王長亮,田文靜,黃景榮,計春燕,王 慧,趙 莉,孫 俊

(1.湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化內(nèi)科,湖北 武漢 430010;2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科,廣東 廣州 510120)

胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,病死率較高[1]。胃癌發(fā)病率在全球呈現(xiàn)增長趨勢,同時其發(fā)病年齡逐漸年輕化[2]。盡管胃癌的診斷和治療有了較大發(fā)展,但胃癌患者的5年生存率依然較低[3]。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)在人體細(xì)胞中廣泛表達(dá),通過直接或者間接與染色體、微小RNA(microRNA,miR)、蛋白結(jié)合,調(diào)控相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),在維持染色體穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用[4]。相關(guān)文獻(xiàn)[5-6]證實,甲狀腺癌、胸腺癌、淋巴瘤以及胃癌等組織中存在lncRNA的異常表達(dá),其通過影響各種分子信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)參與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展。lncRNA C16orf89是一個由582個堿基組成的長鏈非編碼RNA,其在胃癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)模式和功能尚不清楚。因此,本研究探討lncRNA C16orf89在胃癌中的表達(dá)模式,通過體外實驗分析過表達(dá)lncRNA C16orf89對胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的作用,通過生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)一步分析lncRNA C16orf89可能的下游機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞 胃癌細(xì)胞系BGC823、AGS、NCI-N87細(xì)胞(購自美國ATCC公司)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng),胃癌細(xì)胞系SGC7901、HS-746T和永生化胃上皮細(xì)胞GES-1細(xì)胞(購自美國ATCC公司)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),在37 ℃、5% CO2條件下加濕培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 胎牛血清(FBS)(批號:10100-147)購自美國Gibco公司;DMEM培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基(批號:GT65-165、GT65-128)購自日本TOYOBO公司;lncRNA C16orf89過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-lncRNA C16orf89、陰性對照質(zhì)粒pcDNA3-NC、miR-NC、miR-95-3p(批號:GNM25-113、GNM25-114、GNM25-115、GNM25-116)購自北京中杉金橋生物公司;噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒、實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒、雙熒光報告基因檢測試劑盒(批號:E6819、E1520、E1910)購自美國Promega公司;Lipofectamine 2000、雙熒光報告載體野生型pmirGLO-C16orf89-wt和突變型pmirGLO-C16orf89-mut(批號:11668019、17306001、17306002)購自美國Invitrogen公司;磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、細(xì)胞周期蛋白D1(CCDN1)、β-肌動蛋白(β-actin)、磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)抗體(批號:ab278545、ab38449、ab109268、ab230947、ab8226、ab267787)購自美國Abcam公司。

1.3 研究方法

1.3.1 數(shù)據(jù)庫分析:應(yīng)用基因表達(dá)譜交互分析(GEPIA)數(shù)據(jù)庫分析lncRNA C16orf89在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)。應(yīng)用Oncolnc數(shù)據(jù)庫在線分析胃癌患者總生存期和lncRNA C16orf89表達(dá)的相關(guān)性。通過檢索Starbase V3.0數(shù)據(jù)庫篩選可能與lncRNA C16orf89結(jié)合的miRNA。

1.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:將生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的AGS細(xì)胞接種于細(xì)胞板,在培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng),保證細(xì)胞匯合度達(dá)到90%。分別將陰性對照質(zhì)粒pcDNA3-NC和lncRNA C16orf89過表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3-lncRNA C16orf89轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞,根據(jù)Lipofectamine 2000試劑盒操作說明進(jìn)行操作,定義為NC組和lncRNA C16orf89組。

1.3.3 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測lncRNA C16orf89及miR-95-3p表達(dá):采用TRIzol試劑盒提取各個細(xì)胞系總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以U6或GAPDH作為內(nèi)參照,采用qRT-PCR檢測lncRNA C16orf89及miR-95-3p表達(dá)。GAPDH正向引物序列為5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’,反向引物序列為5’-GGCATGCACTGTGGTCATGAG-3’。lncRNA C16orf89正向引物序列為5’-CCCTCCACTACCTCAAGCTG-3’, 反向引物序列為5’-TTTCCAGCAAATAGGGCAAG-3’。miR-95-3p正向引物序列為5’-ACACTCCAGCTGGGTTCAACGGGTATTTAT-3’, 反向引物序列為5’-TGGTGTCGTGGAGGAGTCG-3’。以2-ΔΔCt計算目的基因相對表達(dá)量。

1.3.4 MTT法檢測AGS細(xì)胞增殖:以每200 μl即4×103個AGS細(xì)胞接種于96孔板。在AGS細(xì)胞貼壁后1、2、3、4、5 d時,分別在每孔中加36 μl(400 mg/L)MTT試劑,在37 ℃、5% CO2條件下加濕培養(yǎng)160 min。應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔在波長490 nm處的吸光度值。

