邊振遠(yuǎn), 王鑫宇, 張 成

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 普通外科,遼寧 沈陽 110016

結(jié)直腸癌是一種高度惡性腫瘤,其發(fā)病率和病死率分別排在腫瘤的第3位和第4位[1-2]。目前,針對(duì)結(jié)直腸癌的藥物治療手段比較缺乏,有待進(jìn)一步開發(fā)。有研究報(bào)道,組胺作為一種內(nèi)源性胺類物質(zhì),結(jié)合相應(yīng)的組胺受體可以作用于腫瘤細(xì)胞的增殖,目前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的組胺受體包括H1、H2、H3、H4型組胺受體4種,組胺通過與這些不同的受體結(jié)合會(huì)發(fā)揮不同的作用[3]。人HRH3基因定位于第20號(hào)染色體,編碼的蛋白由446個(gè)氨基酸組成[4]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),H3型組胺受體(H3 histamine receptor,H3HR)具有調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的作用[5]。有研究證實(shí),肝細(xì)胞肝癌、膽管細(xì)胞癌、黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤組織中的H3HR表達(dá)水平顯著增高[6-11]。本研究旨在探討H3HR在結(jié)直腸癌中的作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人結(jié)直腸癌組織和癌旁組織樣本來自于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院普通外科。胎牛血清購自Gibco公司;RPMI1640培養(yǎng)基及0.25%胰酶由課題組專業(yè)技術(shù)人員配置;二甲基亞礬購自SIGMA公司;酒精(無水乙醇、75%乙醇)購自天津市富宇精細(xì)化工有限公司;光學(xué)顯微鏡購自O(shè)LYMPUS,全自動(dòng)酶標(biāo)儀(BIO-RAD550)購自美國bio-rad公司,離心機(jī)購自Thermo;EDU試劑購自廣州銳博生物科技有限公司;H3HR干涉片段由吉瑪基因公司合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及干涉片段轉(zhuǎn)染 (1)組織樣本按照結(jié)直腸癌和癌旁組織分為10對(duì)。(2)將傳代好的人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116細(xì)胞分入siCtrl組和siH3HR組。siH3HR組接種細(xì)胞于6孔板中。用無血清培養(yǎng)基配制lip2000混合液,室溫靜置5 min;再用無血清培養(yǎng)基配制干涉片段混合液。將兩種混合液混勻后靜置25 min,分別加入到相應(yīng)的6孔板中,正常條件下培養(yǎng)(37℃,5%CO2),再進(jìn)行干涉片段的轉(zhuǎn)染。

1.2.2 EDU實(shí)驗(yàn) (1)接種細(xì)胞：將常規(guī)處理過的siCtrl組、siH3HR組細(xì)胞消化離心后以適宜密度種于24孔板中,于37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。(2)EDU標(biāo)記細(xì)胞：制備50 μm EDU培養(yǎng)基并加入24孔板中,孵育2 h后用PBS清洗。(3)細(xì)胞固定化：加入含4%多聚甲醛的PBS,室溫脫色搖床孵育30 min,然后用2 mg/ml甘氨酸溶液中和,繼續(xù)加入PBS清洗,清洗結(jié)束后加入含0.5%TritonX-100的PBS,室溫脫色搖床孵育10 min,最后用PBS清洗。(4)EDU反應(yīng)：于24孔板中加入1×Apollo?反應(yīng)液孵育30 min,然后加入含0.1%TritonX-100的PBS,重復(fù)2次,每次10 min。(5)DNA染色：配制適量1×Hoechst33342反應(yīng)液并加入24孔板中,避光孵育30 min,再用PBS清洗,重復(fù)2次,每次10 min。(6)熒光顯微鏡獲取圖像進(jìn)行分析。

1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) (1)接種細(xì)胞：將常規(guī)處理過的siCtrl組、siH3HR組細(xì)胞消化離心后種于6孔板中(密度為500個(gè)細(xì)胞),37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。接種細(xì)胞前用marker筆在6孔板背面畫線標(biāo)記。(2)細(xì)胞劃痕：用20 μl中槍頭垂直于孔板制造劃痕,再用無血清培養(yǎng)基清洗劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。(3)觀察拍照：加入無血清培養(yǎng)基,顯微鏡下觀察并拍照,記錄0、24、48 h的作用效果圖。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌和癌旁組織H3HR表達(dá)水平比較 在10對(duì)結(jié)直腸癌和癌旁組織中,結(jié)直腸癌組織中H3HR表達(dá)水平高于癌旁組織。見圖1。

2.2 H3HR干涉對(duì)siH3HR組、siCtrl組細(xì)胞增殖能力影響比較 H3HR干涉后,siH3HR組細(xì)胞增殖能力低于siCtrl組(P<0.05)。見圖2。

2.3 H3HR干涉對(duì)HCT-116細(xì)胞遷移能力影響 干涉降低H3HR表達(dá)后,HCT-116細(xì)胞遷移能力下降(P<0.05)。見圖3。

圖1 結(jié)直腸癌和癌旁組織H3HR表達(dá)水平比較(T表示腫瘤,N表示癌旁)

3 討論

HRH3可在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮調(diào)控作用[4,12]。Szabo等[12]發(fā)現(xiàn),腎上腺皮質(zhì)瘤中HRH3呈顯著高表達(dá)。Cricco等[13]報(bào)道,組胺可通過結(jié)合H3和H4型組胺受體對(duì)胰腺癌細(xì)胞的生長發(fā)揮調(diào)控作用。朱劍軍等[14]研究表明,H3HR通過調(diào)控偽足形成在結(jié)直腸癌中參與腫瘤遷移。惡性腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中均存在著高內(nèi)源性組胺,其可通過旁分泌或自分泌的方式釋放到細(xì)胞間隙中,從而作用于腫瘤發(fā)生和發(fā)展的各個(gè)階段。本研究中,Western Blot檢測結(jié)果顯示,結(jié)直腸癌組織中H3HR表達(dá)水平高于癌旁組織。這提示,組胺可能通過作用于H3HR調(diào)控結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,通過構(gòu)建H3HR表達(dá)干涉載體降低H3HR在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)后發(fā)現(xiàn),H3HR表達(dá)降低后,HCT-116細(xì)胞遷移能力下降(P<0.05)。這提示,在結(jié)直腸癌中,組胺通過H3HR促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

圖3 H3HR干涉對(duì)HCT-116細(xì)胞遷移能力影響

本研究存在一定的不足：僅在細(xì)胞系中進(jìn)行了干涉實(shí)驗(yàn),降低H3HR表達(dá)后,HCT-116細(xì)胞的增殖和遷移能力出現(xiàn)顯著下降,但對(duì)組胺通過H3HR產(chǎn)生促腫瘤增殖、遷移效應(yīng)的具體機(jī)制并未進(jìn)行深入研究。

綜上所述,H3HR與結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移相關(guān),這為以H3HR為靶點(diǎn)的結(jié)直腸癌藥物開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。