韓業(yè)東，汲全柱，周 圍，張?zhí)旌剑?xiàng) 楠，李延山*

（ 1. 遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 沈陽 110003 ；2. 朝陽華星生物工程有限公司，遼寧 朝陽 122300 ； 3. 遼寧通正檢測有限公司，遼寧 沈陽 110001 ）

我國是畜牧大國，但蛋白資源緊缺，近年來豆粕價(jià)格飆升至4 000元/t以上，降低日糧粗蛋白含量的需求愈發(fā)迫切。低蛋白日糧可降低氮排放，改善養(yǎng)殖環(huán)境，低蛋白加合成氨基酸平衡日糧已在業(yè)界內(nèi)廣泛應(yīng)用[1-5]。如何在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步降低日糧中粗蛋白含量并降低養(yǎng)殖成本，對(duì)行業(yè)提出了更高的要求。隨著我國生物發(fā)酵行業(yè)發(fā)展，飼用酶制劑研發(fā)、生產(chǎn)技術(shù)得到很大提高，成本大大降低，為行業(yè)提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)[3-4]。蛋白酶是體內(nèi)重要消化酶之一，添加的蛋白酶要在體內(nèi)起作用，須適應(yīng)消化道作用環(huán)境。肉仔雞重要消化場所嗉囊、肌胃、小腸的pH值分別為4.5、3.0、5.5~7.8[6-7]。蛋白酶對(duì)作用pH值敏感，從作用pH值可分為酸性（最適pH 值3.0）、中性（最適pH 值6.0~7.8）和堿性蛋白酶（最適pH值9.0~10.5），故日糧中只有添加酸性蛋白酶、中性蛋白酶才可起作用。

蛋白酶在動(dòng)物中的應(yīng)用已有許多研究，蛋白酶可提高蛋白質(zhì)（氨基酸）消化率，大部分效果正向，但也存在負(fù)面作用[7]，這與所使用的蛋白酶的種類、使用量有關(guān)。在腸道（小腸）起作用的飼用蛋白酶主要為中性蛋白酶，但在腸道起作用的蛋白酶必須要耐受胃酸和胃蛋白酶，避免受到破壞才能夠到達(dá)腸道起作用[6-7]，故蛋白酶的過胃能力很重要。許多研究并未考慮蛋白酶的過胃能力，導(dǎo)致研究結(jié)果不一致。目前研究的低蛋白日糧大多基于添加單體必需氨基酸（賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和色氨酸等）的平衡氨基酸日糧，導(dǎo)致蛋白水平降低但氨基酸水平并未降低[2,7-9]。本試驗(yàn)先對(duì)蛋白酶的過胃能力進(jìn)行評(píng)估，基于添加成本考慮選用過胃能力大于50%的蛋白酶探究進(jìn)一步降低日糧粗蛋白和必需氨基酸含量的可行性，為蛋白酶在低蛋白日糧中的推廣應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及場地

1398中性蛋白酶5萬U/g、2709堿性蛋白酶20萬U/g、飼用過胃蛋白酶5萬U/g（為專用中性飼用蛋白酶，過胃耐高溫制粒），均由朝陽華星生物工程有限公司提供。

試驗(yàn)所使用全部飼料由飼料廠采用同批原料加工成顆粒飼料（每槽2 t），試驗(yàn)用料去頭去尾取中間部分，減少加工誤差。試驗(yàn)在朝陽華星生物工程有限公司實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)場進(jìn)行。

1.2 過胃能力測定方法

參照文獻(xiàn)[10]方法稍做改動(dòng)，稱取1 g樣品置于10 mL人工胃液中，40 ℃水浴孵育2 h，之后調(diào)回各自測定的條件（中性蛋白酶pH 值7.5、堿性蛋白酶pH 值10.5），按各自酶活性測定方法測定，計(jì)算過胃率。酶活性測定方法按國標(biāo)GB/T 23529—2009執(zhí)行。

1.3 飼養(yǎng)試驗(yàn)

