李金龍

單核細(xì)胞是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組成,作為首道防線維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn),單核細(xì)胞具有異質(zhì)性。根據(jù)單核細(xì)胞表面標(biāo)志物的差異,將人類單核細(xì)胞分為經(jīng)典型、中間型、非經(jīng)典型3 個亞群［1］,將小鼠單核細(xì)胞分為Ly6Chi和Ly6Clo兩個亞群［2］。近年來發(fā)現(xiàn),單核細(xì)胞亞群比例失衡和功能失調(diào)是眾多炎癥相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的重要病理生理學(xué)基礎(chǔ)之一［3］。2007 年,Nahrendorf 等［4］第一次發(fā)現(xiàn)小鼠單核細(xì)胞不同亞群的比例在小鼠急性心梗后出現(xiàn)動態(tài)變化：Ly6Chi單核細(xì)胞比例在小鼠急性心梗后迅速增加,在第 3 d 達(dá)到高峰,隨后開始下降；后續(xù)研究顯示,急性心梗后繼發(fā)的Ly6Chi單核細(xì)胞增多與心梗后心室重塑和心功能惡化有關(guān)。Zhou 等［5］發(fā)現(xiàn)小鼠心肌梗死后第3 d 外周血 Ly6Chi單核細(xì)胞增加至70%以上,使用多粘菌素可降低炎癥反應(yīng)及Ly6Chi單核細(xì)胞比例。陳羽斐等［6］發(fā)現(xiàn)麝香保心丸通過減少循環(huán)中炎性單核細(xì)胞比例和斑塊中巨噬細(xì)胞含量,調(diào)控動脈粥樣硬化斑塊的炎癥反應(yīng)。然而,不同研究中報(bào)道的Ly6Chi單核細(xì)胞亞群的比例不盡相同,對于標(biāo)本的采集及處理也沒有統(tǒng)一的規(guī)范。本研究發(fā)現(xiàn),不同取血方式下流式細(xì)胞術(shù)測定小鼠外周血單核細(xì)胞亞群比例差異明顯,采用下頜靜脈叢取血方式與國內(nèi)外文獻(xiàn)多數(shù)報(bào)道最為接近。在涉及小鼠單核細(xì)胞亞群比例的研究中,應(yīng)采取一致的采血方式。

1 材料與方法

1.1 一般材料 選擇18 只6 周齡雄性C57BL/6J 小鼠,購自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。體重在14～17 g 之間,適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后進(jìn)行隨機(jī)編號。喂養(yǎng)環(huán)境：室溫25℃左右,每天日光燈給光12 h,相對濕度55%～65%?？笴D11b-PE、抗Ly6G-PerCP/Cy5.5、抗Ly6C-FITC 購自美國Sigma 公司。本研究通過濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審(N02021-Z021-11)。根據(jù)編號將小鼠隨機(jī)分為乙醚麻醉+下頜靜脈叢取血組、下頜靜脈叢取血組、乙醚麻醉+摘眼球取血組,每組6 只。三組小鼠一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。見表1。

表1 三組小鼠一般資料比較()

表1 三組小鼠一般資料比較()

注：三組比較,P＞0.05

1.2 方法

1.2.1 取血方法 三組小鼠通過相應(yīng)取血方式采取外周血。乙醚麻醉+下頜靜脈叢取血組：用剪刀剪掉小鼠頜下毛發(fā)。乙醚麻醉后用5 ml 注射器針頭垂直刺入下頜靜脈,取血0.2 ml,滴入含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝劑的 EP 管內(nèi),輕輕顛倒,使全血與抗凝劑混勻。下頜靜脈叢取血組：取血前不進(jìn)行乙醚麻醉,其余具體取血方法同乙醚麻醉+下頜靜脈叢取血組。乙醚麻醉+摘眼球取血組：乙醚麻醉后用消毒的鑷子摘取眼球后取血0.2 ml,滴入含有 EDTA 抗凝劑的 EP 管內(nèi),輕輕顛倒,使全血與抗凝劑混勻,后小鼠脫臼處死。

