金明枝, 黃千里, 陳 輝, 葉 明

(1.合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601; 2.上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所,上海 201403)

多糖是單糖經(jīng)糖苷鍵連接而成的一種聚合糖高分子化合物,通常以聚集體的形式存在于水溶液中。多糖在人體的腸道中會被分解吸收,并通過血液輸送至體內(nèi)需要營養(yǎng)的組織、器官[1]。但由于人體實驗成本昂貴且存在倫理爭議,而體外模擬消化模型所需樣品少、操作簡便快速且具有可重復性,使其逐漸成為消化研究的首選方法[2]。但體外消化易受外界環(huán)境的影響,影響多糖體外消化的因素主要有以下2個方面:① 多糖自身因素,包括組成成分、分子量、糖苷鍵與構(gòu)象等[3];② 環(huán)境因素,包括消化液pH值、糖水解酶、溫度和消化介質(zhì)等[4]。因此每種多糖的結(jié)構(gòu)差異使其消化率均各不相同。

大球蓋菇(Strophariarugosoannulata)是聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織向發(fā)展中國家推薦種植的新菌種[5-6],目前在中國已實現(xiàn)人工種植[7]。大球蓋菇含有多種活性成分,其中多糖含量較為豐富,具有抗氧化及抗腫瘤、降血糖血脂等活性[8-9]。然而,關(guān)于不同消化階段對大球蓋菇多糖(SP-1a)的理化性質(zhì)和生物活性的影響研究較少。本文利用體外模擬消化系統(tǒng)研究大球蓋菇多糖的消化特性,為大球蓋菇多糖的功能活性提供科學依據(jù),促進其成為功能性食品或治療藥物。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料為大球蓋菇子實體,由上海市農(nóng)業(yè)科學院食用菌研究所提供。

胃蛋白酶(3 000 U/mg,豬源)、胰蛋白酶(250 U/mg,豬源)、胰酶均購于BioFroxx (GER);DPPH購于阿拉丁試劑(上海)有限公司。其他試劑均為分析純。

儀器有:LC-10A高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography,HPLC)(日本Shimadzu公司);Nicolet 67 傅里葉變換紅外(Fourier transform Infrared,FTIR)光譜儀(美國尼高力儀器公司);Gemini 500熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡(field emission scanning electron microscope,FESEM)(德國卡爾蔡司);STA449F3同步熱分析儀(德國耐馳公司);CARY5000紫外-可見近紅外分光光度計(安捷倫科技有限公司)。

1.2 體外唾液消化階段

收集3名健康志愿者(年齡20～30歲,近3個月未攝入抗生素)的唾液,收集好的唾液離心(4 500 r/min,10 min)以去除細胞,取上清液備用。隨后將10 mL SP-1a溶液(4 g/L)與10 mL人唾液加入試管中并于37 ℃孵育進行消化,分別在5、15、30 min取樣5 mL,于沸水浴滅活15 min,離心(4 500 r/min,10 min)收集上清液,同時將消化30 min后剩余的含SP-1a唾液消化液透析凍干得SP-1a-S。

1.3 體外胃液消化階段

參考文獻[4]的方法制備胃消化液。將30 mL SP-1a(4 g/L)溶液與30 mL人工胃液加入管中混勻,于37 ℃的搖床中孵育進行消化,分別在30、60、120、240、360 min取樣5 mL,沸水浴中滅活15 min,隨后離心(4 500 r/min,10 min)收集上清液,同時將消化360 min后剩余的含SP-1a胃消化液透析凍干得SP-1a-G。

1.4 體外腸液消化階段

參考文獻[10]的方法制備腸消化液。通過NaHCO3溶液(1 mol/L)調(diào)節(jié)SP-1a胃消化液pH值至7.0。將9 mL人工腸液與30 mL含SP-1a的胃消化液加入試管中,在37 ℃搖床中孵育,分別在30、60、120、240、360 min取5 mL消化樣品,于沸水浴中滅活15 min,隨后離心(4 500 r/min,10 min)收集上清液,同時將消化360 min后剩余的含SP-1a腸消化液透析凍干得SP-1a-I。

1.5 化學表征

參考文獻[2]的方法使用高效液相色譜儀測定SP-1a消化產(chǎn)物的分子量;參考文獻[11]的方法測定SP-1a消化產(chǎn)物的單糖組成;3,5-二硝基水楊酸法用于測定不同時段SP-1a消化液中的還原糖摩爾分數(shù)[12]。

