朱培英，冉李艷，楊莎莎，施徐森，李文貴

（ 云南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，云南 昆明 650201 ）

豬德爾塔冠狀病毒（porcine deltacoronavirus，PDCoV）又稱豬丁型冠狀病毒，為套式病毒目（Niovirales）、冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀病毒亞科（Coronavirinae）、德爾塔冠狀病毒屬（Deltacoronavirus）成員[1]。PDCoV 最早于2012年在香港的豬直腸拭子中檢測到，2014年初在美國俄亥俄州豬場暴發(fā)，隨后在加拿大、韓國、泰國、老撾、越南及中國大陸的養(yǎng)豬場中均有PDCoV 檢出[2]。PDCoV 是引起豬群腹瀉的重要病原之一,主要通過胃腸道傳播并迅速蔓延。感染PDCoV 主要的臨床表現(xiàn)是水樣腹瀉、嘔吐和脫水；病變主要位于小腸，尤其是空腸和回腸，特點是腸壁變薄，腸道內充滿氣體和黃色液體，腸黏膜呈串狀充血[3-4]。哺乳仔豬感染PDCoV 后死亡率高，生長豬和成年豬感染后死亡率低。

2021年，有研究發(fā)現(xiàn)3名患有急性未分化發(fā)熱性疾病的海地兒童血漿樣品中存在PDCoV，這是首次在人類體內發(fā)現(xiàn)該病毒，給動物和人類健康安全帶來了巨大威脅[5]。由于PDCoV致病機制尚未明確，缺乏疫苗和特效藥，成為當前養(yǎng)豬業(yè)疫病防控難點。本文從PDCoV 各蛋白出發(fā)，探討該病毒如何通過細胞膜上的受體入侵細胞，維持自身增殖，誘導細胞凋亡，調節(jié)細胞自噬，并通過復雜的組合機制以及細胞分子和宿主蛋白參與致病過程，以期為PDCoV的防治方法和疫苗研發(fā)提供參考。

1 PDCoV病原學

PDCoV 是一種含囊膜的單股正鏈RNA 病毒，囊膜外有冠狀棘突，病毒顆粒大小為60~180 nm。PDCoV基因組全長約25.4 kb，GC含量約43%[6]，基因結構包含5'和3'非翻譯區(qū)及至少7個開放性閱讀框，分別編碼多聚酶蛋白（polymerase protein）1a/1b、纖突蛋白（spike，S）、膜蛋白（envelope，E）、膜蛋白（membrance，M）、核衣殼蛋白（nucleocapsid，N）、非結構蛋白6（nonstructural protein 6，NS6）及非結構蛋白7（nonstructural protein 7，NS7）。目前對PDCoV 的結構蛋白、非結構蛋白以及輔助蛋白的功能只有初步的研究，仍需進一步探索。

1.1 PDCoV結構蛋白及功能

1.1.1 S蛋白

S 基因全長3 483 nt，編碼1 161 個氨基酸。S 基因是PDCoV 纖突蛋白基因，是一種同源三聚體，每個單體分為兩個區(qū)域，即S1和S2。S1蛋白是球形結構，包含兩個獨立的功能亞域N-末端（S1-NTD）、C-末端（S1-CTD）和相應的受體結合域（RBD）。S1可以與宿主細胞膜結合[7]，S2是高度保守的螺旋，包括兩個七肽重復區(qū)（HR1 和HR2）、一個跨膜區(qū)（TM）和一個融合肽區(qū)（FP）。S2的羧基末端構成了刺狀蛋白的莖，參與病毒和宿主細胞膜的融合。S 基因變異較大，且變異速度較快，是唯一一個負責進入細胞的病毒膜蛋白，與靶細胞上的受體結合，之后介導病毒與細胞融合，導致機體患病[8]。

張家林[9]研究表明，在內吞體中CTSL和CTSB的切割下，S 蛋白活化暴露出S2 N 端的融合肽；融合肽插入內吞體膜，導致病毒囊膜與內吞體膜融合，病毒釋放進入細胞，之后開始新一輪的復制增殖。此外，在細胞膜表面外源添加胰酶的處理下，S蛋白也被切割活化，導致病毒囊膜與細胞膜融合，病毒由此入侵細胞。Dong 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，PDCoV的S蛋白與其他冠狀病毒具有相同的功能，在病毒與宿主結合和產生中和抗體方面發(fā)揮重要作用，是冠狀病毒的主要抗原蛋白，也是新疫苗研究的首選蛋白。