1.3.5 Transwell實驗檢測AGS細(xì)胞侵襲:培養(yǎng)箱內(nèi)消化兩組AGS細(xì)胞,加入無血清培養(yǎng)基中和消化酶并調(diào)整細(xì)胞密度,以4×104個/孔接種于Transwell小室上腔。在Transwell小室下腔中加500 μl含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在37 ℃、5% CO2條件下加濕培養(yǎng)25 h。采用5%多聚甲醛固定,在0.2%結(jié)晶紫染液中染色。干燥處理后,在倒置顯微鏡選擇6個隨機(jī)視野計數(shù)。

1.3.6 雙熒光素酶報告基因分析lncRNA C16orf89靶基因:將雙熒光報告載體野生型pmirGLO-C16orf89-wt或突變型pmirGLO-C16orf89-mut和miR-NC或miR-95-3p共轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞,在37 ℃、5% CO2條件下加濕培養(yǎng)53 h。采用裂解液收集各組AGS細(xì)胞,通過雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析各組AGS細(xì)胞的相對熒光素酶活性,實驗重復(fù)4次。

1.3.7 Western blot檢測目的蛋白表達(dá):采用細(xì)胞裂解液提取兩組AGS細(xì)胞總蛋白,測定蛋白濃度后采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,通過4%牛血清白蛋白溶液封閉3 h,裁剪硝酸纖維素膜,加入一抗p-PI3K(1∶1000稀釋)、p-AKT(1∶2000稀釋)、β-actin(1∶5000稀釋)、p-mTOR(1∶2000稀釋)、PTEN(1∶3000稀釋)、CCDN1(1∶4000稀釋),低溫孵育13 h。加入二抗(1∶5000稀釋),室溫下反應(yīng)3.5 h。加入化學(xué)發(fā)光液,通過凝膠成像儀拍照。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果 GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,lncRNA C16orf89在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)(P<0.01)。Oncolnc數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示,與lncRNA C16orf89低表達(dá)胃癌患者相比,lncRNA C16orf89高表達(dá)的胃癌患者總生存期較長(P<0.01)。

2.2 胃癌細(xì)胞系及永生化胃上皮細(xì)胞中l(wèi)ncRNA C16orf89表達(dá)量比較 見圖1。qRT-PCR結(jié)果顯示,永生化胃上皮細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞系SGC7901、AGS、BGC823、HS-746T、NCI-N87中l(wèi)ncRNA C16orf89的表達(dá)量分別為0.99±0.13、0.39±0.08、0.17±0.05、0.58±0.12、0.71±0.04、0.64±0.09,胃癌細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA C16orf89表達(dá)量低于GES-1細(xì)胞,且AGS細(xì)胞中l(wèi)ncRNA C16orf89表達(dá)量最低(均P<0.01)。

注:與GES-1細(xì)胞比較,*P<0.01

2.3 lncRNA C16orf89過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率顯示,NC組和lncRNA C16orf89組AGS細(xì)胞lncRNA C16orf89表達(dá)量分別為0.17±0.07和1.01±0.25,結(jié)果提示lncRNA C16orf89過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后AGS細(xì)胞中l(wèi)ncRNA C16orf89表達(dá)量升高(P<0.01)。

2.4 過表達(dá)lncRNA C16orf89對AGS細(xì)胞增殖能力的影響 見圖2。MTT實驗結(jié)果顯示,與NC組比較,lncRNA C16orf89組AGS細(xì)胞從第2天起增殖能力明顯降低(均P<0.05),因此過表達(dá)lncRNA C16orf89可明顯降低AGS細(xì)胞的增殖能力。

注:與NC組比較,*P<0.05

2.5 過表達(dá)lncRNA C16orf89對AGS細(xì)胞侵襲能力的影響 見圖3。Transwell侵襲實驗顯示,NC組和lncRNA C16orf89組AGS細(xì)胞侵襲數(shù)分別為(140.30±30.31)個和(49.48±19.07)個。與NC組比較,lncRNA C16orf89組AGS細(xì)胞侵襲能力明顯下降(P<0.01)。

注:A圖為兩組細(xì)胞結(jié)晶紫染色結(jié)果(×100);B圖中,與NC組比較,*P<0.01

2.6 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫Starbase V3.0預(yù)測結(jié)果 Starbase V3.0預(yù)測結(jié)果顯示,miR-95-3p可能是lncRNA C16orf89的潛在靶基因,野生序列為“CCGUUGAA”,突變序列為“GGCAACUU”,見圖4。

圖4 lncRNA C16orf89與miR-95-3p的結(jié)合位點(diǎn)

2.7 雙熒光素酶報告載體實驗結(jié)果 見圖5。在AGS細(xì)胞中,過表達(dá)miR-95-3p明顯降低野生型lncRNA C16orf89-wt載體的相對熒光素酶活性(P<0.01),對突變型lncRNA C16orf89-mut載體的相對熒光素酶活性無明顯影響(P>0.05)。