1.6 FTIR分析

使用FTIR光譜儀進行紅外光譜采集。將SP-1a及其消化樣品粉末放在平臺的檢測窗上進行檢測,掃描范圍為4 000～500 cm-1。

1.7 表觀形態(tài)分析

將SP-1a及其消化樣品涂金粉后,通過SEM以400倍放大率觀察樣品形貌,以獲得樣品的微觀形態(tài)。

1.8 熱特性測定

采用同步熱分析儀測定SP-1a消化產(chǎn)物熱特性。測試溫度范圍為25～500 ℃,速率為5 ℃/min。吹掃氣體的氮氣流速為50 mL/min。

1.9 多糖消化產(chǎn)物的體外抗氧化活性

1.9.1 ·OH清除作用

參考文獻[13]的方法,分別取1.0 mL磷酸鹽緩沖液和0.5 mL鄰二氮菲(2.5 mmol/L)于試管中,再加入SP-1a消化液、硫酸亞鐵(2.5 mmol/L)、H2O2(20 mmol/L)各0.5 mL,混勻后在37 ℃水浴中反應60 min,用蒸餾水調(diào)零,在536 nm波長處測定各組吸光度值,以蒸餾水代替樣品溶液的空白組吸光度為A0,以蒸餾水代替H2O2溶液的對照組吸光度為A1,樣品組吸光值為A2?！H清除率(H)的計算公式為:

(1)

1.9.2 DPPH自由基清除作用

參考文獻[14]的方法,取1 mL SP-1a消化液與1 mL DPPH-乙醇溶液混合,在室溫黑暗條件下保持30 min,用蒸餾水調(diào)零,隨后在517 nm波長處測定各組吸光度值,以蒸餾水代替樣品溶液的空白對照組吸光度值為A0,以乙醇代替DPPH-乙醇溶液的對照組吸光度值為A3,樣品組吸光度值為A4。DPPH清除率(D)的計算公式為:

(2)

1.9.3 還原力

參考文獻[15]的方法,分別取0.8 mL SP-1a消化液、0.4 mL PBS(0.2 mol/L) 與0.4 mL 1%K3[Fe(CN)6]于試管中,50 ℃水浴反應20 min,取出待冷卻后,加入0.4 mL 10%三氯乙酸,隨后離心(4 500 r/min,5 min)取上清液1.5 mL,加入1 mL去離子水和0.4 mL 0.1%的三氯化鐵,靜置5 min,于700 nm測定各組吸光度值,以蒸餾水替代樣品作為空白組的吸光度值為A0,樣品組吸光度值為A5。還原力(R)的計算公式為:

R=A5-A0

(3)

1.10 結(jié)果處理

所有實驗均重復3次,實驗數(shù)據(jù)以(平均值±標準差)表示。使用SPSS26.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,單向方差分析(ANOVA)用于測定各組之間的顯著性差異。P<0.05表示不同組間存在顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 還原糖質(zhì)量濃度分析

糖苷鍵的斷裂會引起還原糖質(zhì)量濃度的增加[9],因此還原糖質(zhì)量濃度的變化可作為判斷多糖是否被降解的依據(jù)。SP-1a在消化過程中還原糖質(zhì)量濃度的變化見表1所列。從表1可以看出,在唾液消化階段還原糖質(zhì)量濃度未發(fā)生顯著性變化,而在模擬的胃腸消化中,還原糖質(zhì)量濃度隨著消化時間增加而逐漸增多,尤其是在腸液消化360 min后,還原糖質(zhì)量濃度顯著增加(P<0.05),達到了(0.525±0.060) mg/mL,結(jié)果與文獻[3]研究結(jié)果一致。結(jié)果表明在胃腸消化中,SP-1a可被降解吸收,這可能是由于胃腸液中的環(huán)境易引起糖苷鍵斷裂,從而使還原糖質(zhì)量濃度逐漸增多[16]。

表1 不同消化階段SP-1a的還原糖質(zhì)量濃度

2.2 分子量與單糖摩爾分數(shù)分析

多糖的生物活性與其分子量和單糖組成緊密相關(guān)。根據(jù)標準品校準曲線lgMw=-0.182 8t+11.895與出峰時間,可計算出SP-1a及消化產(chǎn)物的分子量。SP-1a及其消化產(chǎn)物的高效凝膠滲透色譜圖(high performance gel permeation chromatography,HPGPC)如圖1所示。

