白定量后的樣品，通過(guò)ELISA 試劑盒檢測(cè)GABA 及Glu 水平，將蛋白定量得到的樣品總蛋白濃度值代入ELISA 試劑盒檢測(cè)出的指標(biāo)濃度結(jié)果，計(jì)算出樣品單位質(zhì)量總蛋白中GABA 及Glu 的水平，最后計(jì)算Glu/GABA 的值。再取適量蛋白定量后的樣品用PBS 將各個(gè)樣品濃度調(diào)整到統(tǒng)一濃度，通過(guò)ELISA 試劑盒檢測(cè)NE 及DA 水平。

1.6.4 ELISA 法檢測(cè)下丘腦5-HT、5-HIAA 及cAMP水平 取出冰箱中的下丘腦冰上解凍，切取一半，再參照“1.6.3”項(xiàng)下方法獲取樣品上清液進(jìn)行蛋白定量，再取適量蛋白定量后的樣品用PBS 將各個(gè)樣品濃度調(diào)整到統(tǒng)一濃度。通過(guò)ELISA 試劑盒檢測(cè)下丘腦中5-HT、5-HIAA 及cAMP 的水平。

1.6.5 Western Blot 法檢測(cè)下丘腦中5-HT1A受體蛋白和Gα（i）蛋白表達(dá)水平 取另一半下丘腦按1 g∶10 mL加入裂解液（裂解液由蛋白酶及磷酸酶混合抑制劑與RIPA 裂解液1∶50 配制），加入鋼珠后參照“1.6.3”項(xiàng)下的方法進(jìn)行勻漿、離心和BCA 蛋白定量操作；再用裂解液將各個(gè)蛋白樣品濃度調(diào)整到統(tǒng)一濃度。將得到的統(tǒng)一濃度的蛋白提取液按100 μL∶25 μL 加入蛋白上樣緩沖液，恒溫金屬浴98 ℃變性10 min；冰上冷卻，電泳，轉(zhuǎn)膜，PBST 漂洗后快速封閉液中室溫封閉15 min，PBST 漂洗，一抗（用抗體稀釋液稀釋1 000 倍）4 ℃孵育過(guò)夜；PBST 漂洗后用辣根過(guò)氧化物酶（HRP）二抗（用抗體稀釋液稀釋10 000 倍）室溫孵育2 h，PBST 洗膜3 次，每次10 min；滴加ECL 超敏發(fā)光液，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯影拍照，運(yùn)用ImageJ 軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值，以GAPDH 為內(nèi)參，對(duì)目的蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 選擇SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。由于各組數(shù)據(jù)均服從正態(tài)分布，故而可用單因素方差分析進(jìn)行組間差異分析。若方差齊，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)；方差不齊則采用Dunnett’s T3 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃連溫膽湯對(duì)失眠大鼠曠場(chǎng)活動(dòng)的影響 見(jiàn)圖1、表1。與正常組比較，模型組大鼠活動(dòng)總距離、總時(shí)間均明顯增加（P＜0.01），而中心區(qū)域持續(xù)時(shí)間明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，黃連溫膽湯各劑量組及地西泮組大鼠活動(dòng)總距離、總時(shí)間均明顯減少（P＜0.01），黃連溫膽湯高劑量組大鼠中心區(qū)域持續(xù)時(shí)間明顯增加（P＜0.01）。

表1 黃連溫膽湯對(duì)失眠大鼠曠場(chǎng)活動(dòng)的影響（±s，n=12）Table 1 Effects of Huanglian Wendan Decoction on open field activity in insomnia rats（±s，n=12）

表1 黃連溫膽湯對(duì)失眠大鼠曠場(chǎng)活動(dòng)的影響（±s，n=12）Table 1 Effects of Huanglian Wendan Decoction on open field activity in insomnia rats（±s，n=12）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