1.1.2 E蛋白

E 基因全長252 nt，編碼84 個氨基酸，位于膜表面，是PDCoV基因組中最小的結構蛋白。目前對PDCoV E蛋白的研究報道很少，根據(jù)其他冠狀病毒E蛋白的相關研究可知其含量很低，但對病毒的組裝、出芽和細胞內運輸具有一定作用，且這些作用可能與病毒的致病機制存在某些關聯(lián)。病毒組裝時，E 蛋白與M 蛋白相互作用形成復合體，輔助M蛋白進入病毒的包膜結構內[11]。

1.1.3 M蛋白

M 基因全長654 nt，編碼218 個氨基酸，位于囊膜表面，是病毒囊膜表面相對豐富的跨膜蛋白，而且相對保守，可作為靶蛋白建立檢測PDCoV 抗體的間接ELISA 方法[12]。M 蛋白在保護機體和介導疾病過程中發(fā)揮重要作用，主要參與營養(yǎng)物質的跨膜運輸、形成新病毒顆粒的包膜和病毒顆粒釋放。

1.1.4 N蛋白

N 基因全長1 026 nt，編碼342 個氨基酸，可刺激機體產生免疫應答抗原蛋白。通過對比不同毒株N 蛋白氨基酸可知N蛋白高度保守（97.1%~100.0%）[13]?；诖?，許多研究建立了針對PDCoV N 蛋白的檢測方法。如朱小甫等[14]、黃海鑫[15]、蘇紅等[16]分別建立不同基于PDCoV N 基因的RT-nPCR 檢測方法，對各地區(qū)豬群PDCoV 感染情況進行了流行病學調查。

1.2 PDCoV非結構蛋白和輔助蛋白功能

1.2.1 ORF1a、ORF1b蛋白

與其他冠狀病毒類似，PDCoV 的ORF1a、ORF1b 可編碼兩個多聚蛋白（pp1a、pp1b），pp1a 和pp1b 可被蛋白酶切割水解加工產生15個非結構蛋白（NSP1~NSP15），一些非結構蛋白已被證明參與病毒的轉錄和復制。如NSP15 以二聚體發(fā)揮酶活的作用機制，能夠特異性切割雙鏈或單鏈核苷酸尿嘧啶，參與病毒復制過程，是病毒重要的毒力蛋白[17]。NSP3 編碼木瓜樣蛋白酶，而NSP5 編碼3C 樣蛋白酶，兩者均在切割和加工多聚蛋白的過程中發(fā)揮作用[18]。NSP12是病毒負鏈RNA合成的過程中不可或缺的RNA聚合酶，NSP14 具有N7-甲基轉移酶活性和核酸外切酶活性，兩者共同參與了病毒蛋白水解與基因組RNA的復制。

1.2.2 輔助蛋白

盡管輔助蛋白對冠狀病毒的復制并非必不可少，但其已被證明在機體的免疫調節(jié)、致病機制和毒力方面發(fā)揮重要作用。因此，鑒定和研究輔助蛋白可提供關于其在病毒生命周期中的具體功能的信息。Fang等[19]發(fā)現(xiàn)，輔助蛋白NS6 過表達通過與RIG-I/MDA5 相互作用顯著抑制仙臺病毒誘導的β 干擾素產生，以及轉錄因子IRF3 和NF-κB的激活。Co-IP競爭性試驗結果也證實了NS6能夠顯著減弱RIG-I/MDA5 與dsRNA 的結合，表明PDCoV NS6 采用了一種新的免疫抑制策略，抑制RLRs 介導IFN-β 產生。上述結果表明，NS6是PDCoV 的一個重要毒力因子，在病毒復制和致病機制中發(fā)揮重要作用，因此缺乏輔助NS6蛋白的PDCoV可能是一個潛在的疫苗候選者。還有研究分析了與NS6相互作用的病毒編碼蛋白和宿主蛋白，結果有助于進一步闡明NS6在病毒復制和致病機制中的作用，為PDCoV防控和藥物靶點篩選提供理論依據(jù)。

此外，NS7 也是PDCoV 的輔助蛋白，Choi 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，NS7 蛋白能夠減少大鼠輔肌動蛋白α4（α-actinin-4，ACTN4）的表達。許多病毒操縱肌動蛋白進入宿主細胞，而ACTN4是細胞質和細胞核中一種高度保守的肌動蛋白結合蛋白，具有多種調控作用，可激活各種轉錄因子（如NF-κB），NS7蛋白可能參與了這一過程[21-22]。