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照某大型肉雞一條龍企業(yè)低蛋白日糧飼養(yǎng)方案，設(shè)計(jì)基礎(chǔ)日糧（對(duì)照組）和試驗(yàn)組日糧的營養(yǎng)水平。試驗(yàn)采取完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，選取180 只體重（43.10±0.26） g 的1 日齡健康雄性AA 白羽肉雞，隨機(jī)分為2 組，每組9 個(gè)重復(fù)（籠），每個(gè)重復(fù)（籠）10只雞，采用三層籠養(yǎng)模式。

試驗(yàn)期共40 d，分3 個(gè)階段進(jìn)行飼養(yǎng)（0~14 日齡、15~33日齡、34~40日齡）。對(duì)照組肉雞飼喂基礎(chǔ)日糧，對(duì)照組日糧中添加100 mg/kg 過胃蛋白酶并降低5%~6%的粗蛋白質(zhì)、賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和色氨酸含量，基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)期間試驗(yàn)肉仔雞自由采食飲水，其他管理均按常規(guī)進(jìn)行。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Tab.1 Base diet composition and nutrient level (air-dried basis)

1.3.2 測定指標(biāo)和方法

1.3.2.1 飼料蛋白質(zhì)表觀消化率

于36~38 日齡，采用全糞法進(jìn)行代謝試驗(yàn)。以籠為單位收集3 d糞便，每天收集該籠全部糞便，剔除雞毛、飼料、皮屑等雜物，取部分鮮糞便按每100 克鮮糞加10 mL 10%鹽酸混勻，于65~70 ℃干燥，室溫回潮1 h，恒重，粉碎后制成風(fēng)干樣品裝于密封袋中，將每個(gè)重復(fù)3 d 收集的干雞糞等量混合均勻用于測定飼料蛋白表觀消化率。飼料樣和糞樣參照《飼料中粗蛋白的凱氏定氮法》（GB/T 6432—2018）測定含氮量，計(jì)算飼料蛋白質(zhì)表觀消化率。

1.3.2.2 生長性能及成活率

以每個(gè)重復(fù)（籠）為單位，每天記錄飼料消耗量、死亡數(shù)、存欄數(shù)量。為減少應(yīng)激，于試驗(yàn)開始和結(jié)束（40 日齡）以籠為單位稱重，稱重前所有肉仔雞空腹12 h，根據(jù)記錄數(shù)據(jù)計(jì)算兩組肉仔雞的成活率、平均日增重、平均日采食量、料重比。

1.3.2.3 經(jīng)濟(jì)效益分析

計(jì)算每羽試驗(yàn)組肉雞降低的飼料成本。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 軟件進(jìn)行單因數(shù)方差分析，LSD法進(jìn)行多重比較。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種蛋白酶的過胃能力比較（見表2）

表2 3種蛋白酶的過胃能力比較Tab.2 Comparison of gastric transgastric ability of three proteases

由表2 可知，1398 中性蛋白酶經(jīng)人工胃液處理2 h 后已無活性，過胃率為0；2709堿性蛋白酶處理后剩余酶活也很低，過胃率只有1.3%；飼用過胃蛋白酶人工胃液處理后很仍然有高活性，過胃率達(dá)88.1%。

2.2 低蛋白、氨基酸水平日糧添加飼用過胃蛋白酶對(duì)飼料蛋白質(zhì)表觀消化率的影響（見表3）

表3 低蛋白、氨基酸水平日糧添加飼用過胃蛋白酶對(duì)飼料蛋白質(zhì)表觀消化率的影響Tab.3 Effects of fed pepsin on apparent digestibility of dietary protein in diets with low protein and amino acid levels單位：%

由表3 可知，試驗(yàn)組蛋白質(zhì)表觀消化率極顯著高于對(duì)照組（P<0.01），表明低蛋白、氨基酸水平日糧蛋白酶提高了飼料蛋白質(zhì)表觀消化率。

2.3 低蛋白、氨基酸水平日糧添加飼用過胃蛋白酶對(duì)肉仔雞生長性能及成活率的影響（見表4）

表4 低蛋白、氨基酸水平日糧添加飼用過胃蛋白酶對(duì)肉仔雞生長性能及成活率的影響Tab.4 Effects of fed pepsin on growth performance and survival rate of broilers in low protein and amino acid diets