注:與miR-NC比較,*P<0.01

2.8 過表達(dá)lncRNA C16orf89對miR-95-3p的調(diào)控作用 qRT-PCR結(jié)果顯示,NC組和lncRNA C16orf89組AGS細(xì)胞miR-95-3p相對表達(dá)量分別為6.54±0.89和1.02±0.48,因此過表達(dá)lncRNA C16orf89可明顯降低AGS細(xì)胞中miR-95-3p的表達(dá)(P<0.01)。

2.9 過表達(dá)lncRNA C16orf89對PI3K/AKT信號通路蛋白表達(dá)的影響 見圖6。Western blot結(jié)果顯示,與NC組比較,lncRNA C16orf89組PI3K/AKT信號通路蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、CCDN1表達(dá)量顯著降低,PTEN表達(dá)量顯著升高(均P<0.01)。

3 討 論

胃癌的發(fā)生和發(fā)展涉及多基因、多分子信號通路的調(diào)控,伴隨原癌基因的異常高表達(dá)和抑癌基因的異常低表達(dá)[7]。lncRNA在RNA的轉(zhuǎn)錄、加工和翻譯過程中具有重要功能,影響細(xì)胞的應(yīng)激、增殖、凋亡、自噬等過程[8-9]。研究[10-12]表明,特定lncRNA表達(dá)改變與胃癌的發(fā)生、演進(jìn)具有相關(guān)性,同時與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、大小、浸潤程度密切相關(guān)。文獻(xiàn)[13]報道,胃癌細(xì)胞系中l(wèi)ncRNA POT1-AS1高表達(dá),其表達(dá)水平與胃癌患者臨床病理學(xué)特征以及較短的無病生存期和總生存期有關(guān),lncRNA POT1-AS1通過海綿化miR-497-5p促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移。文獻(xiàn)[14]報道,lncRNA SNHG3在胃癌細(xì)胞系和組織中表達(dá)明顯增加,其表達(dá)上調(diào)與胃癌臨床分期、患者低生存率有關(guān),敲低lncRNA SNHG3可在體內(nèi)抑制異種移植胃癌的生長。lncRNA C16orf89基因定位于人16號染色體5060224-5065919區(qū)域,具有3個外顯子,但其在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮作用的分子機(jī)制尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn),lncRNA C16orf89在胃癌組織及胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)均顯著下調(diào)。與lncRNA C16orf89低表達(dá)的胃癌患者相比,lncRNA C16orf89高表達(dá)的胃癌患者總生存期較長。細(xì)胞功能學(xué)實驗顯示,過表達(dá)lncRNA C16orf89可在體外明顯降低AGS細(xì)胞的增殖和侵襲能力。以上結(jié)果提示,lncRNA C16orf89在胃癌的發(fā)生、演進(jìn)過程中可能發(fā)揮抑癌基因功能。文獻(xiàn)[15]報道,lncRNA發(fā)揮功能的主要機(jī)制是通過海綿吸附miRNA,從而競爭性結(jié)合miRNA,引起miRNA的表達(dá)下調(diào)。例如,lncRNA LET通過海綿吸附miR-548k抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移,并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。

本研究通過公共數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn),lncRNA C16orf89與miR-95-3p有潛在的結(jié)合位點(diǎn)。miR-95-3p在前列腺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤組織和細(xì)胞系中高表達(dá),其分布在細(xì)胞質(zhì)中,可明顯促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲,且在腫瘤進(jìn)程中扮演原癌基因,與腫瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[17-19]。miR-95-3p在順鉑抗性的胃癌組織和細(xì)胞系中高度表達(dá),其可有效促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲、致瘤能力,在胃癌細(xì)胞中發(fā)揮促癌基因作用[20]。雙熒光素酶報告基因檢測證明lncRNA C16orf89與miR-95-3p間存在結(jié)合作用。同時,本研究表明lncRNA C16orf89過表達(dá)顯著降低AGS細(xì)胞中miR-95-3p的表達(dá)水平。以上結(jié)果證實lncRNA C16orf89可以通過海綿吸附miR-95-3p發(fā)揮作用。PI3K/AKT信號通路能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移并抑制其分化,該信號通路的持續(xù)激活顯著促進(jìn)胃癌的發(fā)生和演進(jìn)。研究[20]證實,miR-95-3p能夠在胃癌細(xì)胞中直接靶向激活PI3K/AKT信號通路。本研究證明,lncRNA C16orf89競爭性結(jié)合miR-95-3p后,PI3K/AKT信號通路蛋白表達(dá)量降低,亦證實了lncRNA C16orf89/miR-95-3p調(diào)控軸的存在。

綜上所述,lncRNA C16orf89在胃癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào),過表達(dá)lncRNA C16orf89能夠抑制胃癌AGS細(xì)胞增殖及侵襲,其分子機(jī)制是通過靶向抑制miR-95-3p表達(dá)干擾PI3K/AKT信號通路的持續(xù)激活。lncRNA C16orf89異常表達(dá)可能參與影響胃癌患者的惡性進(jìn)程。