朱翰林 趙 恒 翟博文 張卯玉 付玉杰

（1.東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，哈爾濱 150040；3.北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，北京 100083）

五味子（Schisandra chinensis）全株近無毛，為木蘭科（Schisandraceae）木質(zhì)藤本，喜濕怕澇，適宜生長溫度為18～28 ℃，其漿果為深紅色球形肉質(zhì)，可入藥［1］。五味子是主產(chǎn)于吉林省、黑龍江省、遼寧省的道地藥材，習(xí)稱“北五味子”，現(xiàn)被認(rèn)定為三級保護(hù)植物。既往關(guān)于五味子的研究主要包括植物資源保護(hù)、組織培養(yǎng)［2］、五味子枯葉病致病原菌［3］、五味子莖基腐病致病原菌［4］、五味子提取物的生物活性［5］和藥理作用［6-7］、五味子多糖的體內(nèi)試驗(yàn)作用機(jī)制［8-10］等，而關(guān)于五味子多糖的提取分離工藝還有待優(yōu)化。

有些多糖存在于植物細(xì)胞的胞壁外，但大多數(shù)多糖仍然存在于細(xì)胞壁內(nèi)，如淀粉作為儲能營養(yǎng)物質(zhì)在需要時被分解為葡萄糖。提取多糖方法有微波輔助提取、水酶輔助提取、真空提取、超聲波輔助提取等，這些提取方法各有利弊，而傳統(tǒng)溶劑提取方式無法有效提取植物中的多糖，提取率較低且耗時長［11］。鑒于此，如何高效和充分地提取五味子中多糖成分成為當(dāng)前研究中的重點(diǎn)。超聲提取法的優(yōu)勢包括低溫下運(yùn)行、防止活性成分結(jié)構(gòu)損壞、提取時間較短、安全性高、維護(hù)保養(yǎng)方便、萃取效率高、物理化降低多糖分子量等［12］。據(jù)報道，植物材料在超聲波場作用下，通過“空化效應(yīng)”得到外力沖擊，溶液內(nèi)氣泡的形成、在極短時間和極小空間內(nèi)爆破壓縮，形成瞬間高溫高壓的環(huán)境［13］，使細(xì)胞破碎、目標(biāo)物質(zhì)高效率分離出來。纖維素酶是自然界中含量豐富的可再生生物資源，具有用量低、耗能少、對人體無害、高效分解纖維素、對環(huán)境友好等特點(diǎn)，其作用溫度為30～60 ℃，符合多糖提取的溫度要求，能確保在提取過程中較少地破壞活性多糖的結(jié)構(gòu)［14］。例如，朱亞偉等［15］使用響應(yīng)面優(yōu)化纖維素酶酶解-微波輔助法提取桑（Morus alba）葉多糖。孫彤彤等［16］通過Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化得到虎耳草（Saxifraga stolonifera）總酚，并測定其抑制五步蛇毒PLA2 酶活性，結(jié)果表明虎耳草總酚含量與其抑制酶活性作用呈極顯著正相關(guān)。有研究優(yōu)化了向日葵（Helianthus annuus）莖芯多糖的提取工藝，在最優(yōu)條件下所得多糖含量為6.56%，說明不同種屬植物間多糖含量差異明顯，比較得出長白山產(chǎn)區(qū)五味子的多糖含量的豐富性［17］。目前關(guān)于超聲輔助纖維素酶酶解提取五味子多糖的研究鮮見報道，而五味子多糖對于脂多糖誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激的抑制能力也未見報道。

