孫一萌，劉浩，劉軍艦，吳艷麗，張西波，戚經(jīng)天，李忠廉

（1．天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津 300070；2．湖北省第三人民醫(yī)院腎內(nèi)科，武漢 430033；3．天津市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院肝膽胰外科二，天津 300100；4．東營市中醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，東營 257055）

阻塞性黃疸多因膽管結(jié)石、膽道閉塞、腫瘤壓迫等膽管機(jī)械性梗阻使膽汁淤積，無法排除所致。通常會引起肝功能指標(biāo)異常和肝細(xì)胞損害以及高膽紅素血癥、高膽汁酸血癥、內(nèi)毒素血癥、細(xì)菌移位等病理改變，造成多器官功能障礙，其中肝損傷首當(dāng)其沖[1]。肝細(xì)胞凋亡是肝損傷最重要的基本發(fā)病機(jī)制之一，細(xì)胞凋亡是引起肝臟損傷和肝臟疾病的中心環(huán)節(jié)[2]。茵陳蒿湯的主要組成藥物是茵陳蒿、梔子、大黃，具有清熱利膽、保肝疏肝、抗纖維化、降低血糖、降低血脂、抗炎止痛、抑制肝細(xì)胞凋亡的多種功效，對治療肝損傷有很好的作用。近年來，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）在肝細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，目前尚未完全闡明。未折疊蛋白（UPR）應(yīng)答是ERS 的一個(gè)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，它包括肌醇依賴性激酶（IRE）1α 和蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）、轉(zhuǎn)錄活化因子6（ATF6）3 個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）是ERS 誘導(dǎo)表達(dá)的關(guān)鍵蛋白，是ERS 與UPR 應(yīng)答啟動的一個(gè)標(biāo)志。課題組在前期實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，IRE1α、PERK 介導(dǎo)ERS 過程中可能存在阻塞性黃疸肝細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，茵陳蒿湯肝臟保護(hù)機(jī)制也可能與ERS 在IRE1α 和PERK 介導(dǎo)下發(fā)揮相關(guān)作用有關(guān)[3-4]。本研究通過建立阻塞性黃疸肝損傷細(xì)胞模型，探討阻塞性黃疸的肝損傷機(jī)制與ATF6 介導(dǎo)的信號通路的關(guān)系，進(jìn)一步闡明茵陳蒿湯減輕肝損害的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物與細(xì)胞 健康SPF 級Sprague-Dawley（SD）大鼠12 只[許可證號：SCXK-（軍）2014-0001]，體重200 g 左右（北京華阜康生物科技股份有限公司），在室溫20～25℃，相對濕度（50±20）%，12 h/12 h明暗周期的環(huán)境下分籠飼養(yǎng)于動物實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為大鼠正常肝細(xì)胞BRL-3A，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，使用DMEM 高糖培養(yǎng)基+1%青鏈霉素培養(yǎng)。接種于直徑6 cm 的培養(yǎng)皿中，每2～3 d 傳代1次，取生長情況良好的細(xì)胞用于本次實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑、藥物與儀器 茵陳蒿湯由茵陳蒿30 g、梔子20 g、大黃10 g 組成（天津市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（Hyclone 公司，美國）；胎牛血清、胰蛋白酶（EDTA）（Gibco 公司，美國）；二甲基亞砜（DMSO）（Sigma 公司，美國）；Anti-actin、Anti-ATF6、Anti-CHOP、Anti-GRP78、兔二抗、鼠二抗（北京百奧思科公司，貨號分別為MD409、MD4830、MD4846、MD886、MD2141、MD2142）；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo Scientific 公司，美國，貨號K1621）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time PCR）試劑盒（南京建成公司，貨號N117）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（MDL 公司，貨號MD913053）；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（德國羅氏，貨號11684795910）；大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）ELISA 試劑盒（澤葉生物公司，貨號ZY60182R）；大鼠天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）ELISA 試劑盒（澤葉生物公司）。BHC-1300ⅡA2 型超凈工作臺（蘇州金凈凈化設(shè)備科技有限公司）；311 型CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo 公司，美國）；3-30型號K 低溫離心機(jī)（Sigma 公司，德國）；電熱恒溫水浴槽（上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠）；倒置相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；TS-100 型脫色搖床（海門其林貝爾儀器制造公司）；BG-sub MIDI 型電泳儀（北京百晶生物技術(shù)有限公司）；170-8280 型ChemiDoc MP 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-rad 公司，美國）；Gel Doc-It310 型凝膠成像系統(tǒng)（UVP 公司，美國）；SDSPAGE 電泳系統(tǒng)（BIO-Rad 公司，美國）；QuantStudio 3 型PCR 擴(kuò)增儀（ABI 公司，美國）；T100 型熱循環(huán)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀。

