何雅玲, 張鑫淼, 葉 明

(合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

肝臟是人體的重要器官,在人體營養(yǎng)、新陳代謝、解毒和免疫中起著至關重要的作用,但很容易受到有毒物質的傷害,包括酒精、藥物濫用、病毒感染和意外中毒等[1]。事實證明,嚴重的急性肝損傷可能會導致黃疸、嚴重的凝血功能障礙和其他致命的臨床問題[2]。 目前為止,仍然缺乏可靠的藥物來治愈這種傷害,可見肝病已成為影響人類健康的最常見疾病之一[3]。

順鉑(CP)是一種非特異性的細胞毒性抗腫瘤藥物,雖然可以殺死腫瘤細胞,但對正常細胞也可產(chǎn)生毒性作用[4]。有研究表明,順鉑對肝臟、腎臟、肺臟、脾臟和大腦具有毒性作用[5]。其中腎毒性已進入動物和臨床研究階段,但肝毒性尚未引起足夠重視,因此,降低順鉑引起的肝臟毒性仍是亟待解決的問題。

粒毛盤菌是一類分布廣泛的腐生性真菌,是世界菌物資源的重要組成部分[6]。近幾年對粒毛盤菌的研究發(fā)現(xiàn)該類真菌可以產(chǎn)生多種活性物質。粒毛盤菌YM156胞內(nèi)黑色素在鎘暴露小鼠中通過抗氧化和抗炎作用對肝損傷具有治療作用[7]。粒毛盤菌多酚可以作為抗凝劑,并且可以用作潛在的天然藥物預防血栓形成[8]。進一步研究發(fā)現(xiàn),粒毛盤菌多糖具有較好的抗氧化[9]、抗腫瘤[10]、免疫調節(jié)[11]、降血糖[12]等功能,其中,粒毛盤菌YM406胞外多糖(LEP-2a)及其衍生物對CCl4所致急性肝損傷具有改善作用[6]。但是關于粒毛盤菌多糖對順鉑誘導小鼠急性肝損傷保護作用尚不清楚。

本文從粒毛盤菌YM38發(fā)酵液中提取、純化、分離出多糖LEP-1a,建立順鉑誘導的急性肝損傷模型,研究LEP-1a對順鉑誘導小鼠急性肝損傷的肝保護作用,為LEP-1a作為一種治療順鉑引起急性肝損傷的新藥提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

粒毛盤菌YM38子實體收集于安徽黃山,并由合肥工業(yè)大學微生物資源與應用研究中心保存;小鼠肝臟測定的普通試劑盒購于南京建城生物工程研究院;小鼠血清白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)測定的ELISA試劑盒購于聯(lián)科生物技術股份有限公司;水飛薊素購于阿拉丁試劑(上海)有限公司。其余試劑均為分析純。

1.2 粒毛盤菌YM38多糖LEP-1a的提取純化

根據(jù)文獻[11]提取方法,粒毛盤菌YM38發(fā)酵液體發(fā)酵10 d結束后,對其菌液進行抽濾、旋蒸,用95%乙醇進行醇沉,離心取沉淀,沉淀用蒸餾水復溶,通過Sevage法除蛋白,30% H2O2脫色,將脫色完的多糖溶液在流動的自來水中透析48 h, 再用蒸餾水透析24 h后冷凍干燥獲得粗多糖。

粗多糖通過DEAE-cellulose 52色譜柱分別用0、0.1、0.3、0.5 mol/L NaCl進行洗脫,收集由0.1 mol/L NaCl洗脫的主要組分,并進一步用雙蒸水在Sephadex G-100色譜柱中進行洗脫,收集分級分離后的主要組分,透析、凍干后得到新的粒毛盤菌多糖LEP-1a。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