組別正常組模型組黃連溫膽湯低劑量組黃連溫膽湯高劑量組地西泮組劑量/（g·kg-1）--5.85 11.70 2 mg·kg-1總距離/m 9.97±0.82 17.05±1.65##6.35±0.48**3.29±0.27**5.92±0.45**總時(shí)間/s 92.73±8.96 147.14±9.45##73.38±4.66**42.53±3.21**63.38±5.35**中心區(qū)域持續(xù)時(shí)間/s 19.53±1.66 15.40±1.32##15.27±1.17 20.42±1.82**14.14±1.32

圖1 各組大鼠活動(dòng)熱感圖及軌跡圖Figure 1 Activity thermal semsation map and trajectory map of rats in each group

2.2 各組大鼠體質(zhì)量變化和全腦系數(shù) 見(jiàn)圖2、表2。除正常組外，其余各組大鼠模型復(fù)制成功后均連續(xù)3 d（第12～14 天）體質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，而正常組大鼠僅模型復(fù)制后第2 天（第12 天）體質(zhì)量下降，其余時(shí)間體質(zhì)量持續(xù)增長(zhǎng)。與正常組比較，模型組大鼠全腦系數(shù)明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，黃連溫膽湯高劑量組及地西泮組大鼠全腦系數(shù)明顯增高（P＜0.01）。

表2 黃連溫膽湯對(duì)失眠大鼠最終體質(zhì)量及全腦系數(shù)的影響（±s，n=12）Table 2 Effects of Huanglian Wendan Decoction on final body mass and whole brain coefficient of insomnia rats（±s，n=12）

表2 黃連溫膽湯對(duì)失眠大鼠最終體質(zhì)量及全腦系數(shù)的影響（±s，n=12）Table 2 Effects of Huanglian Wendan Decoction on final body mass and whole brain coefficient of insomnia rats（±s，n=12）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

組別正常組模型組黃連溫膽湯低劑量組黃連溫膽湯高劑量組地西泮組劑量/（g·kg-1）--5.85 11.70 2×10-3體質(zhì)量/g 292.00±6.54 270.00±14.90##269.90±17.58##270.00±10.40##262.00±13.95##全腦系數(shù)/（mg·g-1）6.47±0.16 6.04±0.36##6.10±0.43 6.46±0.36**6.61±0.36**

圖2 各組大鼠給藥干預(yù)期間體質(zhì)量變化情況Figure 2 Changes in body mass of rats in each group during drug intervention

2.3 黃連溫膽湯對(duì)失眠大鼠血清BDNF 和GFAP 水平的影響 見(jiàn)表3。與正常組比較，模型組大鼠血清BDNF 含量明顯下降（P＜0.01），而血清GFAP 含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃連溫膽湯低、高劑量組大鼠血清BDNF 含量明顯升高（P＜0.01），黃連溫膽湯低、高劑量組及地西泮組大鼠血清GFAP 含量明顯降低（P＜0.01）。

表3 黃連溫膽湯對(duì)失眠大鼠血清BDNF 和GFAP 水平的影響（±s，n=12）Table 3 Effects of Huanglian Wendan Decoction on serum BDNF and GFAP levels in insomnia rats（±s，n=12）

表3 黃連溫膽湯對(duì)失眠大鼠血清BDNF 和GFAP 水平的影響（±s，n=12）Table 3 Effects of Huanglian Wendan Decoction on serum BDNF and GFAP levels in insomnia rats（±s，n=12）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

組別正常組模型組黃連溫膽湯低劑量組黃連溫膽湯高劑量組地西泮組劑量/（g·kg-1）--5.85 11.70 2×10-3 BDNF/（ng·L-1）193.50±12.66 155.62±7.86##170.31±6.16**205.49±5.98**162.27±5.74 GFAP/（ng·L-1）948.64±41.36 1 288.89±43.39##1 158.91±32.86**1 049.48±67.92**946.24±39.36**