由表4可知，在代謝能不變的情況下，試驗(yàn)組日糧中加入過胃蛋白酶并降低粗蛋白質(zhì)和4種主要限制性氨基酸含量，肉仔雞平均日增重為59.29 g，與對(duì)照組（59.46 g）相比略有降低，但差異不顯著（P>0.05）；對(duì)照組和試驗(yàn)組肉仔雞的料重比分別為1.69、1.70，平均日采食量分別為100.62、100.66 g，成活率分別為94.44%、95.56%，差異均不顯著（P>0.05）。

2.4 經(jīng)濟(jì)效益分析

按上述飼養(yǎng)方案，試驗(yàn)組平均飼料價(jià)格為3.630元/kg，對(duì)照組為3.690 元/kg，試驗(yàn)組平均飼料價(jià)格比對(duì)照組降低約60 元/t（0.06 元/kg）。試驗(yàn)組每羽飼料成本為14.62 元，對(duì)照組為14.83 元，成本降低0.21 元/羽。以每年出欄1 億計(jì)，可多創(chuàng)收2 100萬元，經(jīng)濟(jì)效益可觀。

3 討論

3.1 胃酸和胃蛋酶對(duì)飼用蛋白酶的影響

蛋白酶是一種具有生物活性的蛋白質(zhì)，三維結(jié)構(gòu)的活性中心容易受到破壞而失活。胃中pH 值為2.5~3.0，可對(duì)酶造成極大破壞，但大部分飼用酶為中性，必須過胃才能夠到達(dá)小腸起作用。苗華彪等[10]評(píng)估了8種飼用蛋白酶過胃能力，用人工胃液處理2 h 后剩余酶活性半數(shù)在12%以下，4 h只有2種酶活性仍在50%以上。結(jié)果表明，大部分中性、堿性蛋白酶通過胃液時(shí)，蛋白酶活性將發(fā)生不可逆失活，且與耐受時(shí)間存在一定關(guān)系。白燕[7]采用pH 值3.0的緩沖液處理中性蛋白酶、堿性蛋白酶和角蛋白酶61 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中性蛋白酶的剩余酶活性（復(fù)性）為0，堿性蛋白酶為0.48%，角蛋白酶最高也只有37.68%。

1398中性蛋白酶和2709堿性蛋白酶是我國產(chǎn)量較大的通用工業(yè)化酶制劑，廣泛應(yīng)用于大豆蛋白肽提取、釀酒、醫(yī)藥、洗滌、食品、皮革脫毛等領(lǐng)域，也作為許多飼用酶使用，具有一定代表性。本研究使用人工胃液處理2 h（兼顧家禽和豬胃的停留時(shí)間），結(jié)果表明，中性蛋白酶過胃率為0，堿性蛋白酶為1.3%，大部分受到破壞，與苗華彪等[10]、白燕[7]研究結(jié)果接近；但本研究中使用的飼料專用過胃蛋白酶，在本研究條件下的過胃率可達(dá)88.1%，與苗華彪等[10]研究中的F6樣品得到的結(jié)果相似。

3.2 低蛋白日糧添加蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)消化率的影響

低蛋白日糧中由于較多的必需氨基酸可能處于臨界缺乏狀態(tài)，因而添加蛋白酶提高蛋白質(zhì)消化率的效果更明顯。李宗銳[5]設(shè)計(jì)了PC（正常CP）、CN1（降1 個(gè)CP）、CN2（降2個(gè)CP）等3個(gè)蛋白水平，蛋白酶添加量設(shè)計(jì)了0、150、300 mg/kg 等3 個(gè)水平。結(jié)果顯示，蛋白酶為主效應(yīng)時(shí)，300 mg/kg 組比E0 組蛋白消化率提高了4.19%,150mg/kg組比E0組提高了2.73%，顯示蛋白消化率與蛋白酶添加量成正比；以蛋白水平為主效應(yīng)時(shí)，300 mg/kg 組對(duì)PC、CN2的蛋白質(zhì)消化率分別提高了4.08%和5.66%，顯示蛋白酶對(duì)低蛋白組的蛋白消化率改善更多。張運(yùn)鋒等[8]研究發(fā)現(xiàn)，降低日糧3%~4%蛋白質(zhì)并添加蛋白酶可提高蛋白消化率。侯振平等[11]在正常日糧中添加50、100、200、400 mg/kg蛋白酶，結(jié)果表明，蛋白酶顯著提高了試驗(yàn)組雞對(duì)粗蛋白質(zhì)的表觀代謝率，以100 mg/kg添加量最佳，蛋白表觀消化率比對(duì)照組提高了6.1%。但白燕[7]研究發(fā)現(xiàn)，使用酸性、中性、堿性蛋白酶和角蛋白酶可提高蛋白質(zhì)的體外消化率，提高肉仔雞的生長性能，但未觀察到蛋白質(zhì)表觀消化率提高，可能與蛋白酶的種類和添加量有關(guān)。

