高漫芝，馬勇杰

（天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院腫瘤細胞生物學實驗室，國家惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心，乳腺癌防治教育部重點實驗室，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津 300060）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。雖然在過去的幾年里，乳腺癌的診斷和治療取得了顯著進展，但由于高復發(fā)和轉移發(fā)生率，其死亡率仍然很高[1]。早期診斷、早期治療對于乳腺癌的預后至關重要，準確的生物標志物可有助于早期診斷和指導治療。

RasGRF1 是Ras 的鳥嘌呤核苷酸交換因子（RasGRF）家族的一員，是哺乳動物Ras GTPases 的鳥苷酸交換因子，在小鼠中具有父系印跡[2]。全長RasGRF1 蛋白包含多個結構域：pleckstrin 同源結構域、1 個coil －coil 區(qū)域、1 個鈣調素依賴激活結構域、ilimaquinon 基序、1 個DBL 同源結構域和1 個CDC25 結構域[3－4]。RasGRF1 可以通過促進Ras 與GDP 解離以及Ras 與GTP 的結合來激活Ras，Ras蛋白在某些細胞類型的增殖、存活和分化中發(fā)揮關鍵作用[5]。Ras 蛋白可充當分子開關，在GTP 結合的活性狀態(tài)和GDP 結合的非活性狀態(tài)之間循環(huán)，Ras蛋白和GTP 結合且持續(xù)處于活化狀態(tài)，可與下游的效應蛋白結合產生第二信使，使細胞增殖失去控制，同時細胞凋亡減少，導致細胞惡性轉化[6]?，F有研究表明，RasGRF1 是一種多結構域蛋白，能夠調節(jié)腫瘤細胞生物學行為，參與腫瘤進展[7]。例如在星形細胞瘤中RasGRF1 的敲降可以抑制腫瘤細胞的增殖并促進腫瘤細胞的凋亡[8]；在膠質瘤細胞和肺癌細胞中RasGRF1 可以通過提高Ras 的活性，促進腫瘤細胞的生長[9－10]。但是RasGRF1 在乳腺癌的發(fā)生以及發(fā)展中的作用鮮有報道，本研究分析RasGRF1表達與乳腺癌患者臨床病理特征和生存預后之間的關系，為尋找乳腺癌患者預后的生物標志物奠定科學基礎。

1 材料與方法

1.1 免疫組織化學染色 選取天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院收治的術前未接受放化療等抗腫瘤治療的乳腺癌患者石蠟標本，將石蠟標本切為厚度為4 μm左右的切片，固定于防脫片載玻片上，進行組織化學染色：（1）脫蠟復水：在多次二甲苯及不同濃度乙醇中浸泡。（2）將脫蠟復水后的切片置于清水中輕柔洗滌3 次，每次5 min。（3）抗原熱修復：檸檬酸鹽溶液煮沸后，將組織切片置于高壓鍋中加熱加壓2．5 min，目的是破壞組織上的抗原因甲醛浸泡而形成醛鍵。（4）熱修復后使用清水洗滌組織切片3次，每次5 min。（5）封閉：使用3%H2O2封閉組織切片上的過氧化物酶，室溫靜置25 min。封閉結束后用清水輕柔洗滌多次，最后1 次用PBS 工作液洗滌；再使用山羊血清室溫封閉25 min。（6）一抗孵育：棄去血清封閉液后，滴加使用一抗稀釋液稀釋的RasGRF1 抗體（1∶50，Abcam，Ab－111830），將切片置于濕盒中，4℃過夜孵育，再復溫50 min，棄去抗體，清洗3 次。（7）二抗孵育：滴加的二抗，置于濕盒中，室溫孵育20 min。棄去二抗，清洗3 次。（8）滴加鏈霉親和素連接的辣根過氧化物酶溶液，37℃孵育20 min。（9）顯色：用現配制的DAB 溶液顯色，在顯微鏡下實時控制顯色狀態(tài)，所有切片顯色時長均為3．5 min。（10）使用蘇木精復染5 min，鹽酸酒精分化1 s，于1%氨水中返藍約3 s，晾干后使用中性樹膠封片，萊卡萬能正置顯微鏡觀察評分。