1.1.3 中藥及含藥血清制備 中藥冷水浸泡30 min后大火燒開，轉(zhuǎn)文火煎藥45 min，再次加水以文火煎30 min，保留湯藥。阻塞性黃疸血清：SD 大鼠麻醉后消毒，上腹正中切口入腹，膽總管中上1/3 行雙重結(jié)扎，7 d 后留取阻塞性黃疸模型大鼠血清。茵陳蒿湯含藥血清：根據(jù)茵陳蒿湯的臨床用量計(jì)算出大鼠的等效劑量，按每100 g 體重1 mL 茵陳蒿湯劑量給SD 大鼠灌胃[5]，2 次/d，連續(xù)灌胃7 d，末次給藥2 h 后采血，留取茵陳蒿湯含藥血清。下腔靜脈采血，3 000 r/min 離心15 min，分離血清，經(jīng)56℃、30 min 滅火處理后，用0.22 μm 微孔濾膜過濾細(xì)菌，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組與處理 將濃度為2×105/mL 的BRL-3A 細(xì)胞接種到12 孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，共接種27 孔，置CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞貼壁達(dá)80%左右后將培養(yǎng)板移至超凈工作臺，吸棄每孔中的培養(yǎng)基并用PBS 緩沖液洗2 次，27 孔被隨機(jī)分為3 組，每組9 孔，分別為對照組（S 組）：DMEM高糖培養(yǎng)基+15%胎牛血清常規(guī)培養(yǎng)；阻塞性黃疸組（O 組）：DMEM 高糖培養(yǎng)基+5%阻塞性黃疸血清+10%胎牛血清；阻塞性黃疸+茵陳蒿湯組（Y 組）：DMEM 高塘培養(yǎng)基+5%阻塞性黃疸血清+10%茵陳蒿湯含藥血清。3 組細(xì)胞加入含相應(yīng)血清的培養(yǎng)基2 mL，分別在培養(yǎng)6、24、48 h，3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)取細(xì)胞沉淀與上清液，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組取3 孔。用Western 印跡法與q－PCR 測每組細(xì)胞中ATF6、GRP78、CHOP蛋白與基因含量，上清液中測ALT、AST 含量。

1.2.2 細(xì)胞一般形態(tài)觀察 將細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，觀察細(xì)胞培養(yǎng)液的顏色和清澈度，用20 倍物鏡觀察細(xì)胞的輪廓、形狀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（q－PCR）檢測BRL－3A細(xì)胞中ATF6、GRP78、CHOP mRNA 的水平 按照說明書裂解組織，提取總RNA 并檢測其濃度和純度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成擴(kuò)增前cDNA。以2 μL cDNA 為模板，甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參mRNA，用SYBR Green 按95℃順序預(yù)變性2 min，94℃變性20 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)，按照2－ΔΔCt法進(jìn)行定量分析，PCR 引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)，所需引物見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2.4 Western 印跡檢測BRL－3A 中ATF6、GRP78、CHOP 蛋白表達(dá) 根據(jù)BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白變性后，以每孔40 μg 的量進(jìn)行上樣，進(jìn)行電泳分析，轉(zhuǎn)膜，封閉，裁剪目的條帶，按照說明書配制稀釋比例均為1∶1 000，將剪取條帶置于一抗4℃條件下孵育過夜，TBST 洗膜，按照說明書以兔二抗1∶2 000 的稀釋比例配制二抗稀釋液，室溫孵育2 h，洗膜，成像儀上進(jìn)行信號檢測，分析條帶。