在食品安全預防工作和監(jiān)管工作中，無論是美國還是歐盟，都能通過專業(yè)機構收集和分析一些有關的食品風險、安全信息等，也能為法律法規(guī)的實施提供科學依據(jù)。為了增強消費者的自身保護能力，掌握食品安全的實際信息，可以促使食品安全信息系統(tǒng)的形成，加強對不合格產(chǎn)品的分析，保證食品市場檢測信息的滲透，在科學探究的情況下，也可以更好地服務于社會。

8周齡健康的ICR雄性小鼠購自安徽醫(yī)科大學(25～28 g,40只)(證書編號:安徽醫(yī)學實驗動物的第一號許可證)。所有實驗小鼠均在標準條件下嚴格喂養(yǎng),并保持在可控制的溫度(24～26 ℃)、濕度(55±5)%和12 h的明/暗循環(huán)中,可以自由飲水和進食。

所有小鼠適應飼養(yǎng)1周后,隨機分為5組(n=6),包括正常(N)組、模型(M)組(順鉑45 mg/kg)、陽性藥(P)組(水飛薊素100 mg/kg)、LEP-1a低劑量(LL)組(100 mg/kg)、LEP-1a高劑量(LH)組(200 mg/kg)。 正常組和模型組小鼠灌胃蒸餾水0.2 mL,其余組小鼠等量灌胃給藥,連續(xù)7 d,在第7天灌胃3 h后,除正常組腹腔注射0.1 mL生理鹽水,其余組單劑量腹腔注射0.1 mL順鉑,禁食不禁水,16 h后脫頸處死小鼠,并從眼球中采血,血漿在4 ℃下以4 000 r/min的速度離心15 min產(chǎn)生血清[13]。將一部分肝組織固定在4%多聚甲醛中以進行組織學分析,其余的肝臟組織則存放在-80 ℃的冰箱中,以進行進一步的生化分析。

1.3.2 體質量和肝指數(shù)分析

小鼠體質量每周稱量1次。在最后一次治療16 h后稱質量,處死小鼠,解剖取出肝臟,計算肝臟指數(shù),具體計算公式如下:

1.3.3 小鼠肝臟生化指標分析

將肝組織在生理鹽水(1∶9)中勻漿,并將勻漿液于3 500 r/min在4 ℃下離心10 min。 收集上清液,并嚴格遵守制造商(南京建城生物工程研究所)市售的試劑盒測試規(guī)則測定甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)水平。

1.3.4 小鼠血清生化指標分析

1.3.5 小鼠肝臟組織形態(tài)學染色

將適量肝組織置于10%福爾馬林緩沖液中固定24 h后對其進行脫水、浸蠟、包埋、切片,并用蘇木精-伊紅(HE)染色后用顯微鏡觀察。從肝右葉收集肝組織樣品,用10%福爾馬林緩沖液固定,包埋在肝中,分成5 μm切片,并用蘇木精-伊紅(HE)染色[14]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)使用Origin 8.0進行統(tǒng)計分析,以(平均值±標準差)表示,采用one-way ANOVA分析各組數(shù)據(jù)是否存在顯著性差異。當P<0.05和P<0.01時,在統(tǒng)計學上分別被認為差異性顯著和極顯著。

2 結果與分析

2.1 LEP-1a對小鼠體質量和肝指數(shù)的影響

LEP-1a對小鼠體質量、肝臟質量和肝指數(shù)的影響見表1所列。由表1可知:各組小鼠初始體質量無明顯差異,順鉑給藥導致模型組小鼠體質量下降顯著(P<0.01),肝臟質量和肝指數(shù)在所有組中表達最高,說明順鉑造模成功;與模型組相比,粒毛盤菌多糖高、低劑量給藥組(LL和LH) 肝指數(shù)均不同程度降低。結果表明LEP-1a能夠抑制急性肝損傷小鼠的肝臟指數(shù)升高,使肝功能得到一定改善,具有一定治療效果。

