盧 菁,王 非,張京蘭

缺血性腦卒中早期起病隱匿,發(fā)病時病情進展迅速,多數(shù)病人遺留偏癱、認知障礙等,影響病人身心健康[1-2]。神經(jīng)炎癥認為是缺血性腦卒中發(fā)生及病情進展過程中的關(guān)鍵病理因素,調(diào)控過度活躍的神經(jīng)炎癥是改善缺血性腦卒中神經(jīng)損傷的有效手段[3-4]。有研究表明,針灸可降低促炎細胞因子表達,抑制炎癥細胞激活和浸潤,減輕腦缺血/再灌注后的炎癥,促使受損神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)[5]。針刺腦卒中大鼠陽陵泉+配穴、關(guān)元、照海+申脈穴位,均可抑制炎癥及凋亡信號激活,減少神經(jīng)元凋亡數(shù)量[6]。針灸在缺血性腦卒中的臨床治療中亦具有明顯療效[7],但其分子機制尚未明確。有研究顯示,缺血性腦卒中病人血清miRNA-221-3p水平降低[8],上調(diào)miRNA-221-3p可抑制氧化應(yīng)激和神經(jīng)元凋亡,減輕帕金森病小鼠神經(jīng)元損傷[9]。C-C趨化因子受體5(C-C chemokine receptor 5,CCR5)是一種關(guān)鍵的神經(jīng)炎癥調(diào)控因子,其表達上調(diào)導(dǎo)致并維持持續(xù)的神經(jīng)炎癥,促使各種炎癥相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病進展。通過TargetScanHuman 7.2數(shù)據(jù)庫可見miR-221-3p與CCR5之間有結(jié)合位點,因此miR-221-3p/CCR5可作為缺血性腦卒中的潛在治療靶點[10]。本研究通過構(gòu)建缺血性腦卒中大鼠模型,觀察針灸調(diào)節(jié)miR-221-3p/CCR5軸對缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD雄性大鼠,約6周齡,購自廈門萬泰滄海生物技術(shù)有限公司[許可證號:SCXK(閩)2018-0002],無特定病原體(SPF)級,體質(zhì)量為(195±15)g,均喂養(yǎng)在本院動物房的飼養(yǎng)籠中,動物房條件:12 h/12 h(明/暗)交替、溫度(24.5±1.5)℃、濕度(55±5)%、噪聲≤80 dB,大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后用于實驗,并遵照3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 實驗試劑及儀器 miR-221-3p antagomir、miR-221-3p antagomir陰性對照、野生型CCR5 3′-UTR報告質(zhì)粒、miR-221-3p mimic、miR-221-3p mimic陰性對照、突變型CCR5 3′-UTR報告質(zhì)粒、miR-221-3p及U6、CCR5、GAPDH引物均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;三苯基氯化四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC,貨號T8170)、總RNA提取試劑盒(貨號R1200)、LipofectamineTM2000(貨號11668)、一步法實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(貨號T2210)、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(貨號D0010)購自北京索萊寶科技有限公司;蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(貨號ab245880)、大鼠白細胞介素(interleukin,IL)-10酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(貨號ab214566)、大鼠IL-17 ELISA試劑盒(貨號ab214028)、大鼠IL-18 ELISA試劑盒(貨號ab213909)均購自美國Abcam公司;大鼠海馬神經(jīng)元細胞(貨號CP-R107)、大鼠海馬神經(jīng)元細胞完全培養(yǎng)基(貨號CM-R107)購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

6805-D型電針儀購自四川科儀誠科技有限公司;XR-XY1032型大鼠Y迷宮購自上海欣軟信息科技有限公司;HB-800S型大鼠跳臺箱及記錄儀購自淮北軟隆生物科技公司;CM1950型冰凍切片機購自德國Leica公司;BD-SW50型生物光學(xué)顯微鏡購自深圳市博視達光學(xué)儀器有限公司;ND1000型酶標儀購自美國NanoDrop公司;CFX96 Touch Deep Well型熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司等。

