董 勇,程 序,梁 晗,華 靜,譚莉霞,王航宇,閆春曉,魏書堂

(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科,河南 開封 475100)

原發(fā)性肝癌作為惡性腫瘤,其發(fā)病率在全世界腫瘤中排第5位[1]。中國是肝癌高發(fā)地區(qū),臨床發(fā)病率有持續(xù)上升趨勢(shì)。目前盡管肝癌的治療措施已取得顯著進(jìn)步,但患者3年生存期仍未獲得顯著延長[2]。肝癌的發(fā)展是多因素造成的結(jié)果。因此,尋找參與肝癌發(fā)生、發(fā)展的生物分子標(biāo)志物在臨床上有重要意義。角蛋白屬于中間絲蛋白家族成員,大量表達(dá)于上皮細(xì)胞,且與細(xì)胞分化密切相關(guān)[3]。杭群等[4]研究顯示,角蛋白23(Keratin 23,KRT23)在胃癌患者癌組織中高表達(dá),其表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期緊密相關(guān)。KRT23是一種應(yīng)激誘導(dǎo)蛋白,其表達(dá)水平與肝病的嚴(yán)重程度相關(guān)[5]。但目前KRT23在肝癌中的作用研究尚不清楚。因此,本研究探討肝癌患者癌組織中KRT23表達(dá)變化,并分析其與肝癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系,期望為評(píng)估肝癌預(yù)后提供有價(jià)值的參考依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2018年1月至2019年6月就診于河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院并接受手術(shù)治療的肝癌患者86例,其中男性48例,女性38例;年齡38～80歲,平均(60.24±10.84)歲。病例納入標(biāo)準(zhǔn):符合《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》[6]中的病理診斷標(biāo)準(zhǔn);術(shù)前未進(jìn)行全身化療、放療;簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):腎功能障礙;合并急慢性炎癥疾病、免疫系統(tǒng)疾病;患其他惡性腫瘤、全身感染性疾病。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

1.2 標(biāo)本收集 收集所有患者的肝癌組織及癌旁正常組織(距離癌組織5 cm以上),一份迅速置于液氮冷凍后備用,另一份制作成石蠟標(biāo)本。收集的肝癌組織及癌旁組織均經(jīng)病理檢查證實(shí)。

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)KRT23表達(dá)水平 將肝癌組織和癌旁正常組織的石蠟標(biāo)本進(jìn)行切片(厚度約3 μm)、烘干。將切片進(jìn)行脫蠟,用枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)。采用3% H2O2阻斷浸泡5 min,再?zèng)_洗。將KRT23單克隆抗體(貨號(hào):ab156569,Abcam公司)滴加于組織上,4 ℃冰箱過夜。應(yīng)用二抗(貨號(hào):ab6721,Abcam公司)室溫孵育1 h,PBS液沖洗。DAB顯色5 min,蘇木素復(fù)染2 min,再分化、返藍(lán)、脫水、封片,于顯微鏡下觀察切片。由2名以上高年資病理醫(yī)師獨(dú)立讀片評(píng)定,結(jié)果不一致時(shí)共同商議。每例標(biāo)本隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野(200倍),計(jì)數(shù)視野中陽性細(xì)胞所占百分比,染色強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]。

1.4 蛋白免疫印跡檢測(cè)KRT23蛋白水平 提取組織中總蛋白,用BCA蛋白定量試劑盒(貨號(hào):AWB0104b,長沙艾碧維生物科技有限公司)對(duì)總蛋白進(jìn)行定量分析。取50 μg總蛋白用SDS-PAGE進(jìn)行電泳以分離蛋白,然后進(jìn)行濕法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上,在5% BSA中封閉1 h,加入兔抗人KRT23(貨號(hào):ab156569,Abcam公司)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(貨號(hào):ab181602,Abcam公司,稀釋比例1∶1000)4 ℃過夜,再加入二抗(貨號(hào):ab6721,Abcam公司,稀釋比例1∶500)37 ℃孵育1 h,ECL顯色后觀察。以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算肝癌組織或癌旁組織中KRT23蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 術(shù)后隨訪 收集肝癌患者術(shù)后隨訪門診記錄或復(fù)查記錄,最長隨訪時(shí)間為3年,隨訪至2022年6月,記錄患者生存時(shí)間?？偵嫫跒殚_始治療至死亡或失訪的時(shí)間。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌組織與癌旁正常組織KRT23相對(duì)表達(dá)水平比較 蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,癌旁正常組織KRT23相對(duì)表達(dá)水平為1.03±0.13,肝癌組織KRT23相對(duì)表達(dá)水平為1.36±0.18,后者高于前者(t=13.783,P<0.05)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示,肝癌組織及癌旁正常組織KRT23陽性表達(dá)率分別為80.23%(69/86)和29.07%(25/86),前者高于后者(χ2=45.416,P<0.05)。

圖1 肝癌組織KRT23陰性(左)

2.2 KRT23表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。86例患者中,TNM分期(美國腫瘤聯(lián)合委員會(huì)AJCC 2018)Ⅰ-Ⅱ期34例,Ⅲ期52例;甲胎蛋白(AFP)<400 μg/L 54例,≥400 μg/L 32例;乙肝表面抗原(HBsAg)陽性66例,陰性20例;Child-Pugh分級(jí)中,A級(jí)76例,B級(jí)10例。分析結(jié)果顯示,Ⅲ期肝癌患者肝癌組織KRT23陽性表達(dá)水平顯著高于Ⅰ-Ⅱ期肝癌患者(P<0.05)。