2 PDCoV的致病機制

2.1 PDCoV入侵細胞的分子機制

已有研究發(fā)現(xiàn)，病毒尖峰（S）糖蛋白的激活會觸發(fā)細胞內的蛋白酶，確定了PDCoV進入宿主細胞的兩條途徑：細胞表面的胰蛋白酶和內體中的組蛋白酶L（CTSL）、組蛋白酶B（CTSB）。采用內吞體酸化抑制劑（Baf-A1）處理細胞可完全抑制PDCoV 進入；切斷siRNA 介導的CTSL 或CTSB則可顯著減少病毒感染，結果表明PDCoV可通過內吞途徑進入細胞。

此外，使用胰蛋白酶處理細胞會導致S蛋白的裂解和激活，使PDCoV直接從細胞表面進入宿主細胞[8,23]。Yang等[24]研究發(fā)現(xiàn)，豬氨基肽酶N（pAPN）通過內吞途徑促進PDCoV 入侵細胞并完成復制周期，闡明了pAPN 促進PDCoV入侵細胞及復制的分子機制。

2.2 PDCoV天然免疫應答

目前對PDCoV 致病機制的研究主要限于天然免疫。天然免疫是身體對入侵的病原微生物的第一道防線，主要由天然免疫分子介導，清除和消滅病原體。在眾多天然免疫分子中，干擾素是一種具有廣譜抗病毒活性的細胞因子。干擾素的抗病毒作用是通過與細胞表面的干擾素受體結合，激活細胞內信號通路（JAK-STAT），并通過一個放大的信號級聯(lián)激活干擾素相關刺激基因（ISG）的表達。在長期適應宿主的進化過程中，病毒逐漸獲得了中和天然宿主免疫的能力，并以免疫逃逸的形式更好地適應宿主細胞。當PDCoV 病毒介導細胞受體進入靶細胞后，其基因組RNA通過病毒-宿主膜融合釋放到細胞質中（PDCoV間接影響宿主細胞抗病毒信號級聯(lián)反應見圖1）[25]。在細胞因子誘導階段，內體TLR、胞質RIG-I 和MDA5 均可感覺到病毒來源的RNA基因組和其他復制的RNA中間體的存在。這些受體對病毒來源的RNA進行識別并激活一系列信號分子，導致轉錄因子NF-κB、IRF1、IRF3 和IRF7 的核轉位。在細胞核內，這些轉錄因子與其各自的PRD區(qū)域結合，驅動Ⅰ型和Ⅲ型IFN 以及促炎細胞因子產生，并被分泌到細胞外。之后在信號轉導階段，Ⅰ型和Ⅲ型IFN以自分泌和旁分泌的方式與其同源受體結合，誘導JAK-STAT通路激活，導致ISGF3 復合體的核轉位，并產生干擾素刺激基因（ISGs），加快了PDCoV的復制。

圖1 PDCoV間接影響宿主細胞抗病毒信號級聯(lián)反應Fig.1 PDCoV indirectly affects antiviral signaling cascade in host cells

有研究表明，PDCoV nsp5具有拮抗IFN-I信號轉導的作用，并且該抑制作用依賴其蛋白酶活性[26]。進一步研究結果顯示，PDCoV nsp5通過裂解STAT2抑制IFN-I 信號，同時感染該病毒內源性STAT2 也被裂解，所有STAT2 裂解的產物失去了誘導IFN-I 的能力。上述結果表明，PDCoV nsp5 對IFN-I 信號具有拮抗作用。此外，PDCoV的結構蛋白N蛋白可通過干預雙鏈RNA 及蛋白激酶R活化蛋白與RIG-Ⅰ結合，以及抑制RIG-Ⅰ的K63 多聚泛素化，拮抗IFN-β 產生[27]。目前對PDCoV 致病機制的研究角度單一且數(shù)量較少，有待從多個角度進一步深入探索。