表1 LEP-1a對小鼠體質量和肝臟指標的影響

2.2 LEP-1a對小鼠肝臟TG和TC水平的影響

LEP-1a對小鼠肝臟TG和TC水平的影響如圖1所示。

圖1 LEP-1a對小鼠體內(nèi)TG和TC水平的影響

從圖1可以看出,與正常(N)組相比,陽性治療(P)組中TG、TC濃度無顯著差異(P>0.05),模型組小鼠TG、TC濃度極顯著升高(P<0.01),說明小鼠急性肝損傷模型已建立;與模型(M)組相比,粒毛盤菌多糖預處理組(LL和LH)小鼠肝臟中TG、TC濃度均明顯降低,具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 LEP-1a對小鼠肝功能的影響

血清ALT、AST和AKP活性與肝損傷程度成正比[15]。LEP-1a對小鼠肝功能的影響如圖2所示。從圖2可以看出,與正常組相比,模型(M)組的血清中ALT、AST和AKP活性顯著升高(P<0.01)。

圖2 LEP-1a對小鼠肝功能的影響

陽性治療組與正常組相比幾乎無顯著差異(P>0.05),粒毛盤菌多糖預處理組(LL和LH) 以劑量依賴性方式逆轉了模型(M)組血清ALT、AST和AKP活性的升高(P<0.05)。這種變化與文獻[16]的研究結果相似,順鉑處理組中AST和ALT活性明顯高于其他組。本研究中LEP-1a預處理可以減輕順鉑誘導的急性肝損傷,說明LEP-1a對肝臟具有保護作用。

2.4 LEP-1a對小鼠肝臟氧化應激的影響

在藥物或化學誘導的肝毒性中,氧化應激常被認為是肝細胞損傷的原因。脂質過氧化的最終產(chǎn)物MDA是氧化損傷的標志物,同時,氧化應激也導致相關抗氧化酶活性降低,如SOD和CAT活性降低[17]。LEP-1a對順鉑誘導的小鼠肝臟脂質過氧化的影響見表2所列。由表2可知,與正常(N)組相比,順鉑誘導顯著增加了MDA的量(P<0.01)。然而,所有LEP-1a預處理組均以劑量依賴性方式降低MDA的量(P<0.01)。此外,模型(M)組的SOD和CAT活性最低,經(jīng)過LEP-1a預處理,SOD 和CAT活性顯著升高(P<0.01)。結果表明LEP-1a能顯著降低MDA的量,增強SOD和CAT活性,對順鉑誘導的氧化應激具有潛在的治療作用。

表2 LEP-1a對小鼠體內(nèi)氧化應激酶的影響

2.5 LEP-1a對小鼠血清炎癥因子的影響

許多細胞因子(如TNF-α、IL-1β)在肝損傷中起著至關重要的作用[18]。為了研究LEP-1a預處理的潛在抗炎作用,測定TNF-α和IL-1β的表達水平。LEP-1a對小鼠血清TNF-α和IL-1β質量濃度的影響如圖3所示。從圖3可以看出:與正常(N)組相比,模型(M)組的血清TNF-α和IL-1β的質量濃度顯著增加(P<0.01);相反,與模型(M)組相比,多糖組預處理組(LL和LH)的TNF-α和IL-1β質量濃度顯著降低(P<0.01)。結果表明,LEP-1a對炎性因子TNF-α和IL-1β均有明顯的抑制作用,能夠調控順鉑引發(fā)的炎癥反應、減輕炎癥、抑制肝損傷,從而進一步達到保肝活性。

圖3 LEP-1a對TNF-α和IL-1β質量濃度的影響

2.6 LEP-1a對小鼠肝臟組織病理學的影響

為了確定順鉑注射后對炎癥性肝損傷的影響,通過HE染色對小鼠肝臟進行了組織學分析。LEP-1a對小鼠肝臟組織病理學的影響如圖4所示。從圖4可以看出:正常(N)組小鼠肝細胞排列整齊,結構清晰可見,且無明顯病理現(xiàn)象;模型(M)組小鼠肝細胞增大,可見細胞破裂、壞死,存在嚴重的炎性細胞浸潤現(xiàn)象,表明藥物性肝損傷造模成功;與模型(M)組小鼠相比,多糖預處理組(LL和LH),小鼠肝臟病變明顯緩解,炎性細胞浸潤減輕,細胞輪廓清晰可見,肝損傷程度減輕。結果表明LEP-1a對順鉑誘導的急性肝損傷具有一定的緩解作用。