1.2.2 樣品制備 三組小鼠采取外周血后,在流式管中用同一微量移液器依次加入8.1 μl cell staining buffer、1.0 μl 抗Ly6G-PerCP/Cy5.5、0.7 μl 抗CD11b-PE、0.2 μl 抗Ly6C-FITC,然后加入30 μl 血液標(biāo)本,混勻,置于22℃暗箱中孵育15 min,孵育結(jié)束后加入紅細(xì)胞裂解液600 μl(提前30 min 從冰箱中取出恢復(fù)室溫),混勻后22℃暗箱孵育10 min,孵育結(jié)束,渦旋器渦旋后上機(jī)檢測［7］。

1.2.3 上機(jī)檢測 流式細(xì)胞儀先用裝有超純水的流式管清洗2 次,打開預(yù)先設(shè)定的程序,依次檢測標(biāo)本。側(cè)向散射光(side scatter,SSC)代表細(xì)胞的復(fù)雜性,以其為縱坐標(biāo),以Ly6G-PerCP/Cy5.5 熒光強(qiáng)度為橫坐標(biāo),不同種類的細(xì)胞將會以散點(diǎn)圖的形式出現(xiàn)在界面上。細(xì)胞被大致分為三群,Ly6G 主要表達(dá)于粒細(xì)胞表面,因此單核細(xì)胞存在于SSC 較低和Ly6G 熒光強(qiáng)度較弱的細(xì)胞群中,設(shè)門后將淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞去除。在下一步中,仍選擇SSC 為縱坐標(biāo),CD11b-PE 熒光強(qiáng)度為橫坐標(biāo),由于CD11b 主要在單個核細(xì)胞中表達(dá),因此CD11b 表達(dá)較強(qiáng)的單核細(xì)胞可被分離出來。選擇Ly6C-FITC 熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo),SSC 為橫坐標(biāo),根據(jù)Ly6C 熒光強(qiáng)度強(qiáng)弱的不同,即可顯示出不同亞群單核細(xì)胞的比例。在本實(shí)驗(yàn)中,將小鼠外周血單核細(xì)胞劃分為兩群,分別是Ly6Chi和Ly6Clo單核細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)分離單核細(xì)胞亞群的過程見圖1 所示。應(yīng)用FlowJo7.6.1 程序和CXP 程序分析每組數(shù)據(jù),得到各組不同單核細(xì)胞亞群的比例［7］。

圖1 小鼠外周血單核細(xì)胞亞群設(shè)門方法

1.3 觀察指標(biāo) 比較三組小鼠外周血Ly6Chi單核細(xì)胞亞群比例。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad8.3.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用單因素測量方差(one-way ANOVA)分析,組內(nèi)兩兩比較使用 Bonferroni 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

三組小鼠外周血Ly6Chi單核細(xì)胞亞群比例比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。乙醚麻醉+摘眼球取血組小鼠外周血Ly6Chi單核細(xì)胞亞群比例(60.1±1.4)%明顯高于乙醚麻醉+下頜靜脈叢取血組的(51.1±2.1)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。下頜靜脈叢取血組小鼠外周血Ly6Chi單核細(xì)胞亞群比例(57.1±1.5)%高于乙醚+下頜靜脈叢取血組的(51.1±2.1)%,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。乙醚麻醉+摘眼球取血組與下頜靜脈叢取血組小鼠外周血Ly6Chi單核細(xì)胞亞群比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組Ly6Chi 單核細(xì)胞亞群

3 討論

單核細(xì)胞作為一種重要的免疫細(xì)胞,來源于骨髓,在血液中循環(huán)數(shù)天,分化為巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞,參與病原微生物吞噬、抗原呈遞、T 細(xì)胞功能調(diào)節(jié)等重要過程,在無菌性及感染性炎癥疾病的生理病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用［8,9］。單核細(xì)胞具有異質(zhì)性,1989 年Ziegler-Heitbrock 利用單克隆抗體結(jié)合雙色流式細(xì)胞技術(shù),第一次證實(shí)人外周血中存在CD14+CD16-和CD14+CD16+兩種單核細(xì)胞亞群。目前人類單核細(xì)胞分為經(jīng)典型、中間型、非經(jīng)典型3 個亞群［10］,小鼠單核細(xì)胞分為Ly6Chi和Ly6Clo兩個亞群［11］。近年來,人們對不同單核細(xì)胞亞群在疾病中的作用開展了許多研究。

