李 亮,蔣曉帆,李 俠,張 嬋,余 良

(空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院,陜西 西安 710032)

近年來,腦血管疾病患病率逐年上升,已成為全球60歲以上人口死亡的第二大原因,其中缺血性腦卒中約占60%～80%[1]。目前臨床尚缺乏有效的治療手段,患者發(fā)病后常遺留神經(jīng)功能障礙,對其身心健康和生活質(zhì)量造成嚴重影響[2]。氧化應(yīng)激反應(yīng)在缺血性腦病發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用,腦組織缺血缺氧后,局部自由基顯著增多,而抗氧化酶的功能降低,引起腦血管和神經(jīng)細胞損傷,此時通過調(diào)動機體內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)清除增多的自由基可有效抑制腦組織損傷進展[3]。肉蓯蓉苯乙醇苷是從肉蓯蓉中提取的一類苯乙醇苷類化合物,具有較強的抗氧化活性,研究[4]發(fā)現(xiàn)其可通過抑制低氧下腦組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)修復腦損傷。研究[5-6]顯示,糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase 3β,GSK3β)/核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor-E2-related factor 2,Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant response element,ARE)信號通路與缺血性腦卒中的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切,通過靶向調(diào)節(jié)該信號通路可有效減輕腦組織氧化應(yīng)激損傷?；诖?本實驗通過誘導腦中動脈梗死(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型探究肉蓯蓉苯乙醇苷干預(yù)MCAO大鼠氧化損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠100只,購于空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心[合格證編號:SCKX(陜)2019-001號],體重(200±20)g。實驗前1周于SPF級動物房適應(yīng)性飼養(yǎng),溫度保持(23±3)℃,相對濕度40%～70%。

1.2 主要試劑 肉蓯蓉苯乙醇苷(批號:20210701,九江華漢生物科技有限公司);尼莫地平(批號:220814,山東新華制藥公司);2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)試劑(北京索萊寶科技公司);大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)ELISA試劑盒(南京森貝伽生物科技公司);Nissl染色試劑盒(上海生工生物工程公司);抗-GSK3β、Nrf2、血紅素氧化酶-1(HO-1)、GAPDH(Santa Crutz公司);GSK3β、Nrf2、HO-1、GAPDH基因引物(上海捷瑞生物工程公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組與干預(yù):動物稱重后按體重高低依次分籠,隨機分為假手術(shù)組、模型組、陽性對照組、肉蓯蓉苯乙醇苷低劑量組和肉蓯蓉苯乙醇苷高劑量組,每組20只。通過大腦中動脈線栓法制備MCAO模型[7]:大鼠腹腔注射水合氯醛(按400 mg/kg)麻醉后,于頸正中部做一切口,并沿切口分離暴露左頸總動脈及頸內(nèi)、外動脈,結(jié)扎頸總、頸外動脈,在頸總動脈近分叉處放置一根手術(shù)線,隨后于分叉處剪一切口,從切口處插入線栓以阻斷中動脈血供。線栓于頸總動脈插入頸內(nèi)動脈,前進約18～20 mm可感到阻力,隨后逐層縫合切口,假手術(shù)組僅分離上述血管而不予結(jié)扎。缺血再灌2 h后,陽性對照組給予尼莫地平(12 mg/kg);肉蓯蓉苯乙醇苷低、高劑量組分別給予肉蓯蓉苯乙醇苷150、300 mg/kg,每日灌胃1次,共14 d;假手術(shù)組及模型組給予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.3.2 神經(jīng)功能評定:分別于造模及治療結(jié)束后評價大鼠神經(jīng)功能缺損情況[8]。1～4分為實驗納入標準,將不符合模型評定標準的大鼠剔除。0分指活動無異常,未見肢體神經(jīng)功能損傷表現(xiàn);1分指肢體神經(jīng)功能輕微缺損,提尾懸吊時不能充分伸展缺血側(cè)前肢;2分指肢體神經(jīng)功能中度缺損,爬行時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈、追尾;3分指肢體神經(jīng)功能重度缺損,行走時向?qū)?cè)傾斜;4分指意識喪失,不能自發(fā)行走。

