趙煥東,丁瑞敏

高血壓是指以體循環(huán)動(dòng)脈血壓增高為主要特征,伴有心、腦、腎等器官功能或器質(zhì)性損害的疾病,是世界范圍內(nèi)心血管疾病和過早死亡的主要原因[1]。根據(jù)調(diào)查研究顯示,我國18歲以上成年人高血壓患病率為23.2%(約2.445億例),隨著城鎮(zhèn)化及人們生活方式改變,高血壓患病率呈升高趨勢(shì)[2]。高脂血癥是由各種原因?qū)е卵獫{總膽固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平升高和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)過低的全身脂代謝異常疾病。調(diào)查結(jié)果顯示,近30年來,我國人民血脂水平逐步升高,成人血脂異?？傮w患病率為40.40%,并呈年輕化趨勢(shì)[3]。2017年全球疾病負(fù)擔(dān)研究顯示,LDL-C水平升高是我國心血管疾病的第3位危險(xiǎn)因素,僅次于高血壓、高鈉飲食[4]。眩暈是臨床常見的癥狀,隨著年齡的增長病人患病率增加,是老年人就診的主要原因,眩暈發(fā)病與大腦的前庭病變和中樞神經(jīng)系統(tǒng)等疾病有關(guān)[5]。高血壓、高脂血癥、眩暈密切聯(lián)系、相互存在,不斷影響我國居民的生活質(zhì)量。中醫(yī)學(xué)將高血壓歸屬于“眩暈”“頭痛”范疇,高脂血癥歸屬于“膏濁”“眩暈”“血濁”“血瘀”等范疇[6],兩病病因多為先天稟賦、飲食勞傷、年老體衰,以虛實(shí)夾雜證多見[6-7],眩暈多為主要癥狀?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療高血壓、高脂血癥、眩暈的方法日益成熟,仍存在藥物導(dǎo)致的安全性風(fēng)險(xiǎn)[8-9]。

半夏白術(shù)天麻湯出自《醫(yī)學(xué)心悟·眩暈》[10],書中記載:“眩,謂眼黑;暈者,頭旋也。有濕痰壅遏者,頭旋眼花,半夏白術(shù)天麻湯主之”。該方燥濕化痰、平肝熄風(fēng),可治風(fēng)痰上擾所致眩暈頭痛、胸悶嘔惡等癥。臨床研究顯示,半夏白術(shù)天麻湯“異病同治”高血壓、高脂血癥、眩暈等,具有較好的臨床療效[11-13]?；A(chǔ)研究顯示,半夏白術(shù)天麻湯通過上調(diào)miRNA-217,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖,發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮的作用;通過下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素6(IL6),減少炎癥反應(yīng),降低人氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、丙二醛(MDA)水平,提高超氧化物歧化酶(SOD)活性,發(fā)揮改善動(dòng)脈粥樣硬化的作用[14-15]。由于多數(shù)研究只針對(duì)該方治療單一疾病,該方的“異病同治”機(jī)制、具體活性成分和作用靶點(diǎn)尚未明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門基于系統(tǒng)生物學(xué)和生物信息學(xué)的新型學(xué)科,從分子水平闡明藥物的作用機(jī)制,其綜合性、系統(tǒng)性、整體性理念與中醫(yī)多組分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)是一致的。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法[16],從分子水平闡明該方藥物的協(xié)同作用機(jī)制,解釋藥物與機(jī)體之間的復(fù)雜關(guān)系,推測(cè)“異病同治”機(jī)制,以期為今后基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 藥物與疾病靶點(diǎn)的收集 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://tcmspw.com/)[17]和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)篩選半夏、天麻、茯苓、橘紅、白術(shù)、甘草活性成分,設(shè)置參數(shù)為口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18、Score≥20。通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://swisstargetprediction.ch/),并預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的活性成分。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)[18]以“hypertension”“hyperlipemia”“dyslipidemia”“vertigo”為檢索詞收集疾病靶點(diǎn)。通過韋恩圖獲取藥物和疾病“異病同治”靶點(diǎn)。研究流程見圖1。

圖1 研究流程圖

1.2 “異病同治”靶點(diǎn)蛋白-蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過STRING平臺(tái)(https://string-db.org/)[19],對(duì)“異病同治”靶點(diǎn)進(jìn)行PPI分析,將計(jì)算結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?使用cytoHubba插件篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。通過BioGPS(http://biogps.org)獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)在人體器官組織內(nèi)的分布,將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?繪制關(guān)鍵靶點(diǎn)-器官組織網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 “異病同治”靶點(diǎn)富集分析 通過Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/)對(duì)“異病同治”靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(GO)、京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析,GO功能富集分析主要包括分子功能、細(xì)胞組分、生物過程。采用R語言等軟件對(duì)富集分析數(shù)據(jù)進(jìn)行氣泡圖和柱狀圖的可視化處理。整合藥物與疾病靶點(diǎn)、“異病同治”靶點(diǎn)的相關(guān)數(shù)據(jù),進(jìn)行“半夏白術(shù)天麻湯異病同治機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖”的繪制,使用cytoHubba插件篩選關(guān)鍵成分。