1.3 方法

1.3.1 制備缺血性腦卒中大鼠模型及分組給藥 參照相關(guān)文獻[11]分離頸外動脈和頸總動脈后通過改良線栓法制備缺血性腦卒中大鼠模型,24 h后以Zea Longa分級法[12]對造模大鼠做神經(jīng)功能缺損評分,剔除評分為0分和4分的大鼠,將評分為1～3分的大鼠隨機分為模型組、針灸組、miR-221-3p antagomir組、miR-221-3p antagomir陰性對照組、針灸+miR-221-3p antagomir組,每組12只;另取12只SD大鼠只分離頸動脈,不結(jié)扎、不插線,作為假手術(shù)組。

miR-221-3p antagomir組、miR-221-3p antagomir陰性對照組、針灸+miR-221-3p antagomir組大鼠尾靜脈注射miR-221-3p antagomir及其陰性對照(劑量參照說明書設(shè)定),每周1次,共注射2次;假手術(shù)組、模型組和針灸組大鼠尾靜脈注射等劑量生理鹽水,每周1次,共注射2次;針灸組、針灸+miR-221-3p antagomir組大鼠參考《實驗針灸學(xué)》定位關(guān)元穴,設(shè)定電針儀電壓為2～4 V,脈沖寬度0.5 ms,頻率2/100 Hz,舒波4 Hz,行針以大鼠出現(xiàn)輕微顫抖為宜,留針30 min,每日針灸1次,連續(xù)針灸14 d[6]。

1.3.2 大鼠神經(jīng)功能損傷 各組大鼠在最后1次針灸治療后24 h進行神經(jīng)功能缺損評分。

1.3.3 大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 各組大鼠在神經(jīng)功能損傷后,以Y迷宮實驗和跳臺實驗測定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。Y迷宮實驗:將Y迷宮的新異臂以隔板遮擋,將大鼠自起始臂放入,訓(xùn)練其在Y迷宮中自由探索活動10 min,之后間隔4 h取下新異臂的隔板,將大鼠自起始臂放入Y迷宮,讓其在各個臂中自由探索活動,將大鼠5 min內(nèi)在各個臂中停留的時間及進入次數(shù)。跳臺實驗:跳臺裝置接通電源,將大鼠置于反應(yīng)箱中適應(yīng)訓(xùn)練5 min,間隔4 h后再次將大鼠放入接通電源的跳臺裝置反應(yīng)箱中,將首次錯誤跳臺的時間作為其潛伏期,之后記錄大鼠5 min內(nèi)犯錯次數(shù)。

1.3.4 大鼠腦梗死情況及標本采集 各組大鼠在學(xué)習(xí)記憶能力測定結(jié)束后進行乙醚麻醉,斷頭處死,解剖取出大腦,每組隨機選出6只大鼠的大腦進行冠狀面切片,切為大約等厚的5片,以TTC染液孵育后,拍照并采用Image J軟件對圖片分析得到腦梗死面積。每組剩余6只大鼠的大腦剪下約0.6 g存在液氮中備用;再次剪下約0.4 g加入生理鹽水研磨勻漿后離心,吸出上清后采用二喹啉甲酸法(BCA)試劑盒并參照說明書測定總蛋白濃度,分組標記好后保存于-80 ℃?zhèn)溆?剩余腦組織漂洗后以液氮冷凍,將凍好的組織塊置于冰凍切片機中進行常規(guī)病理切片備用。

1.3.5 大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài) 取出腦組織切片,每只大鼠選出有典型海馬結(jié)構(gòu)的3張復(fù)溫、固定后,以HE試劑盒并參照其說明書進行染色,采用光學(xué)顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)并隨機采集每張切片上3個視野。

1.3.6 大鼠腦組織IL-17、IL-18、IL-10水平 取出腦組織樣品液置于4 ℃冰箱中,提前緩慢解凍,采用大鼠ELISA試劑盒并參照說明書檢測IL-17、IL-18、IL-10水平。