2.4 黃連溫膽湯對(duì)失眠大鼠腦干NE、DA、GABA、Glu 及Glu/GABA 水平的影響 見(jiàn)表4。與正常組比較，模型組大鼠腦干NE、DA、Glu 及Glu/GABA 水平均明顯升高（P＜0.01），而GABA 水平明顯降低（P＜0.01）。與模型組比較，黃連溫膽湯高劑量組及地西泮組大鼠腦干NE、DA、Glu 及Glu/GABA 水平均明顯降低（P＜0.01），而GABA 水平均明顯升高（P＜0.01）；黃連溫膽湯低劑量組DA 及Glu/GABA水平降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 黃連溫膽湯對(duì)失眠大鼠腦干NE、DA、GABA、Glu 及Glu/GABA 水平的影響（±s，n=12）Table 4 Effects of Huanglian Wendan Decoction on the levels of NE，DA，GABA，Glu and Glu/GABA in the brain stem of insomnia rats（±s，n=12）

表4 黃連溫膽湯對(duì)失眠大鼠腦干NE、DA、GABA、Glu 及Glu/GABA 水平的影響（±s，n=12）Table 4 Effects of Huanglian Wendan Decoction on the levels of NE，DA，GABA，Glu and Glu/GABA in the brain stem of insomnia rats（±s，n=12）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別正常組模型組黃連溫膽湯低劑量組黃連溫膽湯高劑量組地西泮組劑量/（g·kg-1）--5.85 11.70 2×10-3 NE/（ng·L-1）192.44±6.33 230.42±8.05##223.83±8.08 198.05±6.86**206.79±6.87**DA/（ng·L-1）88.30±4.30 110.60±2.83##102.45±3.00**96.37±4.28**91.26±3.22**GABA/（nmol·mg total protein-1）71.57±5.44 55.31±3.77##59.16±3.85 69.22±5.35**72.62±4.91**Glu/（nmol·mg total protein-1）21.83±1.28 30.24±2.08##29.20±1.63 25.52±2.23**25.80±2.42**Glu/GABA 0.31±0.03 0.55±0.05##0.49±0.03*0.37±0.03**0.36±0.04**

2.5 黃連溫膽湯對(duì)失眠大鼠下丘腦5-HT、5-HIAA及cAMP 水平的影響 見(jiàn)表5。與正常組比較，模型組大鼠下丘腦5-HT、5-HIAA 及cAMP 水平均明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，黃連溫膽湯低、高劑量組及地西泮組大鼠下丘腦5-HT、5-HIAA 及cAMP 水平均明顯升高（P＜0.01）。

表5 黃連溫膽湯對(duì)失眠大鼠下丘腦5-HT、5-HIAA 及cAMP 水平的影響（±s，n=12）Table 5 Effects of Huanglian Wendan Decoction on the levels of 5-HT，5-HIAA and cAMP in the hypothalamus of insomnia rats（±s，n=12）

表5 黃連溫膽湯對(duì)失眠大鼠下丘腦5-HT、5-HIAA 及cAMP 水平的影響（±s，n=12）Table 5 Effects of Huanglian Wendan Decoction on the levels of 5-HT，5-HIAA and cAMP in the hypothalamus of insomnia rats（±s，n=12）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

組別正常組模型組黃連溫膽湯低劑量組黃連溫膽湯高劑量組地西泮組劑量/（g·kg-1）--5.85 11.70 2×10-3 5-HT/（ng·L-1）281.86±8.83 175.52±7.51##207.03±6.72**239.88±10.41**240.17±9.84**5-HIAA/（ng·L-1）14.65±0.51 8.79±0.36##9.74±0.54**12.55±0.74**12.60±0.64**cAMP/（ng·L-1）84.12±2.28 53.78±3.29##59.18±1.97**67.84±2.57**67.83±3.94**

2.6 黃連溫膽湯對(duì)失眠大鼠下丘腦5-HT1A受體蛋白和Gα（i）蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)圖3、表6。與正常組比較，模型組大鼠下丘腦5-HT1A受體蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)（P＜0.01），Gα（i）蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，黃連溫膽湯低、高劑量組大鼠下丘腦5-HT1A受體蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），Gα（i）蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05，P＜0.01）；地西泮組大鼠下丘腦Gα（i）蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。