本研究選擇產(chǎn)于長白山地區(qū)的五味子干果為原料，以多糖得率為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken design（BBD）響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，探索超聲輔助纖維素酶酶解工藝提取五味子多糖的最佳條件（加酶量、超聲功率、超聲酶解時間、料液比），并對獲得的五味子多糖開展細(xì)胞氧化應(yīng)激保護(hù)活性研究，以期為五味子多糖的深入開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五味子干果購自吉林省長白山地區(qū)，?20 ℃存儲；脂多糖（LPS，Escherichia coli026：B6）、N-乙酰半胱氨酸（NAC）購自Sigma 公司；纖維素酶（酶活性為50 000 U·g?1）、丙二醛（MDA）含量檢測盒、超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測盒購自Solarbio 公司；D-無水葡萄糖購自阿拉丁有限公司。濃硫酸、蒽酮、無水乙醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所用其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購自SIM 公司；BS110 型電子天平購自Sartorius 公司；DL-CJ-2N 型生物潔凈工作臺購自哈東聯(lián)電子技術(shù)公司；DK-8D 型恒溫?zé)崴圪徸陨虾Ｊ猩艑?shí)驗(yàn)器材公司；1-15K型高速冷凍離心機(jī)購自Sigma 公司；Stat Fax-3200 型酶標(biāo)儀購自AWARENESS 公司；CytoFLEX 型貝克曼流式細(xì)胞儀購自貝克曼庫爾特公司；JY92-IIN 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購自寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自上海青浦滬西儀器廠；Ultrospec5300pro 型紫外分光光度計購自美國通用電氣公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 五味子多糖制備工藝流程

將五味子干果用超聲波清洗儀清潔表面并瀝干后，置于烘箱中60 ℃干燥至恒質(zhì)量。隨后精確稱取30.00 g 粉碎過80 目篩，得五味子粉末。將粉末按料液比1 g∶5 mL的比例與無水乙醇混合，4 ℃下靜置浸泡12 h后，采用回流提取法重復(fù)提取3次，每次1.5 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后收集組分使用0.45 μm濾紙過濾去除包含脂溶性成分的提取液，保留殘渣并烘干至恒質(zhì)量。精確稱定五味子殘渣5.00 g，以料液比1 g∶30 mL 的比例加入150 mL 蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?，再添加纖維素酶混勻，調(diào)節(jié)pH 至4.8，置于超聲波提取儀中在50 ℃下以455 W 功率運(yùn)轉(zhuǎn)40 min，提取結(jié)束后4 ℃下以5 000 r·min?1離心20 min，去除沉淀并保存上清液。用Sevag 法向上清液中以3∶1 的體積比加入氯仿和正丁醇的混合溶液，振蕩離心去除蛋白質(zhì)，蒸發(fā)濃縮至稠膏狀。將稠膏狀物充分消解于5 倍體積的無水乙醇中在4 ℃下過夜醇沉，隨后取沉淀物浸入80%乙醇溶液中充分洗滌并置于烘箱中50 ℃干燥至恒質(zhì)量，用100 mL蒸餾水溶解再導(dǎo)入截留分子質(zhì)量為1 000 u的透析袋中，在4 ℃下透析72 h，每隔12 h 更換透析所用超純水，最后冷凍干燥得五味子多糖。

1.3.2 多糖含量和得率測定

以D-無水葡萄糖為對照，使用蒽酮比色法測定計算吸光度與葡萄糖濃度的關(guān)聯(lián)并繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為y=9.743 5x?0.025 8，回歸系數(shù)R2=0.998 4。精確稱定經(jīng)最佳制備工藝所得的五味子多糖100 mg 溶于100 mL 超純水，攪拌均勻得1 g·L?1五味子多糖水溶液，再取該溶液0.1 mL滴加純水至1 mL，加入4 mL蒽酮試劑，沸水浴10 min，室溫放置10 min后，在波長620 nm下測定吸光度。根據(jù)D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品溶液的多糖含量。五味子多糖得率的計算公式：

五味子多糖得率=（五味子多糖質(zhì)量/五味子粉末質(zhì)量）×100% （1）

1.3.3 五味子多糖提取的單因素試驗(yàn)

根據(jù)制造商說明的纖維素酶最佳使用條件，固定酶解pH 為4.8，提取溫度為50 ℃。通過單因素試驗(yàn)考察加酶量、超聲功率、超聲酶解時間、料液比這4個因素對五味子多糖得率的影響。

1.3.3.1 不同加酶量的設(shè)置

加 酶 量 分 別 設(shè) 置 為150、300、600、1 200、1 800 U·g-1，在pH 為4.8、提取溫度為50 ℃、超聲功率為520 W、料液比為1 g∶20 mL、超聲輔助酶解時間為60 min 的條件下提取五味子多糖，測定多糖得率。