1.3.7 大鼠腦組織miR-221-3p、CCR5 mRNA表達 取出保存于液氮中的腦組織,置于研缽中,加入總RNA提取試劑盒中的提取試劑,研磨后參照試劑盒說明書提取出各組大鼠腦組織中總RNA,之后使用一步法RT-PCR試劑盒并參照說明書進行擴增,miR-221-3p的內(nèi)參選用U6,CCR5的內(nèi)參選用GADPH,實驗所得的數(shù)據(jù)經(jīng)2-ΔΔCt法分析計算后得到miR-221-3p及CCR5 mRNA相對表達量,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3.8 大鼠海馬神經(jīng)元細胞中miR-221-3p對CCR5的靶向調(diào)控 解凍復(fù)蘇大鼠海馬神經(jīng)元細胞,隨機分為野生型CCR5+miR-221-3p mimic組、野生型CCR5+miR-221-3p mimic陰性對照組、突變型CCR5+miR-221-3p mimic組、突變型CCR5+miR-221-3p mimic陰性對照組,采用LipofectamineTM2000并按照說明書步驟,以野生型CCR5 3′-UTR報告質(zhì)粒、突變型CCR5 3′-UTR報告質(zhì)粒、miR-221-3p mimic、miR-221-3p mimic陰性對照分組轉(zhuǎn)染細胞,各組細胞轉(zhuǎn)染后24 h,將其消化后分組收集,以雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒且參照說明書檢測各組細胞的雙熒光素酶相對活性[9]。

2 結(jié) 果

2.1 針灸對缺血性腦卒中大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠新異臂進入次數(shù)減少,新異臂停留時間比及跳臺實驗潛伏期縮短(P<0.05),跳臺實驗犯錯次數(shù)增加(P<0.05)。與模型組比較,針灸組大鼠新異臂進入次數(shù)、新異臂停留時間比及跳臺實驗潛伏期延長(P<0.05),跳臺實驗犯錯次數(shù)減少(P<0.05);miR-221-3p antagomir組大鼠新異臂進入次數(shù)、新異臂停留時間比及跳臺實驗潛伏期減少(P<0.05),跳臺實驗犯錯次數(shù)增加(P<0.05)。與針灸組比較,針灸+miR-221-3p antagomir組大鼠新異臂進入次數(shù)、新異臂停留時間比及跳臺實驗潛伏期減少(P<0.05),跳臺實驗犯錯次數(shù)增多(P<0.05);與miR-221-3p antagomir組比較,針灸+miR-221-3p antagomir組大鼠新異臂進入次數(shù)、新異臂停留時間比及跳臺實驗潛伏期增多(P<0.05),跳臺實驗犯錯次數(shù)減少(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠Y迷宮實驗及跳臺實驗結(jié)果比較(±s)

2.2 針灸對缺血性腦卒中大鼠腦梗死的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦梗死面積增加(P<0.05)。與模型組比較,針灸組大鼠腦梗死面積減小(P<0.05);miR-221-3p antagomir組大鼠腦梗死面積增加(P<0.05)。與針灸組比較,針灸+miR-221-3p antagomir組大鼠腦梗死面積增加(P<0.05)。與miR-221-3p antagomir組比較,針灸+miR-221-3p antagomir組大鼠腦梗死面積減小(P<0.05)。詳見圖1、表3。

圖1 各組大鼠腦梗死情況(TTC)

表3 各組大鼠腦梗死面積比較(±s) 單位:%

2.3 針灸對缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)損傷的影響 假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)完好圓潤,排列規(guī)則,神經(jīng)功能缺損評分為0分。與假手術(shù)組比較,模型組大鼠海馬神經(jīng)元發(fā)生明顯病理損傷,細胞結(jié)構(gòu)破碎,形態(tài)萎縮,排列紊亂,數(shù)量減少,神經(jīng)功能缺損評分升高(P<0.05)。與模型組比較,針灸組大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷減輕,神經(jīng)功能缺損評分降低(P<0.05);miR-221-3p antagomir組大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷加重,神經(jīng)功能缺損評分升高(P<0.05);與針灸組比較,針灸+miR-221-3p antagomir組大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷加重,神經(jīng)功能缺損評分升高(P<0.05)。與miR-221-3p antagomir組比較,針灸+miR-221-3p antagomir組大鼠海馬神經(jīng)元病理損傷減輕,神經(jīng)功能缺損評分降低(P<0.05)。詳見圖2、表4。

圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)變化(HE,×200)

表4 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較(±s) 單位:分

2.4 針灸對缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)炎癥的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織抑炎因子IL-10水平降低(P<0.05),促炎因子IL-17、IL-18水平升高(P<0.05)。與模型組比較,針灸組大鼠腦組織抑炎因子IL-10水平升高(P<0.05),促炎因子IL-17、IL-18水平降低(P<0.05);miR-221-3p antagomir組大鼠腦組織抑炎因子IL-10水平降低(P<0.05),促炎因子IL-17、IL-18水平升高(P<0.05)。與針灸組比較,針灸+miR-221-3p antagomir組大鼠腦組織抑炎因子IL-10水平降低(P<0.05),促炎因子IL-17、IL-18水平升高(P<0.05)。與miR-221-3p antagomir組比較,針灸+miR-221-3p antagomir組大鼠腦組織抑炎因子IL-10水平升高(P<0.05),促炎因子IL-17、IL-18水平降低(P<0.05)。詳見表5。

表5 各組大鼠腦組織促炎因子IL-17、IL-18及抑炎因子IL-10水平比較(±s) 單位:pg/g prot

2.5 針灸對缺血性腦卒中大鼠腦組織miR-221-3p/CCR5軸表達的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠腦組織miR-221-3p mRNA表達水平降低(P<0.05),CCR5 mRNA表達水平升高(P<0.05)。與模型組比較,針灸組大鼠腦組織miR-221-3p mRNA表達水平升高(P<0.05),CCR5mRNA表達水平降低(P<0.05);miR-221-3p antagomir組大鼠腦組織miR-221-3p mRNA表達水平降低(P<0.05),CCR5 mRNA表達水平升高(P<0.05)。與針灸組比較,針灸+miR-221-3p antagomir組大鼠腦組織miR-221-3p mRNA表達水平降低(P<0.05),CCR5 mRNA表達水平升高(P<0.05)。與miR-221-3p antagomir組比較,針灸+miR-221-3p antagomir組大鼠腦組織miR-221-3p mRNA表達水平升高(P<0.05),CCR5 mRNA表達水平降低(P<0.05)。詳見表6。

表6 各組大鼠腦組織miR-221-3p、CCR5 mRNA表達水平比較(±s)

2.6 大鼠海馬神經(jīng)元細胞中miR-221-3p對CCR5的靶向調(diào)節(jié)情況 通過TargetScanHuman 7.2數(shù)據(jù)庫查詢到miR-221-3p與CCR5之間有結(jié)合位點,詳見圖3。與野生型CCR5+miR-221-3p mimic陰性對照組比較,野生型CCR5+miR-221-3p mimic組相對熒光素酶活性降低(P<0.05);突變型CCR5+miR-221-3p mimic陰性對照組與突變型CCR5+miR-221-3p mimic組相對熒光素酶活性比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表7。

圖3 miR-221-3p與CCR5的結(jié)合位點圖

表7 各轉(zhuǎn)染組細胞相對熒光素酶活性比較(±s)