圖1 SP-1a及其消化產(chǎn)物的HPGPC譜圖

從圖1可以看出,經(jīng)過唾液消化后SP-1a的分子量未明顯變化,而經(jīng)模擬胃液和腸液各孵育360 min后,SP-1a的分子量分別為18.493、17.594 kDa,此結(jié)果表明,SP-1a在胃腸中可被降解吸收,且SP-1a在胃中的分子量變化大于腸液中的變化,這可能是由于胃液中的酸性環(huán)境更容易導致分子量減小[17]。結(jié)合還原糖質(zhì)量濃度結(jié)果表明,SP-1a糖苷鍵的斷裂主要在腸液中發(fā)生,而胃液消化主要引起SP-1a聚集體的破壞,這與RosaroxburghiiTratt多糖的消化結(jié)果類似[3]。此外單糖組成及其摩爾分數(shù)見表2所列。由表2可知,在各消化階段,單糖的組成有所差異,其中葡萄糖的摩爾分數(shù)逐漸降低,這可能是由于葡萄糖間的糖苷鍵在胃腸液中更易于斷裂,這與文獻[1]中的Inonotusobliquus多糖在胃腸中單糖結(jié)果相似。

表2 SP-1a及其消化產(chǎn)物中單糖組成及其摩爾分數(shù) %

2.3 FTIR結(jié)果分析

SP-1a及其消化產(chǎn)物的FTIR譜圖如圖2所示。從圖2可以看出:SP-1a、SP-1a-S、SP-1a-G和SP-1a-I的紅外吸收峰基本穩(wěn)定;經(jīng)過消化后SP-1a特征吸收峰未消失,在1 356、1 148 cm-1處的弱吸收峰分別由C—H的彎曲振動和C—O的伸縮振動引起[18-19];在1 016 cm-1處的吸收峰表明SP-1a的消化產(chǎn)物依然具有吡喃糖環(huán)。而SP-1a及其消化產(chǎn)物紅外圖譜在1 644～1 022 cm-1范圍內(nèi),此范圍內(nèi)各產(chǎn)物的吸收峰強度不同,結(jié)合單糖組成的結(jié)果可知,可能是由于消化前后SP-1a發(fā)生降解導致單糖組成不同所引起的[6]。

圖2 SP-1a及消化產(chǎn)物的FTIR譜圖

2.4 SP-1a的表觀形態(tài)特性分析

SP-1a及其消化產(chǎn)物的微觀形態(tài)如圖3所示。從圖3可以看出:未經(jīng)消化的SP-1a呈片狀,且表面光滑平整[18];經(jīng)過唾液消化后,其消化產(chǎn)物SP-1a-S顯示有細桿狀出現(xiàn);而經(jīng)胃腸消化后,SP-1a-G形狀變?yōu)楸砻娑嗫椎木奂w,特別是在腸消化360 min后,其消化產(chǎn)物SP-1a-I的分子變小且分布松散,這與分子量和還原糖質(zhì)量濃度結(jié)果一致,表明SP-1a在胃腸道中可被降解。文獻[10]顯示Holothurialeucospilota多糖在胃腸消化時由于降解微結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,這與本文研究結(jié)果一致。

圖3 SP-1a及其消化產(chǎn)物的SEM圖

2.5 熱特性分析

差示掃描量熱法(differential scanning calorimeter,DSC)可用來研究多糖的熱物理性質(zhì)。SP-1a及其消化產(chǎn)物的DSC曲線如圖4所示。

圖4 SP-1a及消化產(chǎn)物的熱分析

從圖4可以看出SP-1a在25～500 ℃范圍內(nèi)有2個熱解峰:第1個吸熱峰在67 ℃左右,這可能是由于SP-1a中的水分蒸發(fā)所致[2];第2個吸熱峰在284 ℃左右,這可能是SP-1a的熔點。經(jīng)過消化后,唾液消化產(chǎn)物SP-1a-S的熱解趨勢與SP-1a一致,而胃液消化產(chǎn)物SP-1a-G和腸液消化產(chǎn)物SP-1a-I各有1個吸熱峰和1個放熱峰,前者與SP-1a結(jié)果一致,是水分蒸發(fā)引起的熱解峰,后者可能是由于SP-1a被降解成小分子而產(chǎn)生了不同的熱解反應,具體機制還有待進一步研究。