1.2 Western 印跡檢測 棄除細胞培養(yǎng)液后用PBS沖洗細胞，棄除PBS 后加裂解液裂解蛋白，測定濃度后進行SDS－PAGE 變性電泳，結束后將蛋白轉到硝酸纖維素膜上，使用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗（β－actin：稀釋比例：1∶5 000；RasGRF1：稀釋比例：1∶500）4℃過夜孵育。結束后用TBST 洗膜3次，然后避光加入二抗（稀釋比例：1∶8 000），室溫孵育50 min。孵育完成后用TBST 洗膜，結束后使用雙色紅外激光成像系統進行曝光。

1.3 TCGA 和GEO 的臨床資料分析 大標本的浸潤性乳腺癌組織與正常組織的臨床信息來源于癌癥和腫瘤基因圖譜網站（TCGA，http：//tcga－data．nci．nih．gov/）。從網站提取乳腺浸潤癌和GTEx 中對應的正常組織數據，其中浸潤性乳腺癌組織1 099 例，乳腺正常組織292 例；浸潤性乳腺癌組織與配對癌旁組織的臨床信息來自于TCGA 數據庫，包括112 對浸潤性乳腺癌組織與配對癌旁組織，將TPM（transcripts per million reads）格式的RNAseq 數據進行l(wèi)og2 轉化后進行樣本間的表達比較。其次，在GEO數據庫（https：//www．ncbi．nlm．nih．gov/geo/）中下載GSE25066 的表達數據，共508 例乳腺癌患者樣本，并使用singerBox 中GEO ID 轉換器提取RasGRF1基因表達信息和患者的臨床信息，包括年齡（＞50，n=231；≤50，n=277）、TNM 分期（T0～T2，n=288；T3、T4，n=220）、淋巴結狀態(tài)（N0、N1，n=401；N2、N3，n=107）、雌激素受體（ER）狀態(tài)、病理分期以及預后情況等。單因素多因素Cox 回歸分析使用IBM SPSS Statistics 25 進行分析。

1.4 TIMER 的臨床資料分析 TIMER（https：//cistrome．shinyapps．io/timer/）中包括32 種腫瘤類型[11]。選取該數據的差異基因表達（Diff Exp）模塊，Ras GRF1 在32 種腫瘤類型中的基因表達水平分布采用箱線圖顯示，差異表達采用Wilcoxon 檢驗評估差異有統計學意義。

1．5 DriverDBv3 的臨床資料分析 選擇DriverDBv3 （http：//driverdb．tms．cmu．edu．tw/）[12]“Gene”和“survival”模塊，分析RasGRF1 在腫瘤中的表達，及其對患者預后的影響，包括五年生存率、總生存期（OS）、無病期（DFI）、無進展期（PFI）和疾病特異性生存期（DSS）。以各組數據的平均值為cut off值，其中OS 和PFI 中高表達RasGRF1 有227 例，低表達RasGRF1 有849 例；其中DFI 中高表達RasGRF1 有194 例，低表達RasGRF1 有742 例；其中DSS 中高表達RasGRF1 有222 例，低表達Ras－GRF1 有835 例。