2.3 PDCoV誘導宿主細胞自噬、凋亡

細胞自噬是指細胞面臨營養(yǎng)缺乏、應激、病原微生物入侵或缺乏生長因子時，可能在細胞質中形成自噬囊泡，包裹外來的病原微生物。之后損壞的細胞器和一些蛋白質被運送到溶酶體，形成自噬溶酶體，最終消化包裹的物質，并再生細胞器穩(wěn)定細胞內環(huán)境。病毒和細胞自噬之間的聯(lián)系引起了廣泛關注，已證明體內許多免疫相關因素通過自噬抵抗病毒感染，但許多病毒也可利用細胞自噬加強其復制。此外，細胞凋亡是一個細胞主動終止其生命的過程，對維持細胞的平衡至關重要。細胞凋亡可由多種細胞信號觸發(fā)，包括細胞內Ca2+濃度增加，氧化損傷導致的活性氧（如羥基自由基）積累，以及毒素、一氧化氮（NO）、生長因子和病毒感染等激素刺激，可在各種應激條件下發(fā)生，并在抵抗病毒感染中發(fā)揮重要作用。病毒感染宿主細胞是一個互動的過程，在此過程中，細胞通過細胞凋亡的過程消除病毒進而抵抗病毒感染，而病毒可延長細胞的存活時間，使病毒后代的數(shù)量最大化，或誘導細胞死亡，促進病毒后代的釋放和傳播，使其能夠繼續(xù)感染周圍的細胞。

袁為峰[28]通過構建PDCoV 結構蛋白N、M、E 和非結構蛋白Nsp6 的真核表達質粒，證明了PDCoV 結構蛋白N和非結構蛋白Nsp6 均可顯著上調自噬基因LC3-Ⅱ的表達。為進一步證實自噬和PDCoV 感染之間的關系，試驗使用自噬促進劑雷帕霉素和自噬抑制劑氯喹預處理LLCPK1細胞和IPEC-J2細胞。結果表明，PDCoV N蛋白的表達水平隨著LC3-Ⅱ蛋白的表達水平增加，而氯喹可通過自噬途徑抑制PDCoV 復制，研究結果為進一步探索病毒與細胞自噬間的關系提供了更多理論依據(jù)。

PDCoV 通過糞便-口腔途徑傳播[28]，并在小腸絨毛上皮的細胞質中復制，被感染的小腸腸道細胞發(fā)生廣泛的空泡化并與絨毛上皮分離，導致絨毛萎縮。腸道細胞的大量損失阻礙了小腸對營養(yǎng)物質和電解質的吸收和消化，導致仔豬吸收不良和消化不良引起的腹瀉，造成致命的脫水。這種病理生理變化（包括腸細胞的空泡變性和最終死亡）與病毒的細胞溶解作用引起的壞死有關，而非細胞凋亡。Jang 等[29]研究表明，PDCoV 只能在體外誘導ST 豬睪丸細胞和LLC豬腎細胞的凋亡，不能誘導體內感染的腸道細胞發(fā)生凋亡。Lee 等[30]闡述了PDCoV 感染后細胞凋亡過程的潛在機制，指出使用PAN-caspase抑制劑可抑制PDCoV誘導的細胞凋亡，減少PDCoV 的復制，提示PDCoV 誘導的細胞凋亡可能伴隨著caspase 的激活。此外，PDCoV 感染需要激活caspase-9 啟動子，該啟動子負責內在的線粒體凋亡途徑。試驗結果表明，PDCoV感染導致Bax介導的線粒體外膜通透性（MOMP），導致線粒體細胞色素c（Cytc）特異性地重新定位到細胞質中。線粒體通透性轉換孔（MPTP）開放的抑制劑環(huán)孢素A（CsA）可顯著抑制PDCoV 引發(fā)的細胞凋亡和病毒復制。此外，在CsA 存在下，PDCoV 感染細胞中細胞色素c 的釋放被完全抑制，提示MPTP 在PDCoV 感染的內源性細胞凋亡中起到關鍵作用。綜上所述，PDCoV感染通過Bax募集或MPTP開放刺激MOMP，從而允許導致細胞凋亡的Cytc 釋放到細胞質中，促進病毒的體外復制。

3 展望

近年來，新發(fā)冠狀病毒如SADS-CoV、MERS 以及2019 年暴發(fā)的SARS-CoV-2 給人類和動物帶來了嚴重的健康問題和經濟損失。PDCoV 屬于冠狀病毒科中冠狀病毒亞科的三角洲冠狀病毒屬，可感染鳥類和哺乳動物，是僅次于PEDV的豬腸道致病病毒，了解PDCoV編碼蛋白的功能以及病毒如何調控宿主共能、利用宿主機制逃避免疫反應，有助于明確病毒的致病機制和商品化疫苗研發(fā)，減少養(yǎng)殖戶的經濟損失。