韓鑫宇，李婷芳，王峰

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系，天津 300070）

骨肉瘤是一種起源于類骨質(zhì)組織，常見于兒童和青少年的惡性骨腫瘤，具有極強(qiáng)的侵襲性并且常常在早期發(fā)生轉(zhuǎn)移，主要涉及股骨、脛骨和肱骨[1-2]。端粒延長(zhǎng)是腫瘤生長(zhǎng)所必需的關(guān)鍵過程，不同于絕大多數(shù)腫瘤通過激活端粒酶來維持端粒，以骨肉瘤為代表的10%～15%的人類腫瘤通過端粒延長(zhǎng)替代途徑（alternative lengthening of telomeres pathway，ALT）來維持端粒。使用ALT 延長(zhǎng)端粒的腫瘤細(xì)胞具有獨(dú)特的ALT 相關(guān)表型，例如含有端粒DNA 的大型早幼粒細(xì)胞白血病體（promyelocyte leukemia，PML），稱為ALT 相關(guān)PML 小體（ALT-related PML bodies，APBs）以及染色體外端粒DNA 環(huán)（C-circle）等[3-4]。

生長(zhǎng)停滯和DNA 損傷誘導(dǎo)蛋白45a（GADD45A）定位于細(xì)胞核，其水平受周期調(diào)控，在G1 期最高而S期顯著降低。GADD45A 在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用[5-6]。此外還有研究表明，GADD45A 參與了小鼠干細(xì)胞端粒DNA 損傷反應(yīng)[7]。GADD45A 在細(xì)胞周期進(jìn)展和停滯、DNA 修復(fù)和表觀遺傳修飾等多方面的作用與ALT 陽性腫瘤頻繁的DNA 損傷等特點(diǎn)高度相關(guān)[7-8]。因此本文旨在探討GADD45A 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、端粒功能和端粒延長(zhǎng)替代途徑的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人骨肉瘤細(xì)胞U2OS 為本實(shí)驗(yàn)室保存，DMEM 培養(yǎng)基（美國Corning 公司），Opti-MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國Gibco 公司），胎牛血清（烏拉圭Lonsera 公司），ChamQ Mix、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、dNTP Mix（南京諾維贊生物科技有限公司），DNA 提取試劑盒（Biomiga 倍沃醫(yī)學(xué)科技有限公司），RNA提取試劑盒（美國Promega 公司），無水乙醇、無水甲醇、異丙醇、冰乙酸（天津康科德生物化工公司），4%多聚甲醛、1 mol/L Tris-HCl（pH7.2）、牛血清白蛋白（BSA）、6×DNA loading buffer（北京索萊寶生物技術(shù)公司），國產(chǎn)甲酰胺、秋水仙素（上海生工生物技術(shù)股份有限公司），進(jìn)口甲酰胺、TritonX-100、TWEEN-20、Gelatin from cold water fish（美國Sigma 公司），Blocking Reagent、DIG Easy Hyb Granules、CD-Star Ready-to-use solution、Anti-DIG-AP 抗體（瑞士Roche公司），TelC-FITC PNA 探針488/CY3（韓國Panagene公司），DAPI、Anti-γH2AX 抗體（德國Millipore 公司），Anti-PML 抗體（C-5）（Santa Cruz），Alexa 555 goat anti-Mouse 抗體、Lipofectamine RNAi-Max（美國Thermo 公司），siRNA（蘇州吉瑪基因有限公司），Phi 29 DNAPolymerase（美國NEB 公司），DNase/RNase free water（天根生化科技有限公司），細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒CCK-8（蘭杰柯科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將U2OS 細(xì)胞接種于10 cm 培養(yǎng)皿中，以DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 siRNA 轉(zhuǎn)染 將U2OS 細(xì)胞接種于6 孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為40%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取兩支離心管加入Opti-MEM 后分別加入siRNA 和Lipofectamine RNAi-Max，震蕩混勻后將兩管混合，室溫靜置5 min 后逐滴加入對(duì)應(yīng)細(xì)胞中，反應(yīng)24 h 后棄去轉(zhuǎn)染液每孔加入2 mL 培養(yǎng)基，48 h 后收取細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。對(duì)應(yīng)siRNA 序列見表1。

表1 目的基因siRNA 序列Tab 1 siRNA sequences of the target gene

1.2.3 穩(wěn)定敲低細(xì)胞系構(gòu)建 使用pLKO.1 質(zhì)粒構(gòu)建shGADD45A 敲低細(xì)胞系。shRNA 序列見表2。用293T 細(xì)胞對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行包被，吸取過濾病毒上清感染U2OS 細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定敲低細(xì)胞系。