表6 黃連溫膽湯對(duì)失眠大鼠下丘腦5-HT1A 受體蛋白和Gα（i）蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Table 6 Effects of Huanglian Wendan Decoction on the expressions of 5-HT1A receptor protein and Gα（i）protein in the hypothalamu of insomnia rats（±s，n=3）

表6 黃連溫膽湯對(duì)失眠大鼠下丘腦5-HT1A 受體蛋白和Gα（i）蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Table 6 Effects of Huanglian Wendan Decoction on the expressions of 5-HT1A receptor protein and Gα（i）protein in the hypothalamu of insomnia rats（±s，n=3）

注：與正常組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別正常組模型組黃連溫膽湯低劑量組黃連溫膽湯高劑量組地西泮組劑量/（g·kg-1）--5.85 11.70 2×10-3 5-HT1A/GAPDH 2.41±0.46 1.13±0.28##1.81±0.33*1.95±0.27*1.61±0.43 Gα（i）/GAPDH 1.02±0.28 1.94±0.17##1.24±0.47*0.74±0.41**0.89±0.08**

圖3 各組5-HT1A受體蛋白和Gα（i）蛋白的表達(dá)Figure 3 Expressions of 5-HT1A receptor protein and Gα（i）protein in each group

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)黃連溫膽湯治療失眠的相關(guān)研究以臨床觀察為主，顯示其對(duì)痰熱內(nèi)擾型失眠患者療效明顯[20]，尚未見(jiàn)有體內(nèi)作用相關(guān)機(jī)制研究。雷勵(lì)飛等[21]采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，探討黃連溫膽湯治療失眠的作用機(jī)制，其研究顯示，黃連溫膽湯主要作用于神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合通路、NF-κB 信號(hào)通路等生物過(guò)程。

本研究采用腹腔注射對(duì)氯苯丙氨酸（PCPA）的經(jīng)典模型復(fù)制方法來(lái)制備失眠大鼠模型，以研究黃連溫膽湯對(duì)失眠大鼠的作用及作用機(jī)制。PCPA 是一種5-HT 合成抑制劑，可選擇性作用于色氨酸羥化酶，通過(guò)抑制酶活性，阻礙5-HT 合成，導(dǎo)致睡眠晝夜節(jié)律消失幾乎接近完全失眠；而5-HT 含量的減少，常伴有下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）功能障礙，故而可通過(guò)研究相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)水平的變化探討其相關(guān)作用機(jī)制[22]。本研究中模型復(fù)制所用試劑PCPA 用含0.1% CMC-Na 的堿性生理鹽水配制，因其可增加PCPA 的分散度，從而保證模型復(fù)制成功以及模型的均一性。

從本研究的行為學(xué)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在黃連溫膽湯的干預(yù)下，失眠大鼠在曠場(chǎng)中活動(dòng)總距離和總時(shí)間均減少，說(shuō)明黃連溫膽湯可以減輕失眠大鼠在曠場(chǎng)中的焦慮感；中心區(qū)域持續(xù)時(shí)間增加，表明黃連溫膽湯可在模型大鼠自發(fā)活動(dòng)和空間探索能力方面有促進(jìn)作用，增強(qiáng)了其對(duì)空間探索的興趣[23]。大鼠模型復(fù)制后體質(zhì)量的變化情況反映出模型復(fù)制較為成功。此外，PCPA 復(fù)制模型可引起全腦系數(shù)降低，而大鼠全腦系數(shù)的降低在一定程度上表明模型復(fù)制后的大鼠可能出現(xiàn)神經(jīng)元排列松散，細(xì)胞邊界模糊，并產(chǎn)生大量萎縮神經(jīng)元，繼而造成病理性損傷[22]，而黃連溫膽湯高劑量和地西泮均可減輕相應(yīng)損傷。由于缺少樣本及實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)等因素，本研究未進(jìn)行病理組織切片觀察及免疫組化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證上述結(jié)論，后期將進(jìn)一步考察驗(yàn)證。