1.6 bc－GenExMiner 的臨床資料分析 選取bc－GenExMiner（http：//bcgenex．ico．unicancer．fr/BC－GEM/GEM－Accueil．php）[13]的SCAN－B 數據，用于分析RasGRF1 在乳腺癌中表達情況。分析RasGRF1 在不同類型的乳腺癌患者中的表達情況：病例樣本為4 421 例，具有淋巴結轉移情況數據的有3 870 例，具有陽性和陰性受體免疫組織化學狀態(tài)包括：ER、孕激素受體（PR）、人體表皮生長因子2（HER2）和ER/PR 組合的病例3 666 例。分析RasGRF1 對乳腺癌患者的生存情況：淋巴結轉移（n=1 167）、無淋巴結轉移（n=2 013）、ER+（n=2 832）、ER－（n=241）、PR+（n=2 554）、PR－（n=386）、ER+/PR+（n=2 520）、ER－/PR+（n=29）、ER+/PR－（n=175）、ER－/PR－（n=211）。

1.7 統計學處理 采用Wilcoxon 檢驗分析比較RasGRF1 在正常乳腺組織和乳腺癌組織中的表達水平；采用Log-rank 檢驗計算高低表達水平，|log2|＜－1 表示差異具有統計學意義，Kaplan-Meier生存分析法判斷RasGRF1 表達水平與乳腺癌患者預后的關系；使用Pearson 統計學方法分析ER－/PR－乳腺癌中與RasGRF1 表達相關的miRNA。

2 結果

2.1 免疫組織化學染色檢測 RasGRF1 在乳腺癌中的表達結果顯示，RasGRF1 蛋白在乳腺癌組織中主要為胞漿和胞膜表達，細胞核中幾乎沒有表達（圖1）。

圖1 RasGRF1 在乳腺癌組織中免疫組化染色結果Fig 1 Immunohistochemical staining of RasGRF1 in breast cancer tissues

2.2 浸潤性乳腺癌和正常組織中RasGRF1 的差異表達 TIMER 數據庫分析結果顯示RasGRF1 在多種腫瘤中具有差異表達，與乳腺正常組織相比，RasGRF1 在乳腺癌組織中高表達（P＜0．05，圖2A）；在TCGA 和GTEx 數據庫聯合分析得到同樣的結果（P＜0．000 1，圖2B），并且生信分析和Western 印跡驗證表明RasGRF1 在乳腺癌組織中表達水平高于其配對癌旁組織（圖2C、2D）。

圖2 RasGRF1 mRNA 在乳腺癌組織和正常組織中的表達情況Fig 2 Expression of RasGRF1 mRNA in breast cancer tissues and normal tissues

2.3 RasGRF1 對乳腺癌患者預后的影響 結果顯示，在乳腺癌中，與RasGRF1 低表達組相比，Ras－GRF1 高表達乳腺癌患者OS（HR=2．04，P=0．000 677）（圖3A）、DFI（HR=1．77，P=0．023 5）（圖3B）、PFI（HR=1．85，P=0．001 36）（圖3C）和DSS（HR=2．83，P=3．23e－05）（圖3D）較差。進一步通過單因素和多因素Cox 回歸分析GSE25066 數據發(fā)現，RasGRF1可作為乳腺癌患者的獨立預后因子（表1）。

表1 508 例患者預后的單因素和多因素分析Tab 1 Univariate and multivariate analysis of the prognosis of 1 508 patients

圖3 RasGRF1 mRNA 表達水平與乳腺癌患者預后的關系Fig 3 Relationship between expression of RasGRF1 mRNA and prognosis in breast cancer patients