表2 shRNA 序列Tab 2 Sequence of shRNA

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 收取細(xì)胞，試劑盒提取RNA。測(cè)量RNA 濃度后根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg RNA 逆轉(zhuǎn)合成cDNA，稀釋5 倍后用于后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR。按照primer F 0.4 μL、primer R 0.4 μL、ChamQ Mix 10 μL、無核酸酶水7.2 μL 的體系按照程序進(jìn)行擴(kuò)增（表3）。根據(jù)熒光曲線的ct 值用2-ΔΔCt計(jì)算siRNA 敲低效率。

表3 PCR 引物序列Tab 3 Primer sequence for PCR

1．2．5 CCK－8 增殖實(shí)驗(yàn) 牛鮑汁計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)U2OS細(xì)胞，96 孔板每孔接種1 000 個(gè)細(xì)胞，每個(gè)處理組設(shè)置6 組重復(fù)。分別測(cè)量轉(zhuǎn)染后第1、3、5、7 天的450 nm 處吸光度值。

1.2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn) 牛鮑汁計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)U2OS 細(xì)胞，6 cm 皿接種5 000 個(gè)細(xì)胞，每3 天換1 次液，第7 天收取培養(yǎng)皿。吸棄培養(yǎng)基并用超純水潤洗，然后加4%組織固定液固定20 min。洗凈固定液后加入0．5%結(jié)晶紫染液，染色20 min。洗凈多余染液，在吸水紙上倒扣瀝干水分，拍照保存用于后續(xù)分析。

1.2.7 細(xì)胞中期分裂相－熒光原位雜交（Metaphase－FISH） 直接接種穩(wěn)定敲低細(xì)胞或?qū)2OS 接種于6 cm 培養(yǎng)皿，進(jìn)行siRNA 轉(zhuǎn)染，收取細(xì)胞前10 h更換含秋水仙素的DMEM 培養(yǎng)基（秋水仙素∶培養(yǎng)基=1∶100）。細(xì)胞沉淀加入PBS 重懸，邊震蕩邊加入10 mL 37℃預(yù)熱的0．075 mol/L Kcl，37℃水浴孵育30 min，然后加入5 滴預(yù)冷固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1），室溫靜置5 min，900 r/min 離心8 min。吸棄上清液，邊震蕩邊加入10 mL 預(yù)冷固定液，室溫靜置30 min，900 r/min 離心8 min。吸棄上清液，加1 mL 固定液重懸并取50 μL 滴片，靜置1 晚。第2 天用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，脫水后用TelC－FITC PNA 探針CY3 雜交端粒3 h，洗滌封片，－20℃保存用于后續(xù)拍攝統(tǒng)計(jì)。

1.2.8 免疫熒光－熒光原位雜交（IF－FISH） 將無菌蓋玻片放入六孔板中，直接接種穩(wěn)定敲低細(xì)胞或接種U2OS 細(xì)胞并進(jìn)行siRNA 轉(zhuǎn)染。收取蓋玻片洗滌固定，脫水后用TelC－FITC PNA 探針488 雜交端粒3 h，PBG 封閉1 h（PBS∶BSA∶Gelatin=1∶1∶100），加入一抗室溫孵育1 h（PML∶PBG=1∶1 000，γH2AX∶PBG=1∶1 000），洗滌后二抗室溫孵育30 min（Alexa 555 goat anti－Mouse∶PBG=1∶1 000），DAPI 封片，熒光顯微鏡拍攝并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.9 C－circle 實(shí)驗(yàn) 收取細(xì)胞提取DNA，測(cè)濃度后稀釋至30 ng/μL 并按DNA template 1 μL、BSA 0．4 μL、dNTP Mix 2 μL、Phi 29 DNA Polymerase 0．5 μL、Phi 29 buffer 0．4 μL、無核酸酶水14．1 μL的體系進(jìn)行PCR 反應(yīng)擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?0℃，8 h；65℃，20 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行斑點(diǎn)雜交，紫外交聯(lián)固定后雜交過夜。第2 天回收雜交液并洗膜、封閉，孵育DIG 抗體8～10 h。孵育結(jié)束后洗膜最后用CDStar 顯色液曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism6 和Image J 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用t 檢驗(yàn)，P＜0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GADD45A 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)siRNA 和shRNA 對(duì)GADD45A的敲低效率。與對(duì)照組相比，siRNA 敲低GADD45A后mRNA 水平顯著降低（t=25．96，P＜0．000 1）；與shscramble 組相比，shGADD45A－1 和shGADD45A－2兩細(xì)胞系GADD45A 的mRNA 水平下降（t=21．12、18．37，均P＜0．000 1）（圖1）。CCK－8 增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在siRNA 敲低GADD45A 后或穩(wěn)定敲低細(xì)胞系shGADD45A－1 和shGADD45A－2 中，與對(duì)照組相比，骨肉瘤細(xì)胞存活率明顯下降（t=5．051、6．192、3．775、14．86、22．93、3．013、14．61、20．93，均P＜0．05）（圖2A、2B）。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在siRNA 敲低GADD45A 后以及shGADD45A－1 和shGADD45A－2兩組穩(wěn)定敲低細(xì)胞系中，骨肉瘤細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，克隆形成減少（t=46．68、23．73、24．98，均P＜0．000 1），見圖2C～2D。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)GADD45A mRNA 水平Fig 1 Expression of GADD45A mRNA detected by real-time fluorescence quantitative PCR