BDNF 是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族的重要成員，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，具有促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育，防止神經(jīng)細(xì)胞損傷的功能，還可參與調(diào)節(jié)睡眠-覺(jué)醒穩(wěn)態(tài)；GFAP 為星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)志物，其含量增高代表星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增加，神經(jīng)元處于應(yīng)激損傷狀態(tài)。由本研究結(jié)果可知，黃連溫膽湯可提高失眠大鼠血清中BDNF 含量，降低GFAP 含量，表明黃連溫膽湯可通過(guò)調(diào)節(jié)血清中BDNF 與GFAP 含量來(lái)減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷，進(jìn)而改善睡眠。

腦干中線部位的中縫核主要投射至前腦，用于調(diào)節(jié)睡眠-覺(jué)醒狀態(tài)[24-25]。NE、DA、Glu 與GABA 是參與睡眠-覺(jué)醒機(jī)制的重要神經(jīng)遞質(zhì)，基中NE、DA 及Glu 為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，在維持覺(jué)醒中起著重要作用；GABA 為抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠的作用；Glu/GABA 比值調(diào)控神經(jīng)興奮與抑制平衡，故而常被用于研究和評(píng)估中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮和抑制狀態(tài)[26-27]。本研究結(jié)果表明黃連溫膽湯可通過(guò)降低失眠大鼠興奮性神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA 及Glu 含量以及Glu/GABA 比值，升高抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA 含量，從而調(diào)節(jié)失衡的神經(jīng)調(diào)制而促進(jìn)睡眠。

由于PCPA 是一種5-HT 合成抑制劑，故而本研究重點(diǎn)研究藥物干預(yù)對(duì)5-HT 及其相關(guān)通路的影響。5-HT 神經(jīng)元通過(guò)上行投射影響下丘腦高級(jí)中樞，下丘腦中5-HT 是參與睡眠-覺(jué)醒調(diào)節(jié)的重要組成部分；5-HIAA 是能反映5-HT 能神經(jīng)系統(tǒng)的活躍程度的代謝產(chǎn)物，下丘腦中5-HT 及5-HIAA 含量增加一定程度可降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮程度，而5-HT 含量降低是誘發(fā)大鼠失眠的重要因素之一[25，28]。目前已報(bào)道[29-30]的5-HT 受體有5-HT1-7R 七大類，其中5-HT1AR 與睡眠的關(guān)系最為密切，主要分布在動(dòng)物下丘腦、海馬、大腦皮層及杏仁核。5-HT1A受體蛋白屬于G 蛋白偶聯(lián)受體，5-HT1AR 偶聯(lián)Gα（i）（G 蛋白αi/o亞基），雙重調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶（Adenylate cyclase，AC）活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)環(huán)一磷酸腺苷（cAMP）量，影響大腦調(diào)節(jié)情緒、喚醒等功能[13，31]。故而可基于5-HT1A/Gαi/o/cAMP 信號(hào)通路，研究黃連溫膽湯對(duì)5-HT1A后信號(hào)通路的作用。從本研究結(jié)果看，實(shí)驗(yàn)中PCPA 失眠大鼠cAMP 含量明顯下降，且5-HT1A受體蛋白與cAMP 之間受損呈正相關(guān)性關(guān)系，而黃連溫膽湯可明顯升高5-HT1A受體蛋白和cAMP 的含量，降低Gα（i）含量，且這種改善作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此可見(jiàn)，黃連溫膽湯可能通過(guò)升高大鼠下丘腦5-HT 及5-HIAA 遞質(zhì)含量，上調(diào)5-HT1A受體蛋白表達(dá)，下調(diào)Gα（i）表達(dá)來(lái)發(fā)揮調(diào)節(jié)睡眠的作用。

綜上所述，黃連溫膽湯可能通過(guò)調(diào)控血清BDNF和GFAP 水平，腦干及下丘腦中各種神經(jīng)遞質(zhì)以及5-HT1A/Gαi/o/cAMP 信號(hào)通路來(lái)改善大鼠失眠癥狀，減輕大鼠焦慮及躁狂的狀態(tài)，激發(fā)大鼠自發(fā)活動(dòng)和空間探索能力。