1.2.5 原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測細(xì)胞凋亡情況 根據(jù)說明書，使用TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒進(jìn)行TUNEL 染色，檢測細(xì)胞凋亡。通過末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）結(jié)合生物素化的脫氧核苷酸DNA 片段。用TACS Blue Label 檢測生物素化核苷酸。TUNEL 染色后，切片用4′－6－二氨基－2－苯基吲哚（DAPI）復(fù)染以檢測細(xì)胞核，呈藍(lán)色染色。TUNEL陽性細(xì)胞為綠色染色的細(xì)胞（波長488 nm）。

1.2.6 ELISA 試劑盒檢測培養(yǎng)液中ALT、AST 情況 收集得各孔細(xì)胞培養(yǎng)液，將細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)離心機(jī)3 000 r/min 離心10 min，取上層液使用全自動生化儀檢測各組血清ALT、AST 水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 26．0 軟件包分析數(shù)據(jù)。正態(tài)分布的計(jì)量資料用±s 表示，多組之間的比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t 檢驗(yàn)，P＜0．05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 BCL－3A 大鼠肝細(xì)胞的正常形態(tài)特征如圖1A、1B、1C 所示。與S 組相比，O 組和Y 組細(xì)胞在所有時(shí)間點(diǎn)（圖1D、1E、1F）均明顯變小、變形，數(shù)量減少；但與O 組相比，Y 組細(xì)胞狀態(tài)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)（圖1G、1H、1I）均有顯著改善。

圖1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（100×）Fig 1 Changes in cell morphology（100×）

2.2 TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡 TUNEL 陽性染色結(jié)果如圖2 所示。與S 組相比，O 組和Y 組在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的凋亡指數(shù)均升高；與O 組相比，Y 組在各時(shí)間點(diǎn)的凋亡指數(shù)均下降（均P＜0．05），見表2。

圖2 TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡（100×）Fig 2 Apoptosis detected by TUNEL（100×）

表2 BCL-3A 大鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)（%，±s）Tab 2 Hepatocyte apoptosis index in BCL-3A rats（%，±s）

表2 BCL-3A 大鼠肝細(xì)胞凋亡指數(shù)（%，±s）Tab 2 Hepatocyte apoptosis index in BCL-3A rats（%，±s）

注：O 組：阻塞性黃疸血清配制的培養(yǎng)基培養(yǎng)的阻塞性黃疸組；Y 組：梗阻性黃疸血清+茵陳蒿湯含藥血清配制的培養(yǎng)基培養(yǎng)的阻塞性黃疸+茵陳蒿湯組

時(shí)間點(diǎn)S 組O 組Y 組FP 6 h2．47±0．91 10．40±1．41 4．66±0．7351．94 ＜0．001 24 h8．73±1．76 24．56±1．96 13．93±1．91 46．62 ＜0．001 48 h15．64±1．29 50．95±3．04 21．79±2．70 241．4 ＜0．001

2.3 mRNA 的表達(dá)水平 q－PCR 顯示，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，O 組和Y 組的ATF6、GRP78 和CHOP 的mRNA表達(dá)水平均高于正常組（均P＜0．05）。與O 組相比，Y 組在各時(shí)間點(diǎn)的ATF6、GRP78 和CHOP mRNA表達(dá)水平均顯著降低（F=52．46、129．5、280．9，91．87、81．36、108．4，79．95、62．98、43．40，均P＜0．05），見圖3。

圖3 茵陳蒿湯對ATF6、GRP78 和CHOP mRNA 表達(dá)的影響Fig 3 Effects of Yinchenhao decoction on the expression of ATF6，GRP78 and CHOP mRNA