1.3.3 腦含水量檢測:大鼠按400 mg/kg劑量腹腔注射水合氯醛后斷頭取腦,采用電子分析天平立即稱取腦組織濕重,之后放入60 ℃烘箱烘烤72 h,再次稱重,反復稱至2次重量差<0.3 mg,得到腦組織干重[9]。根據(jù)干濕重之比,按(濕重-干重)/濕重×100%計算腦含水量。

1.3.4 腦梗死占比檢測:大鼠按400 mg/kg劑量腹腔注射水合氯醛后斷頭取腦,將腦組織于-20 ℃速凍20 min左右取出,放于切片板上間隔2 mm做連續(xù)冠狀切片,共計5片。切片放入2% TTC溶液,避光均勻染色30 min(37 ℃)。取出組織,PBS沖洗3次后用4%多聚甲醛固定24 h。正常組織染色后為紅色,蒼白及未著色區(qū)即為腦梗死區(qū)。染色結(jié)束后,整齊排列各組大腦切片并拍照,采用Image Pro 軟件處理圖像,測算每個腦片梗死面積。腦梗死占比=腦梗死面積/腦切片面積×100%。

1.3.5 海馬神經(jīng)元形態(tài)觀察:大鼠按400 mg/kg劑量腹腔注射水合氯醛后,快速開胸暴露心臟,取輸液針從左心進針,使針尖穿入左心室,隨即找準主動脈弓,穿入主動脈,緩慢注射0.9%氯化鈉溶液后灌注PBS固定液(含4%多聚甲醛),1 h后斷頭取腦并于4%多聚甲醛中4 ℃固定72 h。分離海馬組織石蠟切片(5 μm厚)并脫蠟,乙醇梯度脫水,行Nissl染色后封片,顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)。

1.3.6 血清MDA、SOD、GSH-Px水平檢測:各組大鼠于治療結(jié)束后經(jīng)腹主動脈采血,3000 r/min離心分離血清,分裝保存于-20 ℃冰箱備用。采用ELISA法檢測血清中SOD、GSH-Px、MDA水平。血清臨用前置于室溫平衡1 h,3000 r/min 離心20 min后吸取上清,分別設(shè)空白孔、標準孔、樣品孔,樣品孔加樣品稀釋劑40 μl、血清樣品10 μl及辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗100 μl,37 ℃恒溫箱溫育30 min。經(jīng)洗滌后加入顯色液,37 ℃避光溫育15 min,加終止液50 μl,酶標檢測儀于450 nm處測定各孔溶液OD值,按標準孔OD值繪制標準曲線,代入各樣本OD值得出SOD、GSH-Px、MDA的水平。

1.3.7 海馬組織GSK3β、Nrf2、HO-1蛋白水平測定:大鼠按400 mg/kg劑量腹腔注射水合氯醛后斷頭取腦,取海馬組織,加入裂解液于冰上裂解30 min。將裂解液移至離心管,4 ℃下以12000 r/min離心5 min提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度,將蛋白樣品上樣至SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi),電泳、轉(zhuǎn)膜后加入5% BSA于搖床上室溫封閉2 h,加入稀釋好的一抗(1∶1000)4 ℃過夜。一抗回收后TBST洗滌5～10 min,吸盡洗滌液后立即加入稀釋好的二抗(1∶5000),室溫孵育1 h,TBST洗滌5～10 min。ECL顯影,凝膠成像系統(tǒng)曝光后用Image J軟件分別計算GSK3β、Nrf2、HO-1與GAPDH的灰度值比值,得出蛋白相對表達量。

1.3.8 海馬組織GSK3β、Nrf2、HO-1 mRNA水平測定:大鼠按400 mg/kg劑量腹腔注射水合氯醛后斷頭取腦。采用TRIzol法提取RNA:取海馬組織100 mg,加入TRIzol試劑1 ml,勻漿器研磨后裂解 10 min,提取總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄,再按PCR試劑盒進行擴增,具體參數(shù):95 ℃變性5 s,60 ℃退火34 s,擴增40個循環(huán)。結(jié)果采用2-ΔΔCt法分析,以GAPDH為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1 五組大鼠神經(jīng)功能評分及腦含水量比較 見表2。假手術(shù)組未見肢體神經(jīng)功能損傷。模型組神經(jīng)功能評分及腦組織含水量較假手術(shù)組明顯升高(均P<0.05)。與模型組比較,肉蓯蓉苯乙醇苷低、高劑量組大鼠經(jīng)治療后神經(jīng)功能缺損情況顯著改善,神經(jīng)行為學評分、腦組織含水量較模型組明顯降低(均P<0.05)。