1.4 分子對(duì)接分析 選取部分關(guān)鍵靶點(diǎn)與關(guān)鍵成分進(jìn)行分子對(duì)接分析,關(guān)鍵靶點(diǎn)通過PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)獲取,其中關(guān)鍵成分結(jié)構(gòu)通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取。利用PyMOL軟件、AutoDock Vina軟件,進(jìn)行分子對(duì)接,之后繪制分子對(duì)接結(jié)合能熱圖與分子對(duì)接圖。

2 結(jié) 果

2.1 藥物與疾病靶點(diǎn)收集 共收集中藥活性成分99個(gè)、藥物靶點(diǎn)847個(gè)、高血壓靶點(diǎn)2 773個(gè)、高脂血癥靶點(diǎn)1 512個(gè)、眩暈靶點(diǎn)933個(gè)。按OB值大小繪制居前20位的活性成分,詳見表1。對(duì)藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集,得到“異病同治”交集靶點(diǎn)65個(gè)。詳見圖2。

表1 主要活性成分

圖2 藥物與疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 通過STRING平臺(tái)對(duì)“異病同治”靶點(diǎn)進(jìn)行PPI處理,利用Cytoscape將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?見圖3),得到64個(gè)節(jié)點(diǎn)、604條邊,平均度值(Degree值)為18.9,度值大小與顏色、圖形大小成正比。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)圖可知關(guān)鍵靶點(diǎn)主要為白蛋白(ALB)、絲氨酸/蘇氨酸激酶1(AKT1)、IL6、腫瘤壞死因子(TNF)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、胱天蛋白酶3(CASP3)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、雌激素受體1(ESR1)、缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)。詳見表2。

表2 排名前20位的關(guān)鍵靶點(diǎn)信息

圖3 關(guān)鍵靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

通過BioGPS數(shù)據(jù)庫對(duì)排名居前20位的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分析,獲取關(guān)鍵靶點(diǎn)在人體器官組織內(nèi)的分布,繪制關(guān)鍵靶點(diǎn)-器官組織網(wǎng)絡(luò)圖。詳見圖4。其中肝(liver)、心(heart)、甲狀腺(thyroid)、視網(wǎng)膜(retina)、松果體(pineal)、杏仁體(amygdala)、CD33+_骨髓(CD33+_myeloid)、全血(whole blood)排名居前列。

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)-器官組織網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 “異病同治”靶點(diǎn)富集分析 通過Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)“異病同治”靶點(diǎn)進(jìn)行基因富集分析,在對(duì)富集項(xiàng)進(jìn)行層次聚類時(shí),使用Kappa scores作為相似度度量,相似度為>0.3被視為一個(gè)集群,在一個(gè)聚類中選擇重要的項(xiàng)目表示該聚類。結(jié)果顯示,共富集316個(gè)生物過程條目,包括循環(huán)系統(tǒng)過程(circulatory system process)、蛋白磷酸化正調(diào)控(positive regulation of protein phosphorylation)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)氮化合物的反應(yīng)(cellular response to organonitrogen compound)、細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)(cellular calcium ion homeostasis)、血壓負(fù)調(diào)節(jié)(negative regulation of blood pressure)等;80個(gè)分子功能條目,包括神經(jīng)遞質(zhì)受體的活動(dòng)(neurotransmitter receptor activity)、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性(G protein-coupled amine receptor activity)、細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、胺結(jié)合(amine binding)等功能;得到83個(gè)細(xì)胞組分條目,涉及膜筏(membrane raft)、受體復(fù)合物(receptor complex)、質(zhì)膜的外側(cè)面(membrane)等結(jié)構(gòu)。根據(jù)count值繪制GO分析圖(見圖5)。共富集179條KEGG通路,對(duì)排名居前15位的KEGG通路進(jìn)行可視化處理(見圖6),包括晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)-晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)糖尿病并發(fā)癥信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)通路、輔助性T細(xì)胞17(Th17)細(xì)胞分化、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、脂肪細(xì)胞中脂肪分解的調(diào)節(jié)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)通路、核因子κB(NF-κB)通路、炎癥介質(zhì)對(duì)色氨酸通道的調(diào)節(jié)等。