2.4 RasGRF1 在不同ER/PR 狀態(tài)的乳腺癌中的表達以及與患者預后的關系 在bc－GenExMiner 數據中，分析RasGRF1 表達和乳腺癌患者激素水平以及淋巴結狀態(tài)的關系發(fā)現：與無淋巴結轉移的乳腺癌組織相比，RasGRF1 在淋巴結轉移的乳腺癌組織中高表達（圖4A，P＜0．000 3），并且在有淋巴結轉移的乳腺癌組織中，與RasGRF1 低表達組相比，RasGRF1高表達患者具有較差的OS（HR=1．86，95%CI：1．34～2．57，P=0．000 2）（圖4C），RasGRF1 表達對無淋巴結轉移的乳腺癌患者預后無顯著影響（HR=0．94，95%CI：0．69～1．28，P=0．688 9）（圖4B）；分析乳腺癌患者ER 狀態(tài)時發(fā)現：與ER+的乳腺癌組織相比，Ra sGRF1 在ER－的乳腺癌組織中高表達（圖4D，P＜0．000 1），但是RasGRF1 表達對單獨ER+或者ER－的乳腺癌患者的預后無顯著影響（圖4E、4F）；分析乳腺癌患者PR 狀態(tài)時發(fā)現：與PR+的乳腺癌組織相比，RasGRF1 在PR－的乳腺癌組織中高表達（4G，P＜0．000 1），并且在PR－的乳腺癌中，與Ras－GRF1 低表達組相比，RasGRF1 高表達患者具有較差OS 的趨勢（HR=1．66，95%CI：0．99～2．79，P=0．056 3）（圖4I），RasGRF1 表達對PR+乳腺癌患者預后無顯著影響（HR=0．90，95%CI：0．68～1．18，P=0．444 8）（圖4H）。

圖4 bc-GenExMiner 數據分析RasGRF1 在不同分型乳腺癌患者中的表達及其與預后的關系Fig 4 Analysis of RasGRF1 expression in different types of breast cancer patients and its relationship with prognosis by using bc-GenExMiner data

進一步在bc－GenExMiner 數據中聯合分析RasGRF1 在不同ER/PR 狀態(tài)的乳腺癌中的表達以及與患者預后的關系，結果表明，與ER+/PR+、ER+/PR－、ER－/PR+類型的乳腺癌組織相比，RasGRF1 在ER－/PR－類型乳腺癌組織中表達最高，在ER+/PR+的乳腺癌中表達最低（圖5A，P＜0．000 1）。同時分析生存數據結果顯示，在乳腺癌組織中，RasGRF1 高表達的乳腺癌患者具有較差的OS（HR=1．29，95%CI：1．04 ～1．6，P=0．019）（圖5B）；RasGRF1 表達對ER+/PR+（HR=0．85，95%CI：0．64～1．12，P=0．252 9）（圖5C）、ER+/PR－（HR=1．37，95%CI：0．63～2．96，P=0．427 6）（圖5D）、ER－/PR+（HR=0．65，95%CI：0．06～7．18，P=0．725 2）（圖5E）類型的乳腺癌患者預后無顯著影響。在ER－/PR－類型乳腺癌患者中，Ras－GRF1 高表達患者具有較差的OS（HR=2．05，95%CI：1．01～4．19，P=0．048 4）（圖5F）。

圖5 bc-GenExMiner 數據分析RasGRF1 在ER/PR 狀態(tài)的乳腺癌患者中的表達及其與預后的關系Fig 5 Analysis of RasGRF1 expression and its relationship with prognosis in breast cancer patients with ER/PR status by using bc-GenExMiner data

2.5 RasGRF1 影響PR－和ER－/PR－類型乳腺癌患者預后的分子機制 圖6A 為ER-乳腺癌中與Ras－GRF1 表達相關的基因火山圖，進一步篩選與Ras－GRF1 表達高度相關的基因進行KEGG 富集分析發(fā)現：多數基因參與細胞黏附信號通路（圖6B）。同樣，在ER-/PR-型乳腺癌分析發(fā)現，多數基因參與輔助性T 細胞（Th）1 和Th2 細胞分化的通路（圖6C、6D）。

圖6 乳腺癌中與RasGRF1 表達相關的基因分析Fig 6 Analysis of genes associated with RasGRF1 expression in breast cancer

2.6 在ER-/PR-類型的乳腺癌中篩選調控 Ras－GRF1 表達的miRNA 在LinkedOmics 數據資料中，選擇PR-和ER-/PR-類型的乳腺癌，分析該類型的乳腺癌中與RasGRF1 表達相關的miRNA，圖7A 是與RasGRF1 呈正相關的前50 個基因，其中，hsa-mir-769 和RasGRF1 相關性最強（圖7B，P=1.348e-04，RS=0.659 50）。