表2 五組大鼠神經(jīng)功能評分及腦組織含水量比較

2.2 五組大鼠腦梗死占比比較 見圖1。假手術(shù)組腦組織未見梗死灶,模型組、陽性對照組及肉蓯蓉苯乙醇苷低、高劑量組腦組織出現(xiàn)不同程度蒼白色損傷灶。模型組腦梗死占比較假手術(shù)組明顯增多(P<0.05)。與模型組比較,肉蓯蓉苯乙醇苷低、高劑量組腦梗死占比明顯縮小(均P<0.05)。

注：A為假手術(shù)組,B為模型組,C為陽性對照組,D為肉蓯蓉苯乙醇苷低劑量組,E為肉蓯蓉苯乙醇苷高劑量組。與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

2.3 五組大鼠海馬組織神經(jīng)元形態(tài)變化 見圖2。假手術(shù)組海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,細胞核清晰,尼氏小體豐富,呈藍色,細胞核周圍排列整齊。模型組細胞損傷明顯,腫脹變性,結(jié)構(gòu)紊亂,尼氏小體數(shù)量減少。與模型組比較,肉蓯蓉苯乙醇苷低、高劑量組給藥治療后神經(jīng)細胞形態(tài)改善,尼氏小體數(shù)量增多,細胞排列逐漸恢復規(guī)律。

注:A為假手術(shù)組,B為模型組,C為陽性對照組,D為肉蓯蓉苯乙醇苷低劑量組,E為肉蓯蓉苯乙醇苷高劑量組

注：A為假手術(shù)組,B為模型組,C為陽性對照組,D為肉蓯蓉苯乙醇苷低劑量組,E為肉蓯蓉苯乙醇苷高劑量。與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05

2.4 五組大鼠血清SOD、GSH-Px、MDA水平比較 見表3。模型組與假手術(shù)組比較,血清SOD、GSH-Px活性明顯降低,MDA含量顯著增高(均P<0.05)。與模型組比較,肉蓯蓉苯乙醇苷低、高劑量組血清SOD、GSH-Px活性升高,MDA含量下降(均P<0.05)。

表3 五組大鼠血清SOD、GSH-Px、MDA水平比較

2.5 五組大鼠海馬組織GSK3β、Nrf2、HO-1蛋白表達比較 見圖 3。模型組與假手術(shù)組比較, GSK3β蛋白表達增多,Nrf2、HO-1蛋白表達減少(均P<0.05)。肉蓯蓉苯乙醇苷低、高劑量組海馬組織GSK3β蛋白表達較模型組下調(diào),Nrf2、HO-1蛋白表達上調(diào)(均P<0.05)。

2.6 各組大鼠海馬組織GSK3β、Nrf2、HO-1 mRNA表達比較 見表4。模型組與假手術(shù)組比較,海馬組織GSK3β mRNA表達明顯增多,Nrf2、HO-1 mRNA表達顯著減少(均P<0.05)。肉蓯蓉苯乙醇苷低、高劑量組海馬組織GSK3β mRNA表達較模型組顯著減少,Nrf2、HO-1 mRNA表達則明顯增多(均P<0.05)。

表4 各組大鼠海馬組織GSK3β、Nrf2、HO-1 mRNA表達比較

3 討 論

缺血性腦卒中病理過程較為復雜,發(fā)病機制涉及免疫炎癥、自由基損傷、興奮性氨基酸毒性等多個環(huán)節(jié)[10]。大腦是對缺氧最為敏感的器官,缺血、缺氧狀態(tài)可對腦功能造成極大損害。以往研究[11]表明,氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的活性氧在腦缺血后神經(jīng)細胞損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此,有效激活機體內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng),抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)是防治腦缺血損傷的一個重要策略。