1.3.3.2 不同超聲功率的設(shè)置

超聲功率分別設(shè)置為325、390、455、520、585 W，在pH為4.8、提取溫度為50 ℃、料液比為1 g∶20 mL、加酶量為1 200 U·g-1、超聲輔助酶解時間為60 min的條件下提取五味子多糖，測定多糖得率。

1.3.3.3 不同提取時間的設(shè)置

提取時間分別設(shè)定為10、20、40、60、80 min，在pH為4.8、提取溫度為50 ℃、料液比為1 g∶20 mL、加酶量為1 200 U·g?1、超聲功率為455 W 的條件下提取五味子多糖，測定多糖得率。

1.3.3.4 不同料液比的設(shè)置

料液比分別設(shè)定為1 g∶10 mL、1 g∶20 mL、1 g∶30 mL、1 g∶40 mL、1 g∶50 mL，在pH 為4.8、提取溫度為50 ℃、加酶量為1 200 U·g?1、超聲功率為455 W、超聲輔助酶解時間為40 min的條件下提取五味子多糖，測定多糖得率。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化五味子多糖提取工藝

以五味子多糖得率為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計原理，選取加酶量、超聲功率、超聲酶解時間、料液比4 個試驗(yàn)因素，通過Design-Expert 軟件進(jìn)行4 因素3 水平的響應(yīng)曲面分析，因子水平見表1。

1.3.5 抗細(xì)胞氧化應(yīng)激能力測定

1.3.5.1 細(xì)胞中MDA和SOD的含量測定

將HepG2細(xì)胞接種到6孔板（2×105個·孔?1）上并孵育過夜。細(xì)胞經(jīng)NAC（5 mmol·L?1）或五味子多糖（100、200、400 mg·L?1）預(yù)處理4 h 后，再加入LPS（10 mg·L?1）共同孵育24 h，依據(jù)制造商的說明書，采用丙二醛（MDA）含量檢測盒和超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測盒測定各組細(xì)胞內(nèi)MDA、SOD水平。

1.3.5.2 細(xì)胞中活性氧水平的測定

DCFH-DA 無熒光，能穿過細(xì)胞膜，之后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成不能通透細(xì)胞膜的DCFH，隨后細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS）將氧化無熒光的DCFH，使其轉(zhuǎn)化為有熒光的DCF。因此，使用DCFH-DA熒光探針探究HepG2細(xì)胞中的ROS水平。細(xì)胞處理 參 照1.3.5.1，之 后 將 濃 度 為10 μmol·L?1的DCFH-DA 熒光探針的DMEM 溶液與懸浮細(xì)胞在37 ℃共孵育20 min，用冷PBS洗滌細(xì)胞3次后使用流式細(xì)胞儀的FITC 通道檢測各組的熒光強(qiáng)度，以所得平均熒光強(qiáng)度代表細(xì)胞內(nèi)ROS 含量，隨后通過FLOWMAX軟件分析結(jié)果。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

每組試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次及以上，使用Excel、Graphpad Prism 9.0 和Desgin Expert 13.0 軟 件 進(jìn) 行統(tǒng)計學(xué)分析、數(shù)據(jù)處理和繪圖。采用普通單向方差分析和Dunnett’s 多重比較分析計算各組間的統(tǒng)計學(xué)差異。當(dāng)P<0.05 時，確認(rèn)組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 加酶量對超聲輔助酶解后的多糖得率的影響

由圖1可知，五味子多糖得率在加酶量為150～1 200 U·g?1時處于上升趨勢，在1 200～2 400 U·g?1時多糖得率呈略微下降趨勢。纖維素酶將纖維素分解成寡糖或單糖，破壞五味子細(xì)胞壁，提高細(xì)胞內(nèi)容物分解效率。因此，當(dāng)纖維素酶添加量提升時，酶解效率越高，細(xì)胞裂解越充分，導(dǎo)致多糖得率增加。當(dāng)加酶量加大至2 400 U·g?1時，多糖得率不再增加，可能與植物細(xì)胞被充分酶解后得到的酶解產(chǎn)物（如二糖等）迅速積累抑制酶活性和酶解過程有關(guān)［18］。由此，選取600～1 800 U·g?1為后續(xù)Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化分析的加酶量水平范圍。