2.6 抗氧化活性分析

2.6.1 SP-1a消化產(chǎn)物對·OH的清除作用

·OH可以與人體中多種分子進行結(jié)合從而對人體造成危害,是危害最大的一種自由基[19]。SP-1a在不同消化階段對·OH清除作用如圖5所示。從圖5可以看出:SP-1a的唾液消化產(chǎn)物對·OH的清除作用未發(fā)生顯著性改變;在胃液消化過程中,其清除率呈上升趨勢,在240 min時其·OH清除率達到88%并趨于穩(wěn)定;而在腸消化過程中,清除率較為穩(wěn)定,在360 min達到最大值約78.67%。結(jié)果顯示,胃腸消化產(chǎn)物能夠有效清除·OH,這可能是多糖被降解提供了氫原子,從而與·OH結(jié)合達到清除效果[20]。圖5中,不同字母表示P<0.05具有顯著性差異,下同。

圖5 SP-1a在不同消化階段對·OH的清除作用

2.6.2 SP-1a消化產(chǎn)物對DPPH 的清除作用

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基,常用來評估抗氧化活性。SP-1a在不同消化階段對DPPH自由基的清除作用如圖6所示。

圖6 SP-1a在不同消化階段對DPPH自由基的清除作用

從圖6可以看出:唾液消化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率沒有顯著變化,胃消化產(chǎn)物對DPPH自由基清除率隨消化時間的增加而呈增強趨勢,360 min后達到了約25%;在腸液消化過程中,其對DPPH自由基的清除率不斷增強,在240 min時,DPPH自由基清除率顯著增強(P<0.05),達到47%,在消化360 min后最高達到50%。這表明多糖經(jīng)過胃腸消化后具有較強的DPPH自由基清除作用。

2.6.3 SP-1a消化產(chǎn)物的還原力

還原力也是抗氧化活性的檢測指標之一,其反應液在700 nm處具有最大吸光值[21]。SP-1a消化產(chǎn)物還原力如圖7所示。由圖7可知:SP-1a經(jīng)唾液消化后還原力較為穩(wěn)定,約為0.110;胃消化產(chǎn)物的還原力逐漸上升并趨于穩(wěn)定,在360 min時達到0.165左右;在腸消化過程中,可能是SP-1a消化產(chǎn)物被稀釋,開始時的還原力低于胃消化產(chǎn)物,而后還原力逐漸上升,在360 min后達到0.268左右。結(jié)果顯示,SP-1a經(jīng)胃腸消化后具有較強的還原力,并顯著高于唾液和胃消化液的還原力(P<0.05)。

圖7 SP-1a在不同消化階段的還原力

在胃腸消化過程中,多糖可能受溫度、pH值、酶等因素的影響發(fā)生降解,使其化學性質(zhì)與結(jié)構(gòu)等發(fā)生改變,從而引起多糖抗氧化活性的變化。文獻[1]報道Inonotusobliquus多糖的胃腸消化產(chǎn)物具有顯著的抗氧化和酶抑制活性,有助于防止氧化應激和高血糖;文獻[10]研究發(fā)現(xiàn)胃腸消化對Holothurialeucospilota多糖的抗氧化活性有顯著增強影響;文獻[13]顯示ArtocarpusheterophyllusLam.多糖經(jīng)過胃腸消化后,具有較高的自由基清除活性。這些結(jié)果與SP-1a消化后的抗氧化活性相似,表明胃腸降解有利于提高多糖的生物活性。

3 結(jié) 論

本研究經(jīng)過從大球蓋菇子實體中提取分離得到分子量為22.907 kDa的均一組分SP-1a。其在體外唾液消化階段,分子量、單糖組成與還原糖質(zhì)量濃度均無明顯變化;而在模擬胃液和腸液消化后分子量減小至17.594 kDa,還原糖質(zhì)量濃度也顯著增加,并且其微觀形態(tài)由片狀變?yōu)榫W(wǎng)狀聚集體,這表明SP-1a主要在胃腸消化中發(fā)生降解,且SP-1a胃腸消化液具有較強的·OH和DPPH自由基清除能力和還原力,尤其是腸消化液具有更強的抗氧化活性。因此,本研究為探索大球蓋菇多糖在體內(nèi)的降解吸收和生物活性提供了理論依據(jù)。