本研究中降低了日糧蛋白質(zhì)和4種必需氨基酸的水平并添加100 mg/kg蛋白酶，結(jié)果顯示，試驗(yàn)組蛋白質(zhì)表觀消化率比對(duì)照組提高了7.9%，效果顯著。本研究結(jié)果與李宗銳[5]、張運(yùn)鋒[8]、侯振平等[11]報(bào)道結(jié)果一致，與白燕[7]研究不同，可能與使用的蛋白酶種類、用量有關(guān)。

3.3 低蛋白日糧添加蛋白酶對(duì)肉仔雞生長性能的影響

李宗銳[5]研究報(bào)道，日糧添加150、300 mg/kg蛋白酶分別提高肉仔雞日增重1.5%、3.3%，料重比也呈一定改善趨勢；CN1組肉仔雞平均日增重和料重比與不加酶的對(duì)照組相當(dāng)。張運(yùn)鋒[8]研究發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)日糧中添加蛋白酶可顯著降低肉雞生長后期和全期的料重比，而對(duì)平均日采食量和平均日增重則無顯著影響。侯振平[9]在1~21 日齡肉仔雞日糧中添加50、100、200、400 mg/kg 蛋白酶，結(jié)果表明，添加200 mg/kg 蛋白酶可提高肉仔雞的平均日增重，降低料重比。張靜靜等[13]研究表明，日糧粗蛋白質(zhì)降低8%~9%并添加蛋白酶顯著提高了肉雞的體重和平均日增重，顯著降低了1~21日齡的料重比；此外，使用蛋白酶促進(jìn)了肉仔雞對(duì)日糧中不可消化大分子營養(yǎng)物質(zhì)的分解，改善了肉仔雞的生長性能。呂毅等[14]在肉仔雞日糧中添加4、8、12 U/g 蛋白酶可提高日增重，改善料重比，以12 U/g 劑量組效果最好，日增重和料重比分別對(duì)照組提高了9.5%和5.0%。本研究在低蛋白日糧中再降低5%~6%的粗蛋白質(zhì)及4種必需氨基酸（賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和色氨酸）水平降低并加入蛋白酶，提高了蛋白質(zhì)消化率，生長性能與對(duì)照組相比沒有顯著差異，與上述報(bào)道結(jié)果相近。

蛋白酶提高肉仔雞的生長性能，可能還通過改善肉仔雞的采食行為提高生長性能。王鑫鑫等[15]研究發(fā)現(xiàn)，肉仔雞對(duì)添加組合蛋白酶4 U/g的日糧更具有采食偏好性。飼用酶中蛋白酶種類最復(fù)雜，其切割位點(diǎn)分氨肽酶、羧肽酶、二肽酶、內(nèi)肽酶、酰胺酶等，活性中心分為絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等；從作用pH值可分為酸性、中性、堿性。與木聚糖酶、植酸酶、甘露聚糖酶等相對(duì)單一的作用位點(diǎn)比，蛋白質(zhì)是由二十多種氨基酸不同組合形成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，分解蛋白質(zhì)的蛋白酶也是更多的作用位點(diǎn)，如有些針對(duì)親水氨基酸，有些針對(duì)疏水氨基酸，還有不同原料的消化特性，與動(dòng)物體內(nèi)源酶的協(xié)同性等，蛋白酶的應(yīng)用研究仍有待深入。

4 結(jié)論

研究結(jié)果表明，在本試驗(yàn)條件下，在低蛋白日糧中添加過胃蛋白酶，并進(jìn)一步降低5%~6%粗蛋白和4種必須氨基酸（賴氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸和色氨酸）水平，肉仔雞生長性能未顯著降低，但增重成本進(jìn)一步降低，方案具有一定可行性。