圖7 分析ER-/PR-乳腺癌中與RasGRF1 表達相關的miRNAFig 7 Analysis of miRNA associated with RasGRF1 expression in ER-/PR-breast cancers

3 討論

研究顯示，RasGRF1 可以通過促進Ras 與GDP釋解離以及Ras 與GTP 的結合來激活Ras[5]。Ras蛋白在某些細胞的增殖、存活和分化中發(fā)揮關鍵作用[4-5]。且參與并促進多種腫瘤進展[8-10，14-15]。

筆者通過免疫組織化學染色首先明確Ras－GRF1 在乳腺癌組織中主要為胞漿和胞膜表達，然后基于TIMER 數據庫和TCGA 數據庫分析發(fā)現：相較于正常乳腺組織，乳腺癌組織中RasGRF1 表達水平明顯升高。并且進一步的預后分析結果顯示：與正常乳腺組織相比，RasGRF1 在乳腺癌組織中高表達，且乳腺癌組織中RasGRF1 高表達的患者預后更差，同時單因素和多因素Cox 回歸分析發(fā)現Ras－GRF1 可作為乳腺癌患者預后的獨立預測因子。這一點與既往研究報道的RasGRF1 在星形細胞瘤、膠質瘤瘤和結直腸癌等惡性腫瘤中的表達與患者的預后呈負相關是一致的[8-9]。

乳腺癌治療和預后主要受激素受體和人表皮生長因子2（HER2）的影響[16]。不同ER 和PR 狀態(tài)對乳腺癌患者預后影響不同[17-19]。因此，準確定義不同類型的乳腺癌生物標志物對于精準治療至關重要。同時筆者還發(fā)現：與淋巴結陰性的乳腺癌組織相比，RasGRF1 在淋巴結陽性的乳腺癌組織中高表達，并且在淋巴結陽性的乳腺癌中，RasGRF1 高表達患者預后較差；與ER+的乳腺癌組織相比，Ras－GRF1 在ER-的乳腺癌組織中高表達，但是Ras－GRF1 表達對ER+或者ER-的乳腺癌患者的預后無顯著影響；與PR+的乳腺癌組織相比，RasGRF1 在PR-的乳腺癌組織中高表達，并且在PR-的乳腺癌中，RasGRF1 高表達具有較差預后的趨勢。聯合分析RasGRF1 在不同ER/PR 狀態(tài)乳腺癌中的表達發(fā)現：RasGRF1 在ER-/PR-的乳腺癌中高表達，并且高表達者預后差。綜上所述，RasGRF1 表達可能是影響PR-和ER-/PR-乳腺癌進展的關鍵因素。

進一步研究發(fā)現，在ER-和ER-/PR-型乳腺癌中RasGRF1 可能分別通過調控細胞黏附和Th1/Th2 細胞分化來影響乳腺癌患者生存。在ER-/PR-乳腺癌中hsa-mir-769 可能是調控RasGRF1 表達的microRNA。先前的研究表明，hsa-mir-769-5p 可以促進多個腫瘤的發(fā)生和進展，例如在食管癌、肝癌、骨肉瘤和膠質瘤中高表達，且hsa-mir-769-5p高表達的患者預后差[20-23]。在肝癌、骨肉瘤和膠質瘤中hsa-mir-769-5p 通過促進腫瘤細胞增殖和遷移促進腫瘤進展[21-23]。同時，hsa-mir-769 在黑色素瘤中高表達，并且促進黑色素瘤細胞增殖[24]，但hsamir-769 在乳腺癌中作用和機制尚無報道，需進一步研究。

綜上所述，本研究通過分析RasGRF1 表達與乳腺癌患者臨床病理特征和生存預后之間的關系，為尋找乳腺癌患者預后的生物標志物奠定了科學基礎。