圖2 GADD45A 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響Fig 2 The effect of GAD45A on the proliferation of osteosarcoma cells

2.2 GADD45A 對(duì)骨肉瘤端粒功能的影響 細(xì)胞中期分裂相－熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)顯示，siRNA 敲低GADD45A 與shGADD45A－1 和shGADD45A－2 穩(wěn)定敲低處理后結(jié)果相同，染色體末端多端粒信號(hào)（Multiple Telomere Signals，MTSs）比例明顯升高（t=24．04、7．243、27．93，均P＜0．01），端粒信號(hào)丟失（Telomere Signal Free Ends，SFEs）頻率也相應(yīng)增加（t=8．222、16．61、6．781，均P＜0．01）（圖3）。

圖3 GADD45A 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞端粒功能的影響Fig 3 The effect of GADD45A on the telomere function of osteosarcoma cells

2．3 GADD45A 對(duì)骨肉瘤端粒損傷造成的影響 免疫熒光－熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在使用siRNA敲低GADD45A 和shGADD45A－1、shGADD45A－2 兩細(xì)胞系中，DNA 損傷指標(biāo)γ－H2AX 與端粒共定位均上調(diào)（t=19．16、14．71、24．03，均P＜0．000 1）（圖4）。

圖4 GADD45A 對(duì)骨肉瘤端粒損傷造成的影響Fig 4 The effect of GADD45A on the telomere damage of osteosarcoma cells

2.4 GADD45A 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞ALT 活性的影響 C－circle 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用siRNA 敲低GADD45A 時(shí)，骨肉瘤細(xì)胞中C－circle 水平明顯上升（t=41．27，P＜0．000 1）（圖5A）。采用shGADD45A－1 和shGADD45A－2 兩細(xì)胞系也顯示C－circle 水平升高（t=14．06、4．539，均P＜0．05）（圖5B）。另一方面，通過免疫熒光－熒光原位雜交實(shí)驗(yàn)，siRNA 和shRNA 的處理均導(dǎo)致PML 與端粒共定位顯著增多（t=10．65、16．69、18．10，均P＜0．000 1），見圖5C～5D。

圖5 GADD45A 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞ALT 活性的影響Fig 5 The effect of GADD45A on the ALT activity of osteosarcoma cells

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)敲低GADD45A 后抑制了骨肉瘤細(xì)胞的增殖，導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞存活率下降。而端粒延長(zhǎng)是腫瘤細(xì)胞維持增殖所必需的關(guān)鍵特征[9]。與端粒酶陽性腫瘤不同，ALT 陽性腫瘤端粒存在頻繁的DNA損傷。并且已有文獻(xiàn)報(bào)道GADD45A 參與了造血干細(xì)胞的DNA 損傷反應(yīng)[10]。因此，本文通過H2AX 組蛋白變體（γ－H2AX）與端粒的定位來表征端粒損傷信號(hào)，首次發(fā)現(xiàn)敲低GADD45A 會(huì)引起骨肉瘤端粒損傷加劇。另一方面，本研究首次發(fā)現(xiàn)敲低GADD45A 會(huì)引起骨肉瘤細(xì)胞MTS 和SFE 顯著升高，表明GADD45A缺失會(huì)導(dǎo)致骨肉瘤端粒功能紊亂和復(fù)制性衰老并且引起端粒不穩(wěn)定，加重脆性端粒的產(chǎn)生。