2.4 蛋白質(zhì)表達(dá)水平 Western 印跡顯示，與S 組比較，O 組和Y 組的CHOP、ATF6 和GRP78 蛋白表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)均高于S 組（均P＜0．05）。與O 組相比，Y 組的CHOP、ATF6 和GRP78 蛋白表達(dá)水平在各時(shí)間點(diǎn)均顯著降低（F=88．36、59．90、46．07，127．7、111．2、107．1，71．09、107．0、154．3，均P＜0．05），見圖4。

圖4 Western 印跡檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)水平Fig 4 The expression of the protein detected by Western blotting

2．5 各時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液中ALT、AST 測定結(jié)果 與S組比較，O 組與Y 組在各時(shí)間點(diǎn)AST、ALT 水平均高于S 組（均P＜0．05）；與O 組比較，Y 組在各時(shí)間點(diǎn)AST、ALT 水平均低于O 組，但較S 組高（均P＜0．05），見表3。

表3 ALT、AST 測定結(jié)果Tab 3 Results of ALT and AST determination

3 討論

長期膽道梗阻可使膽汁阻塞無法正常排出，膽汁瘀滯不暢使膽管增寬擴(kuò)張，含毒素膽汁也隨流入血中，肝臟在毒素作用下產(chǎn)生炎癥，毒素在膽道梗阻的作用下因不能排出體外而形成內(nèi)毒素血癥，內(nèi)毒素與肝損傷的形成有直接關(guān)系，進(jìn)而可能導(dǎo)致肝纖維化，嚴(yán)重者會導(dǎo)致肝功能衰竭[6－7]。從中醫(yī)理論來講，黃疸多以感染濕熱、疫毒、寒濕為主，皮膚橘黃、顏色鮮明為多陽黃，病因以感受濕熱之邪，邪濕內(nèi)蘊(yùn)為主，發(fā)病較急，病程較短；皮膚雖黃但顏色晦暗多為陰黃，多以感受寒濕之邪為主，發(fā)病較緩，病程較長。梗阻性黃疸的病因若持續(xù)存在，會升高膽紅素，引起皮膚鞏膜黃染，嚴(yán)重時(shí)可能會引起肝細(xì)胞損害，因此利用茵陳蒿湯降低膽紅素，進(jìn)而褪去黃疸和治療肝損害成為治療本病的關(guān)鍵。茵陳蒿湯作為古今清熱、利濕、退黃的代表方劑，主要用于治療濕熱證為主的黃疸病。雖用藥頗簡，配伍卻十分嚴(yán)謹(jǐn)。此方茵陳為君藥，藥量達(dá)6 兩，重取其清熱利濕、利膽退黃之功效，從而利小便排出濕熱之邪。梔子作為臣藥，用量14 枚以清利中焦與下焦的濕熱之邪，佐以大黃2 兩，增強(qiáng)其清熱瀉火退黃、瀉下攻積之功效，使谷疸不留于宿食，濕熱瘀積之邪褪去，黃疸則消?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，茵陳色原酮可以阻滯細(xì)胞周期從而抑制前列腺癌細(xì)胞增殖[8]，茵陳蒿中乙酸乙酯能夠通過阻斷磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B 信號通路來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡[9]。梔子中的藏紅花素在腸道內(nèi)的水解為西紅花酸，有研究顯示，西紅花酸可顯著抑制乙醛誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞增殖模型，降低Ⅰ型及Ⅲ型膠原的合成并通過調(diào)控肝星狀細(xì)胞Bax、Bcl－2 的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可以通過一系列協(xié)同適應(yīng)性反應(yīng)，使內(nèi)環(huán)境處于穩(wěn)定狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到缺氧、鈣平衡紊亂、氧化應(yīng)激或毒物反應(yīng)等刺激時(shí)，會影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊修飾蛋白質(zhì)的功能，導(dǎo)致未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)聚集，稱為ERS。研究發(fā)現(xiàn)，許多肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展過程與ERS 誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡均有密切關(guān)系。ERS 作為細(xì)胞對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力反應(yīng)的自我保護(hù)機(jī)制，具有重要意義，適度的ERS 可通過UPR 來減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)負(fù)荷，保護(hù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，而UPR 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的長時(shí)間積聚則會損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，細(xì)胞會以凋亡的形式消除受損細(xì)胞。