Nrf2是調(diào)節(jié)機體多種抗氧化物質(zhì)和保護性酶類表達的核心轉(zhuǎn)錄因子[12]。在機體正常狀況下,其與細胞質(zhì)接頭蛋白(Keap-1)結(jié)合于細胞漿而保持非活性狀態(tài),機體的氧化應(yīng)激反應(yīng)可促使Nrf2與Keap-1解偶連,Nrf2轉(zhuǎn)入胞核內(nèi)與ARE特異性結(jié)合,并促進其下游HO-1等抗氧化蛋白的表達[13]。早期研究[14]認為,Nrf2表達水平主要受Keap-1的調(diào)控。而近年研究[15]證實,Nrf2水平可受到GSK3β等不依賴于Keap-1的調(diào)控方式調(diào)節(jié)。GSK3β具有多種生物學功能,在腦缺血模型中應(yīng)用GSK3β抑制劑處理可達到保護神經(jīng)細胞功能、減輕缺血缺氧損傷的目的[16]。劉遠玲[17]在MCAO腦缺血模型中抑制GSK3β活性后,總Nrf2和核內(nèi)Nrf2的表達量均明顯增加,同時升高了其下游抗氧化物HO-1和醌氧化還原酶1的表達水平,減輕了MCAO氧化應(yīng)激損傷,證實了GSK3β在腦缺血中對Nrf2活性的負性調(diào)控作用。

肉蓯蓉苯乙醇苷是從肉蓯蓉中提取分離的一類苯乙醇苷類化合物?，F(xiàn)代藥理研究[18]表明,苯乙醇苷類化合物普遍具有抗氧化活性和神經(jīng)保護功能,可用于氧化應(yīng)激所致神經(jīng)退行性疾病的防治。李剛等[19]研究發(fā)現(xiàn),肉蓯蓉苯乙醇苷干預(yù)可減輕大鼠精子膜脂質(zhì)過氧化損傷,保護其結(jié)構(gòu)和功能。駱新等[20]報道,肉蓯蓉苯乙醇苷可有效改善低氧引起的大鼠腦組織水腫,減輕組織氧化損傷,提示肉蓯蓉苯乙醇苷對腦組織損傷的修復作用可能與其抗氧化能力相關(guān)。本實驗采用SD大鼠制備MCAO模型,給予肉蓯蓉苯乙醇苷連續(xù)灌胃治療14 d,考察肉蓯蓉苯乙醇苷對腦缺血的神經(jīng)保護作用。結(jié)果表明,肉蓯蓉苯乙醇苷灌胃14 d后能夠有效恢復MCAO大鼠神經(jīng)功能,降低腦組織含水量,減輕腦組織梗死后海馬神經(jīng)元的損傷,提示肉蓯蓉苯乙醇苷對MCAO大鼠具有明顯良好的神經(jīng)保護作用。

SOD和GSH-Px水平可反映機體清除自由基能力[21]。MDA含量可反映脂質(zhì)過氧化程度[22]。通過ELISA檢測大鼠血清SOD、GSH-Px和MDA的水平可見,模型組血清SOD、GSH-Px水平較假手術(shù)組顯著降低,MDA含量明顯升高,肉蓯蓉苯乙醇苷灌胃治療后明顯升高了SOD、GSH-Px水平,降低了MDA含量,提示MCAO大鼠存在自由基過剩現(xiàn)象,而應(yīng)用肉蓯蓉苯乙醇苷可改善MCAO造成的自由基過剩和脂質(zhì)過氧化。進一步探究其對GSK3β/Nrf2/ARE通路的作用發(fā)現(xiàn),模型組海馬組織GSK3β蛋白和mRNA表達量較假手術(shù)組明顯增多,Nrf2、HO-1蛋白和mRNA表達明顯減少,肉蓯蓉苯乙醇苷干預(yù)后明顯下調(diào)了海馬組織GSK3β表達水平,同時上調(diào)了Nrf2、HO-1表達。通過以上結(jié)果可初步得出,肉蓯蓉苯乙醇苷對MCAO大鼠的抗氧化損傷作用可能與調(diào)節(jié)GSK3β/Nrf2/ARE信號通路相關(guān)蛋白的表達相關(guān)。

綜上所述,肉蓯蓉苯乙醇苷可有效保護MCAO大鼠腦組織損傷,提高神經(jīng)功能及抗氧化能力,其機制可能與調(diào)節(jié)GSK3β/Nrf2/ARE信號通路活化、激活抗氧化系統(tǒng)相關(guān)。