圖5 GO富集分析柱狀圖

圖6 KEGG通路富集氣泡圖

2.4 半夏白術(shù)天麻湯“異病同治”機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖 繪制半夏白術(shù)天麻湯“異病同治”機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖,詳見圖7。該圖包括214個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 180條邊,平均Degree值為11,包含93個(gè)活性成分、65個(gè)靶點(diǎn)、10個(gè)生物過程、細(xì)胞組分、分子功能條目,15個(gè)KEGG條目。由圖可知,半夏白術(shù)天麻湯“異病同治”高血壓、高脂血癥、眩暈的作用機(jī)制為通過卡文定堿(cavidine)、黃甘草異黃酮A(eurycarpin A)、柚皮素(naringenin)、甘草查爾酮B(licochalcone B)、山柰酚(kaempferol)、黃芩素(baicalein)等關(guān)鍵成分(見表3),與ALB、AKT1、IL6、TNF、VEGFA等關(guān)鍵靶點(diǎn)相結(jié)合,進(jìn)而調(diào)控循環(huán)系統(tǒng)、蛋白磷酸化正調(diào)控、細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)、血壓負(fù)調(diào)節(jié)等生物過程及調(diào)節(jié)HIF-1通路、Th17細(xì)胞分化、cAMP通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、脂肪細(xì)胞中脂肪分解的調(diào)節(jié)、PPAR通路、NF-κB通路等。

表3 關(guān)鍵成分

圖7 半夏白術(shù)天麻湯“異病同治”機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 分子對(duì)接分析 選取ALB、AKT1、IL6、TNF、VEGFA為分子對(duì)接的蛋白,選取卡文定堿、黃甘草異黃酮A 、柚皮素、甘草查爾酮 B、山柰酚為結(jié)合配體。結(jié)果顯示,對(duì)接結(jié)合能均≤-25.1 kJ/mol(詳見圖8),其中黃甘草異黃酮A、柚皮素與AKT1對(duì)接最穩(wěn)定,均為-40.2 kJ/mol。使用PyMOL繪制分子對(duì)接圖(見圖9),圖中青色化合物為配體,藍(lán)色化合物為氨基酸殘基,黃色虛線為氫鍵?？梢姲胂陌仔g(shù)天麻湯“異病同治”關(guān)鍵成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)能結(jié)合穩(wěn)定。

圖8 分子對(duì)接結(jié)合能

圖9 分子對(duì)接三維圖

3 討 論

“異病同治”思想起源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》,豐富于《金匱要略》,反映了中醫(yī)診治疾病著眼于辨析證候與因證而治的特點(diǎn),體現(xiàn)了中醫(yī)辨證論治思想的精髓[20-21]。半夏白術(shù)天麻湯以半夏、天麻為君,半夏燥濕化痰、降逆止嘔;天麻息風(fēng)止痙、平抑肝陽,兩藥合用,可治風(fēng)痰眩暈頭痛。白術(shù)、茯苓健脾祛濕,可絕生痰之源,為臣藥。橘紅理氣化痰、氣順痰消,為佐藥。甘草調(diào)和諸藥,為使藥。諸藥合用,風(fēng)息痰消,眩暈自愈。高血壓、高脂血癥、眩暈常以痰濁內(nèi)阻證為主[22-23],半夏白術(shù)天麻湯健脾化痰,契合三病的病機(jī),是“異病同治”的經(jīng)典名方。