表1 KRT23表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.3 影響肝癌患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析 見表2。以肝癌患者3年預(yù)后為因變量(預(yù)后良好=0,預(yù)后不良=1),將年齡(<60歲=0,≥60歲=1)、性別(女=0,男=1)、AFP(<400 μg/L=0,≥400 μg/L=1)、TNM分期(Ⅰ-Ⅱ期=0,Ⅲ期=1)、乙肝表面抗原(陰性=0,陽性=1)、Child-Pugh分級(jí)(A級(jí)=0,B級(jí)=1)、KRT23表達(dá)水平(陰性=0,陽性=1)作為自變量進(jìn)行Cox回歸分析。單因素Cox回歸分析表明,TNM分期、KRT23均是影響肝癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素(均P<0.05)。多因素Cox回歸分析表明,TNM分期Ⅲ期、KRT23陽性是肝癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05)。

表2 影響肝癌患者預(yù)后危險(xiǎn)因素Cox回歸分析

2.4 肝癌組織中KRT23表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 見圖2。KRT23陰性患者3年累積生存率為64.70%,KRT23陽性患者3年累積生存率為29.00%,后者低于前者(Log-Rank χ2=6.899,P=0.009)。

圖2 肝癌患者3年隨訪期間Kaplan-Meier生存曲線

3 討 論

肝癌是我國常見腫瘤[8]。目前,手術(shù)切除是延長肝癌患者生存期的有效辦法,但大部分肝癌患者確診時(shí)已處于中晚期,能夠手術(shù)治療者不到15%[9]。臨床研究[10-11]發(fā)現(xiàn),肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)率也較高,預(yù)后較差。因此,深入探究肝癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制具有重要的臨床意義。

中間絲蛋白家族是細(xì)胞骨架的重要組成部分,由中間絲蛋白組成的細(xì)胞骨架支撐整個(gè)細(xì)胞。中間絲蛋白家族有5種主要類型,Ⅰ-Ⅳ型是構(gòu)成細(xì)胞質(zhì)的蛋白,Ⅴ型是構(gòu)成細(xì)胞核骨架的蛋白[12]。角蛋白是中間絲蛋白家族主要的成員,包含Ⅰ和Ⅱ型[13]。角蛋白是中間鏈接蛋白與微絲蛋白,均表達(dá)于上皮細(xì)胞中。在機(jī)體細(xì)胞發(fā)生異常凋亡時(shí),角蛋白表現(xiàn)出高度活性。角蛋白可直接參與細(xì)胞有絲分裂、分化及凋亡等過程,可調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動(dòng)力、蛋白質(zhì)合成及膜運(yùn)輸過程[14]。角蛋白侵襲能力強(qiáng),在癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移中具有關(guān)鍵作用。有研究[14-15]證實(shí),肝癌組織中角蛋白19、角蛋白7表達(dá)高的患者預(yù)后更差,且角蛋白磷酸化后引起結(jié)構(gòu)重塑,可增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的侵襲能力。肝癌細(xì)胞體內(nèi)存在侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。

研究[17]顯示,角蛋白在細(xì)胞膜屏障功能中起重要作用。據(jù)報(bào)道,角蛋白的異常表達(dá)與癌細(xì)胞的侵襲和遷移有關(guān)[18]。KRT23是角蛋白基因家族中一個(gè)新的Ⅰ型成員。研究[19]證實(shí),KRT23通過TGF-β/Smad信號(hào)通路調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,進(jìn)而調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞遷移,體外實(shí)驗(yàn)表明KRT23的敲低抑制了卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲。Kim等[20]研究證實(shí),過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARA)是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子和脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵介質(zhì),慢性PPARA激活會(huì)導(dǎo)致小鼠的肝細(xì)胞增殖、肝腫大,并最終導(dǎo)致肝細(xì)胞癌,PPARA激活提高了瘤細(xì)胞病毒癌基因(MYC)表達(dá),MYC又增強(qiáng)了參與癌細(xì)胞增殖的相關(guān)基因KRT23的表達(dá)。研究[21]報(bào)道,在KRT23受到組蛋白脫乙?；敢种苿┱T導(dǎo)轉(zhuǎn)錄增加的過程中,細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p2lWAF1/CIPI起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,證明KRT23參與細(xì)胞分化。研究[22]顯示,KRT23過表達(dá)上調(diào)了結(jié)腸癌細(xì)胞中端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)活性及hTERT啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光素酶和端粒酶活性的升高,而結(jié)腸癌細(xì)胞中KRT23的敲低抑制了與細(xì)胞周期和DNA修復(fù)相關(guān)的關(guān)鍵分子的表達(dá),從而阻止了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。本研究蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示,肝癌組織中KRT23相對(duì)表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織,提示KRT23可能影響肝癌的發(fā)生。

本研究顯示,肝癌組織中KRT23陽性表達(dá)率顯著高于癌旁正常組織,且Ⅲ期肝癌患者肝癌組織中KRT23表達(dá)水平顯著高于Ⅰ-Ⅱ期肝癌患者,提示KRT23參與肝癌的發(fā)生與發(fā)展。角蛋白影響腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程,腫瘤組織中存在角蛋白裂解片段或全長片段,提示癌癥患者存在較差預(yù)后[18]。本研究預(yù)后分析顯示,KRT23陰性患者3年累積生存率高于KRT23陽性患者,提示KRT23可能影響肝癌患者預(yù)后,表明KRT23陽性可能對(duì)肝癌患者預(yù)后不良的預(yù)測(cè)有貢獻(xiàn)。本研究還發(fā)現(xiàn),KRT23陽性是肝癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述,肝癌組織KRT23呈高表達(dá),且與肝癌患者預(yù)后不良有關(guān),有望成為預(yù)測(cè)肝癌患者預(yù)后不良的生物學(xué)指標(biāo)。