目前已有的研究表明，在間充質(zhì)來源的腫瘤中，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤和多種亞型的肉瘤，往往存在更高比例、更高水平的ALT 表型，這之中又以骨肉瘤最為突出[11]。APBs 是由早幼粒細(xì)胞白血病體（PML）、成簇聚集的端粒和一系列與DNA 復(fù)制、重組等功能相關(guān)的蛋白形成的復(fù)合體，是ALT 途徑延長(zhǎng)端粒的場(chǎng)所。PML 是ALT 細(xì)胞形成APBs 并進(jìn)一步維持端粒長(zhǎng)度，造成端粒長(zhǎng)度異質(zhì)性的必要組分[12]。為了探究GADD45A 對(duì)ALT 的影響，筆者通過免疫熒光觀察PML 與端粒的共定位，發(fā)現(xiàn)在敲低GADD45A后，PML 與端粒的共定位明顯增多，說明GADD45A抑制了端粒到PML 的聚集，在ALT 途徑中發(fā)揮了負(fù)向調(diào)控作用。除此之外，C－circle 作為ALT 陽性腫瘤中的一種特異性且可定量的指標(biāo)，可以更清晰地反映ALT 活性的變化。C－circle 是染色體外的CCCTAA 重復(fù)序列，來自于端粒的后隨鏈，與端粒TTAGGG 重復(fù)序列相對(duì)應(yīng)[4]。本研究首次發(fā)現(xiàn)在敲低GADD45A 后，C－circle 水平顯著升高，與前面結(jié)果一致，說明GADD45A 抑制骨肉瘤細(xì)胞C－circle形成，限制了ALT 途徑發(fā)生。有文獻(xiàn)報(bào)道，ALT 途徑的過度激活會(huì)抑制ALT 細(xì)胞的生長(zhǎng)[13-14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲低GADD45A 后，ALT 表型明顯增加，ALT 活性增加，細(xì)胞增殖受到抑制，有可能是因?yàn)镚ADD45A 的缺失導(dǎo)致ALT 被過度激活，這也會(huì)導(dǎo)致ALT 細(xì)胞的死亡。

目前研究認(rèn)為，ALT 是一種以類似于同源重組的斷裂誘導(dǎo)復(fù)制（BIR）的方式進(jìn)行端粒延長(zhǎng)的途徑[15]。在端粒DNA 損傷斷裂后會(huì)激活RFC-PCNAPol δ 軸來促進(jìn)APB 的組裝，開始后續(xù)RAD52 依賴和不依賴的兩種BIR 通路，整個(gè)過程還涉及BRCA1、RAD51 等多個(gè)同源重組相關(guān)蛋白[16-18]。本文已經(jīng)證實(shí)GADD45A 確實(shí)參與了骨肉瘤的ALT 進(jìn)程，結(jié)合以往文獻(xiàn)報(bào)道GADD45A 與PCNA 存在相互作用，提示其可能影響了DNA 損傷反應(yīng)進(jìn)而抑制骨肉瘤ALT 活性[19]。此外，已有研究表明GADD45A 可以與R-loop 結(jié)合介導(dǎo)CpG 島的局部去甲基化[20]。亞端粒區(qū)豐富的CG 含量提示這一過程在亞端粒位置同樣有可能實(shí)現(xiàn)[21]。GADD45A 介導(dǎo)的去甲基化過程可能抑制端粒區(qū)的異染色質(zhì)化，使染色質(zhì)收縮，從而阻礙ALT 相關(guān)蛋白與端粒的結(jié)合。這與過往研究中提到的ALT 端粒處松弛的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)這一特點(diǎn)有所呼應(yīng)[22]。另一方面，筆者推測(cè)GADD45A 與BRCA1的相互作用也有助于GADD45A 與R-loop 的結(jié)合，R-loop 進(jìn)一步刺激同源重組過程也是引起ALT 相關(guān)表型變化的原因[19，23]，后續(xù)筆者會(huì)對(duì)GADD45A 如何調(diào)控ALT 進(jìn)行深入的探究。

綜上所述，GADD45A 缺失能夠抑制骨肉瘤增殖，并通過參與骨肉瘤ALT 徑影響端粒功能，造成端粒功能紊亂，加劇端粒DNA 損傷。