本研究通過生物信息學(xué)的方法,探討了半夏白術(shù)天麻湯“異病同治”高血壓、高脂血癥、眩暈的作用機(jī)制。PPI結(jié)果顯示,ALB、AKT1、IL6、TNF、VEGFA為關(guān)鍵靶點(diǎn)。ALB是占整個(gè)血清體成分一半以上的蛋白質(zhì),具有膠體滲透效應(yīng)、抗炎、抗氧化、抗凝等活性,ALB與心血管疾病存在一定的關(guān)聯(lián),相關(guān)研究顯示,ALB可結(jié)合類二十烷酸和一氧化氮,從而調(diào)節(jié)血管張力,并抑制與動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成密切相關(guān)的血小板聚集[24-26]。蛋白激酶AKT1參與細(xì)胞凋亡和葡萄糖代謝等細(xì)胞過程,基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),AKT1通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的CD36表面豐度,控制體外和體內(nèi)的動(dòng)脈粥樣硬化和泡沫細(xì)胞形成[27],AKT1可調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移,缺失的AKT1可誘導(dǎo)斑塊易損性和心臟功能障礙[28]。IL6、TNF是參與多種生理與免疫過程的促炎細(xì)胞因子,參與高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化、血脂異常等心血管疾病的發(fā)展[29-30]。臨床研究發(fā)現(xiàn),TNF-α和IL6水平與妊娠高血壓及不良妊娠結(jié)局呈正相關(guān)[31-32]。VEGFA是一種內(nèi)皮生長及血管通透性的調(diào)節(jié)因子,可增強(qiáng)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)/一氧化氮(NO)通路表達(dá),促進(jìn)血管通透性和內(nèi)皮細(xì)胞存活,通過磷酸肌醇特異性磷脂酶Cγ(PLCγ)/蛋白激酶C(PKC)激活磷脂酶A2,促進(jìn)前列環(huán)素I2(PGI2)產(chǎn)生,達(dá)到擴(kuò)血管的目的[33]。為了進(jìn)一步預(yù)測(cè)具有關(guān)鍵靶點(diǎn)作用的器官組織,本研究通過BioGPS分析,結(jié)果顯示,關(guān)鍵靶點(diǎn)主要集中于肝、心、視網(wǎng)膜、松果體、甲狀腺等器官組織,契合高血壓、高脂血癥、眩暈以心、肝為主的病位。

本研究基因富集分析結(jié)果顯示,靶點(diǎn)基因主要富集在循環(huán)系統(tǒng)、蛋白磷酸化正調(diào)控、細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)、血壓負(fù)調(diào)節(jié)等生物過程及HIF-1通路、cAMP通路、PPAR通路等信號(hào)通路。HIF通路參與機(jī)體氧穩(wěn)態(tài)平衡,誘導(dǎo)控制葡萄糖代謝、細(xì)胞增殖和血管形成的蛋白質(zhì)表達(dá)[34],在低氧條件下,HIF-1通過上調(diào)NF-κB、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、活性氧和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS),導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、遷移和增殖,從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[35]。cAMP通路在細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用,有研究顯示,流體剪切應(yīng)力通過增加體內(nèi)cAMP水平,提高eNOS結(jié)合度,從而促進(jìn)NO形成并調(diào)節(jié)血管張力和血壓[36]。PPAR通路在葡萄糖和脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,PPAR是炎癥、高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化重要的治療靶點(diǎn)[37]。PPARα通過增強(qiáng)脂肪酸攝取,增加水解脂蛋白三酰甘油的脂蛋白脂肪酶(LPL)活性,減少血漿富含三酰甘油的脂蛋白。PPARα和PPARγ通過抑制促炎基因的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用[38]。

半夏白術(shù)天麻湯“異病同治”機(jī)制網(wǎng)絡(luò)圖顯示,卡文定堿、黃甘草異黃酮A 、柚皮素、甘草查爾酮 B、山柰酚為“異病同治”的關(guān)鍵成分?？ㄎ亩▔A是一種異喹啉生物堿,可調(diào)節(jié)SOD、MDA、NF-κB的表達(dá),抑制血清TNF-α和IL6水平,是具有抗炎活性的選擇性環(huán)氧合酶2(COX-2)抑制劑[39-40]。柚皮素是一種常見的黃酮類化合物,具有抗炎、降血脂作用[41],可降低LDL-C和三酰甘油,抑制葡萄糖攝取;增加高密度脂蛋白膽固醇,抑制蛋白質(zhì)氧化,防止細(xì)胞間黏附,達(dá)到抗動(dòng)脈粥樣硬化的目的[42]。甘草查爾酮 B具有抗炎、抗癌、抗菌生物活性[43],通過降低MDA、TNF-α和C反應(yīng)蛋白水平及IL8和IL6的活性,達(dá)到保護(hù)心臟的目的[44]。山柰酚是廣泛分布于植物界的黃酮類化合物,具有抑制血管內(nèi)皮炎癥、保護(hù)心臟的功能,通過增加核紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(Nrf2)的表達(dá),抑制Toll樣受體4(TLR4)表達(dá),發(fā)揮抗炎作用[45-46], 山柰酚通過增加肝臟PPARα水平,調(diào)節(jié)高脂飲食喂養(yǎng)大鼠的脂質(zhì)譜,從而改善高脂血癥[47]。分子對(duì)接結(jié)果顯示,關(guān)鍵成分與關(guān)鍵蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定,說明二者可結(jié)合起效。

綜上所述,半夏白術(shù)天麻湯“異病同治”高血壓、高脂血癥、眩暈的機(jī)制可能為關(guān)鍵成分通過多靶點(diǎn)、多通路,發(fā)揮抑制炎癥、降低血脂、擴(kuò)張血管等作用。