3 討 論

本研究采用改良線栓法構(gòu)建缺血性腦卒中大鼠模型,結(jié)果顯示,造模大鼠腦部大面積梗死,腦組織抑炎因子IL-10水平降低,促炎因子IL-17、IL-18水平升高,引發(fā)嚴重的神經(jīng)炎癥,造成大鼠海馬神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)破碎,形態(tài)萎縮,排列紊亂,數(shù)量減少,發(fā)生病理損傷,大鼠神經(jīng)功能缺損評分、跳臺實驗犯錯次數(shù)增加,新異臂進入次數(shù)、新異臂停留時間比及跳臺實驗潛伏期減少,表明大鼠學(xué)習(xí)記憶能力降低,神經(jīng)功能發(fā)生嚴重損傷。大腦缺血時,炎性因子、活性氧等致炎因子大量釋放,觸發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng),最終損傷神經(jīng)功能,控制并減弱腦內(nèi)神經(jīng)炎癥,可減輕缺血性腦卒中小鼠腦損傷[13-14]。中醫(yī)學(xué)將腦卒中歸屬于“中風(fēng)”范疇,氣血運行不順、陰陽失調(diào)是主要病機,針灸作為一種施加于特定穴位的非特異性刺激,可調(diào)動機體調(diào)節(jié)機制,改變組織器官病理狀態(tài),減輕機體氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),使其恢復(fù)穩(wěn)態(tài),緩解缺血性腦卒中引發(fā)的神經(jīng)損傷,治療缺血性腦卒中時顯示出較好的臨床療效[5,15-16]。督脈針刺與常規(guī)治療結(jié)合可提高對急性缺血性腦卒中病人的療效,改善神經(jīng)功能受損癥狀[17]。本研究以針灸干預(yù)治療缺血性腦卒中大鼠,可減小大鼠腦部梗死面積,降低腦組織促炎因子IL-17、IL-18水平,升高抑炎因子IL-10水平,減輕神經(jīng)炎癥,恢復(fù)大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài),緩解病理損傷,降低大鼠神經(jīng)功能缺損評分及跳臺實驗犯錯次數(shù),增加新異臂進入次數(shù)、新異臂停留時間比,延長跳臺實驗潛伏期,提高大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,改善神經(jīng)功能損傷,表明針灸治療通過抑制神經(jīng)炎癥減輕缺血性腦卒中大鼠腦損傷,保護神經(jīng)功能。

相關(guān)研究顯示,miRNA-221-3p可調(diào)控細胞凋亡及炎癥等病理過程,過表達miR-221-3p可抑制香煙煙霧提取物引發(fā)的肺組織炎癥反應(yīng),減輕支氣管上皮細胞凋亡水平,改善慢性阻塞性肺病癥狀[18]。miRNA-221-3p作為診斷缺血性腦卒中的潛在生物標志物,在缺血性腦卒中病人體內(nèi)低表達[8],促進其表達可抑制神經(jīng)元凋亡[9]。CCR5與神經(jīng)炎癥的發(fā)生及進展密切相關(guān),鞘內(nèi)注射CCR5拮抗劑可抑制坐骨神經(jīng)損傷大鼠神經(jīng)炎癥,減輕神經(jīng)病理性疼痛[19]。CCR5通過介導(dǎo)炎癥,參與各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程,抑制CCR5可減弱促炎信號觸發(fā)的神經(jīng)元熱下垂,減輕神經(jīng)元死亡和神經(jīng)功能缺損[20]。本研究結(jié)果顯示,針灸可上調(diào)miR-221-3p表達,下調(diào)CCR5表達,以miR-221-3p antagomir干預(yù)處理缺血性腦卒中大鼠,加重海馬神經(jīng)元病理損傷,減小大鼠新異臂進入次數(shù)、新異臂停留時間比、跳臺實驗潛伏期、腦組織抑炎因子IL-10水平表達,增加大鼠跳臺實驗犯錯次數(shù)、神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死面積、腦組織IL-17、IL-18水平及CCR5 mRNA表達,表明下調(diào)miR-221-3p mRNA可促使神經(jīng)炎癥進展,進一步降低大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,加重神經(jīng)損傷,減弱針灸干預(yù)對神經(jīng)炎癥的抑制,拮抗其對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的提升作用,最終逆轉(zhuǎn)針灸對大鼠的神經(jīng)保護作用。雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示,大鼠海馬神經(jīng)元中miR-221-3p可靶向下調(diào)CCR5表達,表明針灸治療減輕缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)炎癥及腦損傷是通過上調(diào)miR-221-3p表達、下調(diào)CCR5表達實現(xiàn)的。

綜上所述,針灸通過促進miR-221-3p表達,進而降低CCR5表達,減小缺血性腦卒中大鼠腦梗死面積,調(diào)控抗炎因子與促炎因子平衡,抑制炎性級聯(lián)反應(yīng),減輕大鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎癥損傷,增強學(xué)習(xí)記憶功能,緩解神經(jīng)功能障礙。本研究為深入闡釋針灸治療缺血性腦卒中的分子機制提供實驗依據(jù),有利于臨床推廣及改進發(fā)展。