圖1 各因素對五味子多糖得率的影響Fig.1 Effects of factors on extraction yield of S. chinensis polysaccharides（SCPs）

2.1.2 超聲功率對超聲輔助酶解后的多糖得率的影響

由圖1 所示，在超聲功率325～455 W 內(nèi)，五味子多糖得率隨超聲功率的增加而增大，在超聲功率455～585 W 內(nèi)，五味子多糖得率隨超聲功率的增加而降低。高能量超聲波作用于植物細(xì)胞壁時，因空化作用復(fù)合機(jī)械振動作用產(chǎn)生極大壓力破壞細(xì)胞并釋放胞內(nèi)溶質(zhì)，隨超聲波功率的增大，細(xì)胞的破壞效率提升［19］，繼而提升五味子多糖提取率。但當(dāng)超聲波功率逐漸增加達(dá)到一定程度后，多糖得率下降，其原因可能是高超聲功率帶來的熱效應(yīng)加速了熱不穩(wěn)定多糖的分解，在纖維素酶的作用下使其加速降解為單糖、二糖等［20］。因此，選取390～520 W 為后續(xù)Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化分析的超聲功率水平范圍。

2.1.3 提取時間對超聲輔助酶解后的多糖得率的影響

由圖1 所得，隨著超聲輔助酶解時間的增加，五味子多糖得率在提取時間為10～40 min 內(nèi)呈整體上升趨勢，在提取時間為40～80 min 內(nèi)呈整體下降趨勢。超聲輔助酶解時間過短時，超聲破裂植物細(xì)胞的物理作用和纖維素酶酶促反應(yīng)不足，所得多糖含量較低；當(dāng)超聲輔助酶解時間過長時，酶過度催化多糖酶解合并超聲熱效應(yīng)導(dǎo)致多糖得率下降。綜上考慮，選擇提取時間20～60 min為后續(xù)Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化分析的提取時間范圍。

2.1.4 料液比對超聲輔助酶解后的多糖得率的影響

在五味子多糖提取過程中，料液比通過影響五味子與酶的接觸面積，進(jìn)而影響多糖得率。由圖1 可知，當(dāng)料液比在1 g∶10 mL～1 g∶30 mL 的范圍內(nèi)，五味子多糖得率隨料液比的提升而增大。其原因是當(dāng)水的體積較小時，底物與纖維素酶的接觸面積較低，酶解不充分，所得多糖含量較。在料液比為1 g∶30 mL～1 g∶50 mL 的范圍內(nèi)，五味子多糖得率呈現(xiàn)下降趨勢，原因可能由于水的比例過大，纖維素酶濃度下降，同時酶不易于底物充分接觸，酶解程度下降，多糖得率較低。綜合分析，選取1 g∶20 mL ～1 g∶40 mL 為后續(xù)Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化分析的料液比水平范圍。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化五味子多糖提取試驗(yàn)

2.2.1 五味子多糖提取工藝的BBD分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，將加酶量（A）、超聲功率（B）、提取時間（C）和料液比（D）作為考察因素，以五味子多糖得率為響應(yīng)值，設(shè)計4 因素3 水平Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)，對五味子多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以確定五味子多糖的最佳提取條件，試驗(yàn)設(shè)計和結(jié)果見表2。使用design expert 13.0軟件將表2中所得數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到五味子多糖得率對加酶量、超聲功率、提取時間、料液比的二次多項(xiàng)回歸方程如下：

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 BBD experiment design and results

YSCPs=21.29+2.63A+2.30B+2.45C?0.08D?0.03AB?0.007 5AC+0.207 5AD+0.34BC+0.277 5BD?