目前對于單核細(xì)胞亞群的分類主要基于流式細(xì)胞術(shù)。本研究發(fā)現(xiàn),在小鼠的單核細(xì)胞亞群研究中,不同的取血方式對相應(yīng)結(jié)果的測定有影響,會導(dǎo)致結(jié)果的偏倚。應(yīng)用乙醚麻醉小鼠后取下頜靜脈叢進(jìn)行測定Ly6Chi單核細(xì)胞的比例在51%左右,應(yīng)用乙醚麻醉小鼠后摘眼球取血測定值為60%左右,造成這種差別的原因可能與取血量以及應(yīng)激有關(guān)。麻醉狀態(tài)以及下頜靜脈取血相對創(chuàng)傷較小,而應(yīng)激狀態(tài)及特殊因素暴露均會引起單核細(xì)胞亞群表型的偏移。單核細(xì)胞在炎癥狀態(tài)下可以由骨髓遷移至外周,也可以分化為其他免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞,所以單核細(xì)胞長期處于動態(tài)平衡的狀態(tài),對周邊環(huán)境的變化反應(yīng)迅速。炎癥及多種趨化因子受體可控制單核細(xì)胞由骨髓遷移至外周,并分化為不同的單核細(xì)胞亞群。然而,目前尚不清楚不同單核細(xì)胞亞群之間的相互轉(zhuǎn)化的具體機(jī)制［12］。Nahrendorf 等［4］發(fā)現(xiàn)小鼠Ly6Chi單核細(xì)胞比例在小鼠急性心肌梗死后第3 天增加到高峰,隨后開始下降。高脂飲食會導(dǎo)致ApoE-/-小鼠Ly6Chi單核細(xì)胞明顯增加［13,14］。楊英杰等［15］發(fā)現(xiàn),4 Gy γ 射線照射小鼠后第3 天外周血Ly6C+亞群比例顯著升高至90%。此外,李子安等［16］發(fā)現(xiàn)不同的樣本保存方式會影響流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果。欒正云等［17］發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞亞群檢測分析時易受標(biāo)本放置時間的影響,標(biāo)本采集后應(yīng)盡快檢測,采集后4 g 內(nèi)對檢測結(jié)果影響不大。這都提示不同環(huán)境以及處理方式會影響單核細(xì)胞亞群比例的測定。

Blood 發(fā)表的單核細(xì)胞亞群分型的國際共識中并沒有界定小鼠各分型的具體比例。Nahrendorf 等［4］發(fā)現(xiàn)小鼠Ly6Chi單核細(xì)胞比例在小鼠急性心肌梗死后第3 天從基線值55%左右達(dá)到75%,國內(nèi)研究中,高脂飲食3 d 時C57BL/6J 小鼠Ly6Chi比例為40%［18］。楊英杰等［15］檢測到正常BALB/c 小鼠外周血Ly6C +亞群占總單核細(xì)胞比例約為55%,Ly6C +亞群的比例約為45%。張芯等［19］對C57BL/6J 腦梗小鼠模型以及向國安等［20］對小鼠矽肺模型的研究中,基線Ly6Chi亞群占總單核細(xì)胞比例約為55%和57%。對比本研究結(jié)果提示,在進(jìn)行小鼠外周血單核細(xì)胞亞群的實(shí)驗(yàn)研究中,下頜靜脈取血的結(jié)果與國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道最為接近。然而,本研究未能應(yīng)用流式分選技術(shù)將外周血 Ly6Chi單核細(xì)胞分離,進(jìn)一步研究不同取血方式導(dǎo)致結(jié)果差異的確切機(jī)制。

綜上所述,不同取血方式對小鼠外周血單核細(xì)胞亞群比例測定有差異,在涉及小鼠單核細(xì)胞亞群比例的研究中,應(yīng)采取一致的取血方式。