ATF6 是一種Ⅱ型跨膜感受蛋白，存在于真核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，是CREB/ATF 轉(zhuǎn)錄因子家族的一員。在非應(yīng)激狀態(tài)下，ATF6 以酶原的形式處于抑制狀態(tài)，在應(yīng)激狀態(tài)下時(shí)，激活的ATF6 在高爾基體上轉(zhuǎn)位后發(fā)生切割。之后，裂解的ATF6 移動到細(xì)胞核，作為一個(gè)活性轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)GRP78 蛋白的轉(zhuǎn)錄，使X－盒結(jié)合蛋白1（XBP1）與CHOP 等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)伴侶分子蛋白的表達(dá)增加，提高了細(xì)胞對UPR的處理能力[11]。GRP78 作為分子伴侶主要存在于真核生物中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，它與錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)和未組裝的復(fù)合物結(jié)合，并啟動負(fù)責(zé)UPR 調(diào)節(jié)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解（ERAD）[12－14]。在非應(yīng)激狀態(tài)下，GRP78與ATF6、PERK、IRE1 以非活性形式相結(jié)合，在細(xì)胞接觸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)累積的未折疊蛋白質(zhì)后，GRP78 被釋放出來，在消耗能量后促進(jìn)蛋白的正確折疊，與此同時(shí)，GRP78 過量表達(dá)可以減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子水平，減輕ERS，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[15－16]。非應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)CHOP 的含量極少，當(dāng)ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，活化的ATF6 在胞核內(nèi)與ERS 反應(yīng)元件結(jié)合，啟動CHOP 轉(zhuǎn)錄與表達(dá)并積聚于細(xì)胞核內(nèi)，作為轉(zhuǎn)錄因子，CHOP 能調(diào)節(jié)如Bcl－2、TRB3、GADD34 等許多促凋亡因子的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17－18]。

本研究結(jié)果顯示，與S 組比較，O 組肝細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)肝功能指標(biāo)及凋亡指數(shù)均高于S 組，O 組肝細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)ATF6、GRP78、CHOP 蛋白與mRNA 表達(dá)水平均高于S 組，提示阻塞性黃疸肝損傷中存在ERS 的激活，ERS 中的ATF6 信號通路及細(xì)胞凋亡途徑在阻塞性黃疸肝損傷細(xì)胞中被激活。與O 組比較，Y 組肝細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)肝功能指標(biāo)及調(diào)往指數(shù)均明顯降低，Y 組肝細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)ATF6、GRP78、CHOP 蛋白與mRNA 表達(dá)水平均低于O組，提示茵陳蒿湯含藥血清干預(yù)阻塞性黃疸肝損傷細(xì)胞模型后GRP78 表達(dá)下調(diào)，使ERS 得到一定程度緩解，茵陳蒿湯含藥血清一定程度上抑制了阻塞性黃疸肝損傷細(xì)胞中ATF6 的表達(dá)，從而降低了其對下游信號分子CHOP 的激活，減少了ERS 誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善阻塞性黃疸肝功能損傷。

綜上所述，ERS 中的ATF6 信號通路可能被激活并參與了阻塞性黃疸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡病理過程，茵陳蒿湯含藥血清可改善阻塞性黃疸細(xì)胞模型的肝功能情況，其機(jī)制可能與其下調(diào)ATF6、GRP78和CHOP 的表達(dá)，進(jìn)而緩解ERS 進(jìn)而抑制肝細(xì)胞凋亡相關(guān)。