2.2.2 回歸模型的方差分析

通過design expert 13.0軟件進(jìn)一步對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析、方差分析與顯著性檢驗(yàn)，所得結(jié)果如表3 所示：F值為39.42，表明模型具有顯著性，P<0.05 說明分析后差異顯著，P<0.000 1 說明分析后差異極顯著；由此可知模型回歸顯著（P<0.000 1），有統(tǒng)計學(xué)意義，且失擬項(xiàng)的P為0.238 7，大于0.05，表明其檢驗(yàn)不顯著，建模成功；在回歸模型中，一次項(xiàng)（A、B和C）和二次項(xiàng)（A2、B2和C2）都對五味子多糖得率影響極其顯著，而二次項(xiàng)D2影響顯著。由4 個因素的F值對比可得各因素對五味子得率的影響程度由大到小依次為加酶量（A）、提取時間（C）、超聲功率（B）、料液比（D）；方程擬合相關(guān)系數(shù)R2和修正相關(guān)系數(shù)AdjR2分別為0.975 3和0.950 5，表明該回歸模型擬合程度良好；方程的變異系數(shù)CV%為5.011 3，說明模型可以較好地反映試驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)性；通常信噪比Adeq Precision 大于4 代表模型良好，五味子多糖回歸方程的信噪比為20.317 1，表明此模型可用于引導(dǎo)優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計。綜上所述，該模型可靠性優(yōu)，可用預(yù)測五味子多糖最佳得率的工藝條件。

表3 方差分析與顯著性檢驗(yàn)Table 3 Analysis of variance and significance test

2.3 三維響應(yīng)面圖分析

利用試驗(yàn)數(shù)據(jù)生成三維響應(yīng)面圖（圖2），圖中反映了不同水平的各因素對五味子多糖得率的影響和各因素之間的交互影響關(guān)系。如圖2a 所示，隨著加酶量的增加，五味子多糖得率先上升后下降，而隨著超聲功率的增加，五味子多糖的提取率逐漸增加，當(dāng)超聲功率達(dá)到500.00 W 左右時，多糖得率最高；等高線表現(xiàn)為介于圓形與橢圓形之間，說明加酶量和超聲功率的交互作用較弱。如圖2b 所示，當(dāng)超聲功率和料液比分別為455.00 W和1 g∶30.00 mL時，隨著提取時間和加酶量的不斷增加，五味子多糖得率呈先上升后下降趨勢，同時等高線表現(xiàn)為近圓形，說明提取時間和加酶量的交互作用極弱。如圖2c 所示，當(dāng)超聲功率和提取時間分別為455.00 W 和40 min 時，隨著料液比的增加到1 g∶22.26 mL，多糖得率上升至平衡水平，隨后在料液比為1 g∶36.80 mL開始下降，隨著加酶量的增加，多糖得率先迅速上升后緩慢下降；此外，由等高線為橢圓形表明加酶量和料液比的交互作用較強(qiáng)。如圖2d 所示，當(dāng)加酶量和料液比分別為1 200 U·g?1和1 g∶30.00 mL 時，隨著超聲功率和提取時間的不斷累加，五味子多糖得率先升后降，二者影響下所呈現(xiàn)的響應(yīng)面相對陡峭，說明它們與多糖得率的關(guān)聯(lián)度均較大；等高線顯示為近圓形，表明超聲功率和提取時間的交互影響輕微。如圖2e所示，當(dāng)加酶量和提取時間各為1 200 U·g?1和40 min 時，且超聲功率和料液比分別達(dá)到459.12 W和1 g∶30.63 mL時，響應(yīng)面分析得到多糖得率最高，隨著二者數(shù)值的增加，多糖得率先增加后下降，超聲功率一側(cè)響應(yīng)面較為陡峭，而料液比一側(cè)響應(yīng)面較為平緩，說明超聲功率較料液比對多糖得率的影響大；所組成的等高線為橢圓形，表明超聲功率和料液比的交互影響較大。如圖2f所示，當(dāng)加酶量和超聲功率分別為1 200 U·g?1和455.00 W 時，隨著提取時間和料液比的不斷累加，五味子多糖得率呈先上升后下降趨勢；等高線顯示為橢圓形，意味著此二因素的交互作用較強(qiáng)。綜上所述，加酶量、超聲功率和提取時間與料液比之間存在較為較強(qiáng)的交互作用，且與方差分析表中數(shù)據(jù)吻合。