圖4 LEP-1a對小鼠肝臟組織病理學形態(tài)的影響

圖4中,黑色箭頭表示肝細胞體積增大,炎性細胞浸潤,細胞核收縮。

3 討 論

本文從粒毛盤菌YM38發(fā)酵液中提取了天然多糖LEP-1a,并通過腹腔注射順鉑建立小鼠急性肝損傷模型,首次評估LEP-1a的保肝作用。眾所周知,肝臟是脂肪形成和膽固醇代謝的中心器官[19]。因此肝臟中TG和TC的水平可以用作肝損傷的生化指標。白首烏花多糖能夠明顯降低小鼠TG和TC水平,對酒精性肝損傷小鼠肝臟脂質水平具有潛在抑制作用[20]。本研究中給予小鼠順鉑后,肝臟中TG和TC水平升高,LEP-1a預處理能夠顯著降低TG 和TC水平。已知AST、ALT和ALP是肝功能的重要標志物,而它們活性增加表明肝細胞壞死和細胞膜通透性障礙[21]。當少量肝細胞壞死時,肝細胞中的ALT、AST和AKP會釋放到血清中,導致血清中相關含量急劇升高[22]。文獻[23]研究發(fā)現(xiàn)靈芝(Ganodermaapplanatum)多糖預處理可顯著降低血清AST、ALT、ALP水平從而減輕CCl4誘導的肝損傷。本研究表明順鉑給予引起模型組血清ALT、AST和AKP水平升高,而LEP-1a預處理組中ALT、AST和AKP水平均降低,說明LEP-1a 能夠緩解順鉑所致的肝臟損傷。

順鉑可以在肝臟組織中大量積累,誘導氧化應激反應,氧化應激造成了抗氧化防御的不平衡,這也是造成急性肝損傷的部分原因[24]。MDA是脂質過氧化作用的最終產(chǎn)物,可以將超氧化物變成過氧化物[25]。SOD經(jīng)常被用作細胞氧化狀態(tài)的標志物,是抵抗氧化應激的重要因素[26]。SOD和 CAT作為生物體內(nèi)最主要的酶促防御體系,能有效清除活力氧自由基[27]。研究表明,LEP-1a可通過增加SOD和CAT的活性以及降低肝臟中MDA的量來抑制炎癥細胞向肝臟的浸潤,并增強抗氧化活性。結果與靈芝多糖[28]、水溶性黑木耳根多糖[29]的研究結果一致,說明真菌多糖能有效預防小鼠藥物性肝臟損傷。

順鉑誘導可增加肝組織中炎癥介質和TNF-α[30]。TNF-α是一種內(nèi)源性致熱原,可以導致發(fā)熱,引起細胞凋亡[31]。IL-1β作為重要的促炎因子,響應組織損傷而快速表達[21]。在本研究中,與模型組相比,LEP-1a預處理組能夠顯著抑制小鼠炎性因子TNF-α和IL-1β的表達,降低體外的炎癥反應以及肝壞死的嚴重程度,與文獻[32]結果一致。同時,肝臟組織病理學染色表明給予LEP-1a預處理后,炎性細胞浸潤明顯減少,無大量壞死肝細胞,且高劑量LEP-1a組比低劑量組治療效果明顯。因此本文研究表明,LEP-1a能夠通過提高小鼠肝臟抗氧化能力和抑制肝臟炎癥因子的產(chǎn)生抑制肝損傷,達到保護肝臟作用。