2.4 優(yōu)化提取參數(shù)與試驗(yàn)驗(yàn)證

響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷玫降母饕蛩刈顑?yōu)水平如下：加酶量為1 417.82 U·g-1，超聲功率為499.38 W，提取時間為46.05 min，料液比為1 g∶31.84 mL，最優(yōu)五味子多糖得率為22.39%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將加酶量、超聲功率、提取時間和料液比分別調(diào)整為1 420 U·g-1、500.00 W、46 min和1 g∶32 mL，在此條件下經(jīng)3 次重復(fù)試驗(yàn)所得五味子多糖實(shí)際得率為22.25%，與預(yù)測值的相對誤差僅為0.63%，說明Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取工藝條件真實(shí)可靠。

2.5 五味子多糖對LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

為了研究五味子多糖是否能抑制由LPS 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞氧化應(yīng)激，檢測了LPS 和五味子多糖作用后的細(xì)胞中ROS、MDA 和SOD 水平。如圖3所示，與對照組相比，LPS 組細(xì)胞的ROS、MDA 水平顯著上升，SOD 水平則顯著下降，表明LPS 成功導(dǎo)致HepG2 細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷；與LPS 處理組細(xì)胞相比，不同質(zhì)量濃度的五味子多糖（100、200、400 mg·L?1）或N-乙酰半胱氨酸（NAC）預(yù)處理的細(xì)胞的MDA 和ROS 的含量降低，SOD 水平升高，表明五味子多糖通過劑量依賴性的方式恢復(fù)細(xì)胞SOD 水平、降低MDA 和ROS 積累量從而有效逆轉(zhuǎn)LPS 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞氧化應(yīng)激。與陽性對照NAC相比，400 mg·L?1的五味子多糖預(yù)處理細(xì)胞使其抗氧化能力提升，達(dá)到接近于NAC 所提供的抗氧化保護(hù)指標(biāo)水平。

圖3 五味子多糖對LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響a.五味子多糖對細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶水平的影響；b.五味子多糖對細(xì)胞內(nèi)丙二醛水平的影響；c.五味子多糖對細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響Fig.3 Effect of SCPs on LPS-induced oxidative stress in HepG2 cells a.Effect of SCPs on SOD levels in cells；b.Effect of SCPs on MDA lev?els in cells；c.Effect of SCPs on ROS levels in cells

3 討論與結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Box-Bohnken Design 結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化了超聲輔助酶解提取五味子多糖的工藝條件，最優(yōu)提取工藝參數(shù)為：加酶量為1 420 U·g?1，超聲功率為500 W，提取時間為46 min，料液比為1 g∶32 mL，該條件下五味子多糖得率為22.25%（以干質(zhì)量計）。有研究［21］論證說明應(yīng)用超聲波輔助提取法的五味子多糖得率近似于熱水浸提法的2倍，其在最佳工藝條件下的平均得率為18.61%，同時宋海燕等［22］研究結(jié)果顯示采取經(jīng)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳纖維素酶酶解工藝提取五味子多糖的收獲率為19.38%，而本試驗(yàn)結(jié)合了超聲波提取法與纖維素酶酶解法，最終的五味子多糖得率高于上述研究結(jié)果，表明此二種方式的聯(lián)合提取法的提取效率優(yōu)于任意單一的超聲波提取法或纖維素酶酶解法。Box-Bohnken Design 響應(yīng)面分析得出在五味子多糖提取工藝的4個因素中，加酶量為最高影響因素，大于超聲功率的影響程度。吳金松等［23］采取超聲輔助酶法提取山藥皮水溶性多糖，通過正交試驗(yàn)的極差和方差分析得出因素加酶量影響程度高于因素超聲功率，與本研究分析結(jié)論一致。此外，研究發(fā)現(xiàn)五味子多糖以劑量依賴性的方式恢復(fù)細(xì)胞SOD 水平，降低MDA 和ROS 積累量，從而有效逆轉(zhuǎn)LPS 誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞氧化應(yīng)激。本研究結(jié)果為五味子多糖的深入開發(fā)和利用提供了一定的理論參考與數(shù)據(jù)支撐。